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Chemistry

CN-GELFrEE - クリア天然ゲル溶出液フラクションエントラップメント電気泳動

doi: 10.3791/53597 Published: February 29, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

タンパク質複合体は、重要な細胞機能の配列を実行します。それらの非共有結合性相互作用とダイナミクスを解明することは、生物学的システムにおける複合体の役割を理解するための最も重要です。生体分子集合体の直接的な特徴付けは近年ますます重要になってきている一方で、質量分析などの下流の分析技術、と互換性のあるネイティブの分別技術は、さらに、これらの研究を拡張するために必要です。それにもかかわらず、フィールドは、天然タンパク質のアセンブリのための高スループット、広範囲、高回収分離方式を欠いています。ここでは、非共有結合タンパク質アセンブリのための新規の分離様式である明確なネイティブゲル溶出液画分を捕捉電気泳動(CN-GELFrEE)を、提示します。 CN-GELFrEE分離性能は、マウス心臓から抽出された分画複合体によって実証されました。画分を2時間かけて収集し、〜30から500 kDaのに至るまで分離したバンドを表示されていました。詐欺分子量の帯域幅を増加させるの一貫したパ​​ターンは、各測距〜100 kDaで観察されました。また、SDS-PAGEを介して天然画分のその後の再分析は、分子量は、タンパク質複合体の変性と一致するシフトを示しました。したがって、CN-GELFrEE下流タンパク質分析と互換性のある画分を提供する、大規模な分子量範囲のタンパク質複合体の高分解能かつ高回収ネイティブ分離を実行する能力を提供することが証明されました。

Introduction

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細胞内で起こって生物学的プロセスの大部分はタンパク質の集合体ではなく、単一のタンパク質1によって行われると考えられています。その結果、細胞内のタンパク質サブユニットの特定の生物学的役割を解明するためには、複合体2中の他のタンパク質またはリガンドとのその構造的な相互作用を理解することが必要です。しかし、ネイティブのタンパク質を研究し、その非共有結合性相互作用および活性を維持する、困難なままです。天然タンパク質の研究の欠点の一つは、様々な下流のタンパク質解析技術と互換性のある適切な天然の分離技術です。そのため、生体分子の非共有結合アセンブリを特徴付けることが可能な分離技術の最近の関心が急激に3に増加しています。

タンパク質分離技術は、生化学、生物物理学および種々の他の研究に不可欠です。現在のネイティブ分離技術はintrinsiを持っていますこのような低解像度、低スループット、降水量の損失、および初期試料の大量の要件として下流の分析、との互換性を減らすCの欠乏。タンデムアフィニティー精製は、一般に、タンパク質相互作用の研究のために使用されるが、それはハイスループット分析4と互換性があることが原因と、各タンパク質標的に対して別々に行わなければなりません。サイズ排除クロマトグラフィー5、全てが天然の分離を提供するが、本質的に低解像度化技術であり、高い初期サンプル量を必要としているイオンアフィニティークロマトグラフィー5及び密度勾配分離6と選択的沈殿。

あるいは、ブルーネイティブ(BN)及びクリアネイティブ(CN)PAGE(1-Dのいずれかまたは2-D)のようなゲルベースの​​技術は、高分解能の分離を示します。また、上記の他の技術とは対照的、両方のネイティブPAGE分離は、溶解性と幅広いRの天然のコンフォメーションを維持します疎水性タンパク質を含む巨大分子種のアンジュ。この機能は、さらに、これらの方法7,8が到達したプロテオームカバレッジを拡大し、CNおよびBN-PAGEの間で異なる化学的性質により達成されます。 CN-PAGEは、一般的にBN-PAGEでクーマシーブルー色素を交換し、キャリア分子としてソフトの荷電界面活性剤に依存しています。より高解像度に関連付けられているものの、BN-PAGEは、このような分離されたタンパク質8およびクマシー分子付加体形成における減少した酵素活性、後者の下流MSに大幅に不利である9を分析するなどの注意点があります。両方のこれらの方法は、しかしながら、伝統による染色およびゲル抽出の制限7に低い回収率および狭いプロテオームカバー率と関連しています。

変性したタンパク質の研究のために、高タンパク質回収率で高解像度の分別を行いながら、高分子の溶解性を維持し、それをdと互換性のあるいくつかの技術があります分離後、タンパク質分析技術をiverse。ゲル溶出液フラクションエントラップメント電気泳動(GELFrEE)は、すべてのこれらの特性に合わせ分別技術の一つです。この方法は、主に、それが迅速かつ汎用性であることを示し、ハイスループットトップダウンプロテオミクス研究に適用されます。 GELFrEEでは、タンパク質は変性され、管状のゲルマトリックスを介して、分子量に基づく分離の気孔率は、サンプルの要件および所望の分別結果に基づいて変更することができます。画分は、このように、高解像度を維持しながら、SDS-PAGEに関連付けられた回復の制約を低減する、液相で溶出します。画分のアリコートを、次いで、分子量帯域幅の選択11のための1次元PAGEによって分析することができます。ネイティブの分離技術でGELFrEEに関連する利点に対する高い需要があります。本明細書に記載の方法は、クリアネイティブGELFrEE(CN-GELFrEE)は、GELFrEEのネイティブ適応したものです。広幅sとの互換性を保つために、それらの天然の状態で巨大分子のpectrum、この方法は、ソフトCN-PAGE化学に関するだけでなく、不連続なゲル系9に存在する気孔率との間に過酷な遷移を排除することにより、タンパク質沈殿を低減し、気孔率勾配分離、上だけでなく、依存しています。マウスの心臓から抽出したタンパク質複合体を分画するために適用した場合、溶出画分は、高い回収率を表示し、広範囲の分子量の高分解能分離が得られました。さらに、得られた画分は、最下流の生化学的と互換性があり、生物物理学的タンパク質が分析します。

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Protocol

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注:このビデオプロトコルは、関連出版物9に基づいています。このプロトコルで説明されているすべての手順を実行するために必要な特定の試薬、材料および機器は、材料のセクションに記載されています。すべての必要な溶液の調製のためのレシピ情報を表1に箇条書きされています。

1.グラデーションチューブゲルの注ぎます

  1. 鋳造システムの組み立て
    1. 火炎加熱されたかみそりの刃またはメスを使用して、分配チップの上部から10cmの直交部分に沿って20ミリリットルの血清学的ピペットをカット。切断面が滑らかであることを確認してください。 (チップ付き)底部片を保持し、トップの部分を破棄します。支持スタンドに垂直に(円錐形の先端を下に向けて)底ピペットピースをクランプします。
      注意:火傷を避けるために適切なハンドルまたはプライヤーを使用し、加熱されたブレードの金属に触れないでください。
    2. フレキシブルチューブ3センチカットし、それを上に延伸することにより、カットピペットに接続分配先端。チューブのもう一方の端に流量制御弁を接続します。
    3. チューブの一部を使用して、勾配ミキサーの分配チップにバルブの底にリンクします。開放弁を保管してください。
    4. マグネチックスターラーの上に勾配のミキサーを設定します。混合チャンバー内部の磁気バーを配置します。
    5. ゲルが重力によって注がれるのをピペット片の最上部よりも高い5〜10センチメートルができるようにグラデーションミキサーの分配チップを置きます。
    6. 脱イオン水で漏れのためのシステムをテストします。漏れが見つからない場合は、続行する前に内部の空気を吹き付けることにより、システムを乾燥させます。
    7. テープの2つ以上の層を有するピペット片の上部を覆います。円形の開口部の中央にテープ層に穴を穿刺。穿刺はガラス管が通ってしっかりと通過するために十分な大きさであることを確認してください。
    8. ガラスがしっかり収まるようにテープを延伸し、ゲルがパンクチャドホールを介して、鋳造されたガラス管を、スライドさせます。私チューブの底にピペット底面上2mmとなるようにガラス管をnsert。
    9. ガラス管を保持し、集中し、システムが準備された後、ピペットの壁に触れていないかどうかを確認してください。システムは現在、鋳造の準備ができています。
  2. キャスティングジェル
    1. ゲルバッファーを準備し、APSおよびクマシーソリューション(解決策1-3、 表1)。
    2. ゲル溶液を分離し、12%のT(溶液4、 表1)および1%T(溶液5、 表1)を準備します。ゲル溶液を分離し、12%のTにクーマシー溶液10μlを加えます。勾配ミキサーに注ぐ直前に、両溶液にAPSとTEMEDを追加します。
      注意:ポリアクリルアミドは非常に神経毒性であると手袋を着用しなければなりません。
    3. グラデーションミキサーの分注バルブが閉じていることを確認します。分配先端から混合室の最も遠いにゲル溶液を分離し、12%のTを追加します。両室間のバルブを開け、溶液が私を流します次のチャンバNtoを。
    4. バルブを閉じて、前のチャンバーにゲル溶液を分離脱臼12%Tをピペット。これは、チャンバ間の気泡を避けるために行われます。
    5. 分配先端に最も近い混合室にゲル溶液を分離し、1%のTを追加します。磁気撹拌機の電源をオンにします。
    6. 分離ゲル溶液を混合すると、ピペット、ガラス管に流入することを可能にすると同時に、オープン両方勾配ミキサーバルブ。
    7. 勾配ミキサーで分離ゲル溶液が枯渇したら、10ミリリットル注射器にミキサーのカップル、それをからチューブを切り離します。注射器がしっかりと接続されるまで、管の端部は、ピペット内の液体レベルより上に残ることを確認してください。
    8. 静かにピペットとガラス管にチューブから残りの分離ゲル溶液をプッシュするために注射器を使用してください。その中に気泡を許可する前に、ピペットバルブを閉じます。
    9. 静かに水飽和ブタノの約0.25ミリリットルの層を追加空気中の酸素から重合反応をシールするとトップメニスカスを平坦にするために、ガラス管内部のゲル溶液の上リットル(溶液6、 表1)。
    10. 脱イオン水(洗剤を使用しない)ですぐに注ぐ装置を清掃してください。
    11. 室温での完全なゲル重合のために一晩待ってください。
  3. デバイスからのゲルチューブを取り外して保管
    1. 翌日、慎重にデバイスの上からテープを剥がします。
    2. ピペットの下のチューブからバルブを外します。クランプからピペットを解放し、ステップ1.3.3を実行します。および1.3.4。シンクの上。
    3. いくつ可撓性チューブに脱イオン水を満たした10mLのシリンジ。ゆっくりとピペットの外に重合ゲルをスライドさせ、ピペット内にチューブを通して水を押してください。
    4. 水平方向にピペットを持ち、慎重に開いた端からスライドゲルを固定します。
    5. 下の余分なポリアクリルアミドを遮断し、アロカミソリの刃を使用してガラス管をUND。ガラス管の先端と、それがフラッシュすることによって、チューブ内にゲル上でスムーズなエンドを作成することを確認します。
    6. ゲルの上部側から残りのブタノールを分配し、キャップされていない15ミリリットルの遠心分離管にゲルチューブを設定します。 4.5 mlの0.5 mlのゲル緩衝液(溶液1、 表1)の超純水を混合し、ゲルチューブの約2(ガラス管内)上面の両方に溶液のmlおよび下側(遠心管中)を加えます。
    7. バッファの蒸発を防ぐためにパラフィルムで、ガラス管の開口部を含む遠心分離管の完全な上面を覆います。ゲルは、約2週間4℃で保存することができます。

2.試料の調製

  1. 2マウス心臓を計量し、カミソリの刃を使用して、ペトリ皿にそれらをミンチ。
  2. モルタルに加工組織を追加し、サンプルをカバーするのに十分な液体窒素を追加します。より多くの追加、乳棒で組織を粉砕それが蒸発する液体窒素。
  3. 組織が ​​完全に粉砕された後、窒素を蒸発させ、そして組織のすべての100mgの4℃で(溶液7、 表1)溶解緩衝液1mlを加えます。遠心管にソリューションを移動します。
  4. 4℃で5分間、2000×gで遠心分離します。慎重に新しいチューブに上清を回収し、ペレットを捨てます。ビシンコニン酸法12を用いて上清中のタンパク質濃度を定量する、または好ましいとして。注:好ましいものとして天然の細胞溶解物または細胞成分分画を調製することができます。 CN-GELFrEEは、様々な異なるネイティブの試料調製と互換性があります。
  5. 可溶化緩衝液、ローディング溶液(溶液8と9、 表1)を準備します。
  6. 試料がペレットである場合、可溶化緩衝液の50〜150μl中に再懸濁します。 15分間氷上でサンプルを保管してください。
  7. バッファはsolubilizatで再懸濁した試料または細胞溶解物を交換します30kDaの-MWCO超遠心フィルターを用いたイオンバッファ。
  8. プロテイン4°Cでのサンプルと5〜10分間、または保持フラクションボリュームがダウンして約20μlのになるまで万XGを遠心。フロースルーを捨てます。
  9. 保持画分に可溶化緩衝液の400μl加え、ピペッティングにより混合します。 4℃で遠心分離し、5〜10分間、または保持フラクションがダウンし、約20μlのになるまで万XG。フロースルーを捨てます。
  10. 繰り返しステップ2.9をさらに2回。
  11. 可溶化緩衝液100μlでろ過した試料(約20μl)を希釈します。
  12. サンプルをローディング溶液20μlを追加します。

3. CN-GELFrEEデバイス

  1. CN-GELFrEEの分別を実行するには、機械工場を参照することにより、デバイスの部品を製造しています。テフロンのデバイス部品を製造しています。部品やトンを製造するために必要なすべての情報について、図1を参照してください一つのデバイスに必要な部品数のO テーブル2。
    安全性に関する注意事項適切な個人保護具を着用します。注意は、高電圧電源の周りに取られるべきであり、すべての接合が正しく装着されるべきです。電圧がオンになっている間、デバイス、または任意の隣接する濡れたエリアをタッチして、電気泳動中周囲のベンチエリアドライを維持しないでください。デバイスの取り扱いおよび/または画分を収集するときにまた、電源を完全にオフにする必要があります。
  2. 陽極バッファーと陰極バッファー(ソリューション10-11、 表1)を準備し、4℃または氷に保管してください。
  3. 「サンドイッチ」方式で、Oリングおよび第2のスペーサ、スペーサーを介してゲルチューブ(ゲルなし終了)の上端を合わせます。
  4. 、第2のスペーサの後にバッファ室(陰極)を追加側孔を介して、ネジを完全に通過し、両側にナットを追加して、締めます。ことを確認しGLASの上端チューブは、バッファチャンバの上部開口部の前ではなく、直接下もしくはそれを越えて固定されています。
  5. スペーサ、Oリング、収集チャンバ、および第2のスペーサを介してゲルチューブの下端を取り付けます。
  6. 、第2のスペーサの後にバッファ室(陽極)を追加側孔を介して、ネジを完全に通過し、両側にナットを追加して、締めます。近いが後壁に触れていない、ゲルチューブの下端は、バッファ室の上部開口部を越えて固定されていることを確認してください。
  7. 陰極バッファ室が上方クランプと支持スタンドを使って垂直にCN-GELFrEEデバイスを設定します。
  8. 陽極バッファ室(下)に陽極バッファーと陰極バッファーは、カソードバッファ室(上)に追加します。 4℃ですべてのバッファを保管してください。
  9. 静かにガラス管をタップすることで、ガラス管の内部から気泡を除去し、漏れのためのシステムをチェックしてください。
  10. 白金電極は、チャンバー内のバッファに接触して、両方のことであることを確認しますゲルチューブ端部は、各チャンバ内の緩衝液中に浸漬されます。
  11. 陽極バッファ室(下)上にカソードバッファ室(上)上の負及び正:それぞれのバナナプラグへの電源から電源コードを接続します。
  12. ゲルの上面に、ゲル管の内部にゲル負荷チップを使用してサンプルをロードします。
  13. 赤い色素の先端がゲルチューブの底になるまで、過熱を避けるために、1 W定数でゲルを実行します。
    注意:続行する前に電源をオフにします。
  14. アノードとカソードバッファを破棄します。
  15. 陽極バッファ室によりナットUntightenとスペーサとOリングを維持し、下部スペーサとチャンバーを分解。過去または直接下にない、上部開口部の前に、収集チャンバの内部にゲルチューブの底端を置きます。収集チャンバに近いスペーサとOリングを押してください。
  16. セルロース透析膜の部分をカットし、陽極バッファに浸すことによってそれを再水和。 APをカバー収集チャンバと透析膜を用いて下部スペーサの間erture。
  17. 第2のスペーサの後に陽極バッファ室を組み立て、ネジやボルトを追加して、締めます。
  18. アイスバケットの上に水平にデバイスを置きます。バッファ室に新鮮なアノードとカソードバッファを追加し、漏れのためのシステムをチェックしてください。
  19. 収集チャンバ内に陽極バッファー150μlのを追加します。それぞれのバナナプラグに電源コードを再接続します。
  20. 3ミリアンペア定電流で電源をオンにします。色素の先端は、その後、収集チャンバ内のバッファに溶出するために開始する必要があります。
  21. 全体の色素の先端が溶出された場合、電源をオフにして、低タンパク質結合マイクロ遠心チューブにそれを転送し、第一画分(0分)を収集。
  22. 陽極バッファー150μlで収集チャンバを補充します。氷の上のすべての集めた画分を保管してください。
  23. のコレクションから、次の時間間隔後の画分を収集第一画分:2分、4分、6分、8分、10分、15分、20分、25分、30分、45分及び60分。電源がオフの間の時間を考慮していません。画分を収集する前に、電源をオフにするとサンプルの間の陽極バッファー150μlで収集チャンバを補充することを忘れないでください。次の割合を溶出開始するために収集した後、再度電源をオンにします。
  24. アノードとカソードバッファを分注し、60分後にバッファ室に新鮮なソリューションを追加します。 90分、120分で画分を収集します。
  25. アノードとカソードバッファ時間ごとに変更します。
  26. 明確なネイティブまたは画分とブルーネイティブPAGEを実行し、好ましいものとして、それを染色。製造元の指示や優先プロトコルに従ってください。
  27. 還元SDS-PAGEを実行し、好ましいものとして、それを染色。製造元の指示や優先プロトコルに従ってください。
  28. GELFrEE画分をクリーンアップし、ネイティブの質量分析に提出し説明広報として分析eviously 9。

図1
図1:CN-GELFrEEデバイス (A)GELFrEE機器部品の図面や製造部品の(B)の写真。 (C)CN-GELFrEEデバイスアセンブリスキーム:(1)バッファ室(2)スペーサー、(3)Oリング(4)ゲルチューブ(5)収集チャンバ、及び(6)透析膜。

表1
表1:ソリューションの表。

表2
表2:GELFrEEデバイスの部品表。

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Representative Results

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極低温グランドマウス心臓から抽出したタンパク質200μgのは、1から12パーセントのTゲル管におけるCN-GELFrEE法を用いて、15​​0μlの各14分画にネイティブに分画しました。各画分の10μlのアリコートは、染色されたCN-PAGEスラブゲルと銀に実行されました。 CN-GELFrEE分画で得られた分画及び解像度の明確な描写図2Aに示されています。画分を、2時間かけて回収し、ゲルアッセイは、約30から500 kDaの範囲の分子量を増加させるの一貫したパ​​ターンを示します。各分画は、〜100 kDaの以上の質量の範囲の種が含まれています。画分は、複数のコレクション分数の間で起こるとしてますます減少し低分子化範囲の低オーバーラップを表示します。ここに示したCN-PAGEスラブゲルは、各150μlの画分から回収されたタンパク質のわずか6%に相当します。

FRACTの各イオンは、CN-GELFrEEが、その後減少し、SDS-PAGEスラブゲル上でそれらを実行する前に変性させたからネイティブに溶出しました。還元SDS-PAGEスラブゲル( 図2B)には、無傷のタンパク質複合体を分解して、ジスルフィド架橋を減少させたことを示し、それぞれのネイティブの画分( 図2A)と比較した場合、すべての画分に質量シフトを見ることができます。

図2
図2:時間間隔0〜120分で集めCN-GELFrEE画分のマウスの心臓低温粉砕抽出物のCN-GELFrEE分離 (A)をクリアネイティブPAGE。左:ネイティブ分子量ラダー。 A.左と同じ画分のSDS-PAGEを還元(B)還元及び変性分子量ラダー。

画分を洗浄してsubmittすることができますネイティブ質量分析法へのedは9を分析ます。 GELFrEE画分の一部で同定されたホモ二量体リンゴ酸デヒドロゲナーゼの天然のMSスペクトルは、16+および20+及び72843ダ( 図3A)の分子量との間の電荷分布を示しています。 18+充電状態を単離し、衝突活性化、36,421.7の分子量( 図3B)を有するモノマーリンゴ酸脱水素酵素の放出をもたらします。ソースの活性化は、単量体の単離およびさらなる断片化を可能にする、モノマー排出を誘導するために、無傷の複合体に適用しました。 11+モノマーの断片化マップは、 図3Cに観察することができます。 CN-GELFrEEは高分子集合体の非共有タンパク質 - タンパク質相互作用のない崩壊を示さない、分析質量分析と適合性であることが証明されました。

図3 図3:モノマーのフラグメンテーションから得られる質量スペクトルおよびホモダイマーリンゴ酸デヒドロゲナーゼのフラグメンテーションマップ無傷の複合体(A)MS1スペクトル、複合体から排出された(B)MS2スペクトルを示すモノマー、及び(C)フラグメンテーションマップ。赤Nは、N末端がアセチル化されていることを示しています。

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Discussion

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CN-GELFrEEは、ゲルマトリックスを介して分子に基づくタンパク質分画のための担体分子9としてアニオン性および中性界面活性剤の混合物を使用して透明なネイティブ(CN)PAGE緩衝系から誘導されます。ネイティブマウス心臓タンパク質抽出物にCN-GELFrEEの適用は、生体分子のアセンブリの非共有結合相互作用を維持しながら、個別の帯域幅で複雑性の低い画分を生成しました。 CN-PAGE、還元SDS-PAGEスラブゲルとの間の画分の比較は、画分中の高分子およびタンパク質鎖間のジスルフィド結合の破壊との間の非共有結合性相互作用の損失を示す質量シフトを示しました。結果は、CN-GELFrEE分離のネイティブの文字を確認します。

このプロトコルのいくつかのステップが重要であり、したがって、より多くの注意を保証します。まず、鋳造後、ゲルチューブはゆっくりデバイスから取り外されるべきであり、外部ポリアクリルアミドを慎重にカット。怠りますそのように、メッシュ内の気泡を発生させるか、ガラス管からゲルを取り外し、ゲルを損傷する可能性があります。これらの損害は、分離分解能を損ない、徹底的に避けるべきです。第二に、電気泳動の間、システムの電気抵抗は熱を発生、残業が増加し、したがって、冷室の手順を実行するか、またはサンプルをにロードされた後、アイスバケットにデバイスを移動させるために非常に重要です熱によってロードされたタンパク質を変性させないためにゲル。また、記載されたプロトコルを実行する際の技術のいくつかの重要な制限を気にすることは重要です。高タンパク質負荷はCN-GELFrEEの解像度を減らすことができます。特に、いくつかの種がより豊富であるサンプルで、オーバーロード、それらのタンパク質種が連続画分の数を通して溶出されることになります。マウス低温粉砕サンプルについては、最良の結果は200と400μgの間の量で見られたが、この動作はサンプルに依存します。また、H試料中の塩のIGHレベルは、バンドパターンを変更し、分別の解像度を低下させる、タンパク質の電気泳動特性を変化させます。これらの重要なステップと制限がより良い結果を達成するために、このプロトコルのパフォーマンス中に考慮されるべきです。

また、CN-GELFrEEはネイティブクロマトグラフィーで複数の高度に要求特性を有することが示されました。この単純な分離方法は、分子量の広い範囲にわたって、タンパク質負荷及び分別の高い量を受け入れ、タンパク質複合体の高解像度の分画を達成します。 CN-GELFrEEも生物と異なる調製物9の多種多様からの生物学的サンプルを分別することが可能な、非常に汎用性であることが証明されました。

また、この技術で液体画分の溶出は、他のゲルベースの​​ネイティブ分離では観察されない高タンパク質回収を可能にします。また、他の方法とは異なり、その電子リュートアセンブリは液相で、CN-GELFrEEは、試料濃度を低下させません。実際に、本明細書に記載されるプロトコルは、画分の試料からの約2倍にすることにより、各タンパク質の集合の濃度を増加させます。最後に、この方法で生成される液体試料は、様々な下流の生化学的および生物物理学的なネイティブのタンパク質の質量分析を含む、分析と容易に互換性があります。単一のクリーンアップステップの後に我々はさらに、これらの技術の間のネイティブファッションとの互換性を実証し、ネイティブの質量分析、CN-GELFrEE画分中の未知のタンパク質複合体を介して、同定および特徴付けすることができました。

同様GELFrEE変性に、この新規な天然の分画技術も非常に適応可能です。キャスティング溶液の濃度は、実行時に解決される分子量範囲を変化させるために、異なる勾配ゲルを作成するために調整されてもよいです。高RESOLUTに分離ゲルソリューション結果の%Tを増やしますそれを減少させながら低質量の種のイオンは、高分子量種の分離を改善します。実験が行われる介して収集時間はまた、必要に応じて、各画分において達成分子量の帯域幅を最適化するために適合させることができます。このプロトコルに示されているよりもさらに高い分子量の範囲を生成します120分以上の拡張実験時間。加えて、画分の回収の間の時間を短縮すると、各画分中の複雑さを低減することができます。したがって、複数のパラメータが異なる研究の技術の使用を最適化し、容易に微調整することができます。

結論として、CN-GELFrEEの利点は、分子量の広い範囲で高分解能の分離、高いタンパク質回収、およびタンパク質負荷の高い量を受け入れるを提示するネイティブ分離技術の分野におけるギャップを占めます。最後に、得られた画分は、最も下流の天然および変性タンパク質解析技術と互換性があります。

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Acknowledgments

WMケック財団は、寛大にこの仕事のための資金を提供しました。政府の下で高等教育人材の改善のためのRDMのためのブラジル、科学国境なき奨学金88888.075416 / 2013から00コーディネーションから、 - この材料リオ・デ・ジャネイロ州の政府からFAPERJの研究助成金100.039 / 2014でサポートされている作業に基づいていますOSSのためのフェローシップ番号2014171659の下HSS、国立科学財団大学院研究フェローシップのためのブラジル、の、およびLHFDVPCHのためのブラジルの政府からCNPqの研究助成金202011/2012から7によって、生命のノースウェスタン大学の化学の受信者は、研究所ポスドクを処理されていますフェローシップ賞。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 Bio-Rad 161-0158 This solution is neurotoxic.
6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) Sigma-Aldrich A2504 This chemical is an irritant.
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific 7727-54-0 This chemical is flammable, toxic, and corrosive.
Coomassie blue G250 Bio-Rad 161-0406
Dodecylmaltoside Sigma-Aldrich D4641 This chemical is an irritant.
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) FLUKA 3777 This chemical is toxic.
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120 This chemical is toxic.
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Liquid nitrogen Any supplier n/a Store liquid nitrogen in containers
designed for low-temperature
liquids
Mouse heart Bioreclamation LLC MSE-HEART
n-butanol Fisher Scientific 71-36-3 This chemical is flammable and toxic.
Ponceau S Sigma-Aldrich BP103
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78430 This chemical is toxic.
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 This chemical is an irritant.
Sucrose JTBaker 4097
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 161-0800 This chemical flammable and irritant.
Tris-HCl Amresco M151
Trycine Bio-Rad 161-071
Equipment
Gradient mixer Hoefer SG15
Magnetic stir  Any supplier n/a
Magnetic bars  Any supplier n/a Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers.
Power supply Bio-Rad 164-5056 Voltage up to 1,500 V
Refrigerated centrifugue Eppendorf 022622552 Up to 15,000 x g
Materials
15 ml conical tube Any supplier n/a
30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter Millipore UFC503096
Flexible tubing Saint-Gobain B000FOV1J0 Approximately 1 m length
Ice bucket Any supplier n/a
Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) Any supplier  n/a Aquarium valves are compatible.
Mortar and pestle Any supplier n/a
Native PAGE 3-12% T slab gel Invitrogen BN1003
Parafilm Bemis PM-996
Petri dish Fisher Scientific 08-757-13
Protein low bind tube 1.5 ml Eppendorf 022431081
Razor blade IDL Tools TE05-091C
Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO Fisher Scientific 21-152-9
SDS-PAGE slab gel for any kDa Bio-Rad 456-9036
Serological pipets (25 ml) VWR 89130-900
Syringe (10 ml) Any supplier n/a

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References

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CN-GELFrEE  - クリア天然ゲル溶出液フラクションエントラップメント電気泳動
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Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).More

Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).

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