Protocol
1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro-transkription och mRNA Purification
- Linjärisera H2B-PSmOrange innehållande pCS2 + plasmiden med användning av Notl-restriktionsenzym i enlighet med tillverkarens instruktioner.
Obs: Utför nästa steg med hjälp av lämpliga skydd såsom handskar och labbrock för att förhindra mRNA förorening och nedbrytning. - Rena den lineariserade DNA: t med användning av en PCR-reningskit eller fenol-kloroform-baserade metoder i enlighet med tillverkarens protokoll.
- Använd ett mikrogram av lineariserad mall-DNA för Sp6-mRNA-transkription enligt tillverkarens anvisningar.
- Ta bort DNA genom tillsats av 1,0 U RNas fritt DNasI för 10-20 min vid 37 ° C.
- Städa upp mRNA med hjälp av en RNA städa upp kit enligt tillverkarens protokoll.
- För att öka mRNA renhet och koncentration, utfällning av mRNA genom att tillsätta 6 il natriumacetat (3,0 M, pH 5,2) och 150 pl 96% etanol. Inkubera mixed lösning vid -20 ° C under minst 30 min och upp till 24 timmar.
- Samla mRNA genom spinning av lösningen vid 18,407 xg under 45 min vid 4 ° C. Kassera vätskan och resuspendera mRNA i 150 | il 70% etanol. Blanda och centrifugera lösningen under ytterligare 15 min vid 4 ° C. Kasta vätskan, torka pelleten i 5 minuter på is och suspendera mRNA i 20 ul ultrarent RNas fritt vatten.
- Bedöma Koncentrationen och renheten hos mRNA genom fotometrisk mätning av en 1: 100-mRNA utspädning (1 | j, l-mRNA i 99 pl ultrarent RNas-fritt vatten).
- För kortvarig förvaring, hålla mRNA lösningen vid -20 ° C. För långtidsförvaring, hålla mRNA vid -80 ° C.
2. H2B-PSmOrange mRNA mikroinjektion i Zebrafish embryon
- Inrätta parning par natten innan injektion med TG (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) dubbel transgen fisk (eller någon annan GFP transgen fisk). Lämna fisken separeras genom att placera ett distansorganmellan dem för att styra tiden för parning.
- Ta bort distansen på morgonen injektions och låt fisken mate under 20 minuter.
- Under att para ihop tid späddes H2B-PSmOrange mRNA till den slutliga koncentrationen av 130 pg / nl (i RNas fritt vatten) och överföring 6 | il injektionslösning till en mikroinjektion kapillär med användning av en micro spets. Kontrollera injektionsvolymen med en kalibrerad glasskiva. Justera insprutningstrycket att injicera 2 nl mRNA lösning (260 pg).
- Samla in ägg i en steriliserad plastpetriskål med 1x Embryo (E3) medium.
- Överför 20 till 30 embryon till en injektion maträtt med hjälp av en plast pasteurpipett.
- Injicera 2 NL-mRNA som innehåller lösningen i cellen eller strax under cellen in äggulan vid en-cellstadiet 11.
- Överför injicerade embryon i en petriskål med 1x E3 medium, ta bort obefruktade eller inte normalt utvecklings embryon och odla dem vid 28 ° C.
Obs: Lätt skydd of embryona krävs inte under experimentet. - Höja zebrafisk embryon i 1x E3-medium och tillsätt 0,2 mM PTU (1-fenyl-2 tiourea) efter gastrulation att inhibera pigmentering. Ändra mediet två gånger per dag för att minimera risken för bakteriekontaminationer.
3. Embryo Inbäddning
- Välj GFP (grön) och PSmOrange (orange / röd) samuttrycker embryon med hjälp av ett binokulärt mikroskop utrustad med en fluorescenslampa och lämpliga filter utsläpp. Överför positiva embryon i en steril petriskål med 1x E3 medium.
- Dechorionate embryon under ett stereomikroskop med hjälp av pincett 12.
- Transfer ett embryo i en 1,5 ml rör innehållande 1,0 ml förvärmda 1,0% lågsmältande agaros (LMA) framställd i ultrarent vatten med hjälp av en cut-tip pipett (P200). Notera: Värm LMA till 80 ° C och svalna i 3-5 minuter vid RT före inbäddning embryot.
- Överför embryo i 150 pl LMA i enchambered coverglass och justera embryots orientering, t ex ryggsidan nedåt i experimentet som beskrivits för den inverterade konfokala lasersvepmikroskop A1R + (eller något annat lämpligt mikroskop), med användning av en fin plastspets. När LMA är polymeriserade, fylla kammaren med fisk vatten innehållande 0,2 mM PTU och 0,02% etyl-3-aminobensoat-metansulfonat (Tricaine) för anestesi.
- Innan avbildning av provet, vänta 15 minuter för att fastställa effekten av Tricaine. Anestesi förhindrar embryo rörelser, som kan övervakas med hjälp av ett stereomikroskop utrustad med ljusfält belysning.
Obs: Kamrarna kan återanvändas två gånger.
4. PSmOrange Photoconversion
- Placera provet under konfokalmikroskop och skanna provet för att identifiera området för att photoconvert att använda 488 nm och 561 nm lasrar för avbildning GFP och PSmOrange respektive.
Obs: Använd den inverterade konfokala laserskanning mikroskop A1R + på den inverterade staGE TiEcontrolled av mikroskop bildbehandlingsprogram och utrustad med 488 nm, 561 nm och 640 nm lasrar för photoconversion och bildbehandling. Emellertid är tillämpningen säkerligen inte begränsad till detta mikroskop, så länge som laserlinjerna för omvandling och avbildning är tillgängliga.- Sätt 20X luft målet på plats (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
- Använd följande mikroskop inställningar för att detektera PSmOrange proteinet innan photoconversion: 561 nm laser, 0,74 mW mätt i fokus plan ovanför målet.
Obs: Detta motsvarar 40% på detta system (mätning i fokusplanet är det enda sättet att bestämma den effektiva effekt). Justera lasereffekt enligt experimentella behov som effektiviteten av H2B-PSmOrange injektioner kan variera. - Lägg zoomfaktorer för att markera området av intresse. Högre förstoringar minska bildinsamlingstiden och därför fototoxicitet.
- Skaffa en z-stack som täcker strukturens intresse att använda 488 nm och 561 nm lasrar i sekventiell mod (line läge 1-> 4). Fixa z-steg mellan 1,0 och 2,0 | im. Linjegenomsnitt och skanningsfrekvens kan användas för att optimera bildkvaliteten.
- Skanna provet och välj regionen av intresse (ROI) verktyg för att markera det område photoconvert. Fäst ROI som stimuleringsområde. Välj Foto Aktivering / Blekning modul, aktivera 488 nm laser genom att markera respektive ruta och ställ in 488 nm lasern till 80% (1 mW lasereffekt mätt vid målet). Ställ in skanningshastighet till 0,5 sek / ram.
- Öppna photoconversion verktyget (ND stimulering) och ange photoconversion inställningar.
- Klicka på "Lägg till" för att ange photoconversion protokollet.
- Ställ in "Fas" en i "Förvärv / Stimulation" menyn "Förvärv" och anger antalet bilder som ska förvärvas innan photoconversion i menyn "loopar".
- Ställ in "Fas" 2 "Stimulation "och ange antalet stimuleringshändelser som skall utföras.
- Justera "Fas" 3 såsom beskrivits för "Fas" 1. Eventuellt sätter ett väntande "Fas" efter "Fas" 2 genom att ange tid att vänta innan den sista omgången av bildtagning.
- När alla parametrar är inställda, tillämpa inställningen stimulans och kör photoconversion.
Obs: Lasereffekt, frekvens av skanning och antalet iterationer för varje omgång av photoconversion kan variera och skiljer sig från embryo till embryo. En inställning till att börja med visas i tabell 1.
- Skaffa en slutlig z-stack med hjälp av 488 nm, 561 nm och 640 nm lasrar tillämpar inställningarna ovan. Ställa in 640 nm laser för att visualisera den konverterade PSmOrange använder hög lasereffekt (upp till 4,5 mW).
5. Demontera Embryo från LMA
- Avlägsna embryot innehållande kammare från mikroskopet. Försiktigt bort embryot från agarosen usjunga pincett.
- Överföra embryot till en ny steriliserad plastpetriskål eller i en steriliserad 6-väl-skylt som innehåller 1x E3 och 0,2 mM PTU. Inkubera embryot vid 28 ° C tills den önskade utvecklingsstadium.
6. Analysera öde Photoconverted PSmOrange Proteinuttryckande celler
- Åter bädda embryot som beskrivs i punkterna 3.3 och 3.4.
- Placera provet under konfokalmikroskop och skanna provet för att identifiera photoconverted celler (640 nm) i GFP transgena strukturen av intresse (488 nm).
- Skaffa en z-stack som täcker de strukturer av intresse med användning av 488 nm, 561 nm och 640 nm lasrar i sekventiell mod (line läge 1-> 4). Fixa z-steg mellan 1,0 och 2,0 | im. Linjegenomsnitt och skanningsfrekvens kan användas för att optimera bildkvaliteten.
- Använda en av följande metoder för att identifiera celler, som samuttrycker GFP och photoconverted proteinet.
- Skräddarsydd automatisk Fiji BildJ Makro 3
- Convolve den ursprungliga stapeln med hjälp av "gaussisk oskärpa" plugin (→ Process → Filter → gaussisk oskärpa) och subtrahera de släta staplar från den ursprungliga med "Image Calculator" plugin (→ Process → Bild Calculator). Använda detta steg för att visualisera strukturerna av intresse och minska beräkningstiden för analysen.
- Tillämpa särskilda gränsvärden för de gröna och långt röda kanaler i syfte att belysa de photoconverted celler (→ Bild → Justera → Threshold). Använd "analysera partiklar" verktyg för att upptäcka tröskelområdena med en lämplig inställning (→ Analysera → analysera partiklar).
- Öppna "Bild Calculator" plugin och visa de överlappande ROI i grönt och långt röda kanalen i gult (→ Process → Bild Calculator).
- Mikroskop imaging programvara för 3D-datautvärdering
- Visa bunten i3D med hjälp av showen volymvisningsalternativ (→ 3D visualisering Meny → Visa volym View). Använd det grafiska gränssnittet för att välja de gröna, röda och långt röda kanaler, justera ljusstyrka och kontrast och beskära 3D stack för att markera photoconverted området (Figur 1).
Obs: Liknande metoder för att analysera data finns tillgängliga i de flesta av de vanligaste programmen för bildanalys.
- Visa bunten i3D med hjälp av showen volymvisningsalternativ (→ 3D visualisering Meny → Visa volym View). Använd det grafiska gränssnittet för att välja de gröna, röda och långt röda kanaler, justera ljusstyrka och kontrast och beskära 3D stack för att markera photoconverted området (Figur 1).
- Skräddarsydd automatisk Fiji BildJ Makro 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar ett exempel på PSmOrange photoconversion systemet. Tallkottkörteln komplex är en konserverad struktur i ryggradsdjur rygg diencephalon. Liksom i många andra ryggradsdjur, denna komplexa består av tallkottkörteln orgel i mitten av diencephalon och vänstersidig parapineal celler. Eleganta men tidskrävande uncaging experiment visade att parapineal celler har sitt ursprung i den främre delen av tallkottkörteln organet 13. I tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) transgena embryon, både tallkottkörteln och parapineal celler märkta under utveckling. För att bedöma lämpligheten av PSmOrange system vi använt dessa embryon för att återskapa den rapporterade tallkottkörteln komplex utveckling. 260 pg mRNA som kodar för den nukleära form av PSmOrange, H2B-PSmOrange, injicerades i en-cellstadiet dubbla transgena embryon för att uttrycka proteinet i alla cellkärnor. Injicerade embryon inkuberades vid 28 ° C tills 24 h efter fertilizatjon (HPF), ut för GFP och stark H2B-PSmOrange expression och inbäddades i LMA i en chambered täcksystem med ryggsidan orienterad mot botten. Provet placerades under en inverterad konfokala laserskanning mikroskop styrs av mikroskop bildbehandlingsprogram och utrustad med 488 nm, 561 nm och 640 nm lasrar och en 20X luft mål för photoconversion och spårning. Två cellkluster i den främre delen av tallkottkörteln var photoconverted och omedelbart avbildas (Figur 1A - F). De photoconverted cellerna kunde visualiseras med användning av 640 nm laser (långt röd - Figur 1C), men inte med den 561 nm laser (orange / röd - Figur 1B). GFP-uttryck i dessa celler ursprungligen också minskas på grund av fotoblekning (Figur 1A, 1D, 1F). Vid 52 HPF GFP och H2B-PSmOrange detekterades i photoconverted H2B-PSmOrange proteinuttryckande celler (Figur 1A "- F). Faktum är att ett fåtal av dessa celler bildade parapineal på vänster sida av hjärnan (pilspetsar i figur 1A '- F'). Detta resultat är i linje med tidigare rapporter om parapineal cell ursprung och visar tillämpligheten av PSmOrange tekniken i den levande ryggradsdjur embryot.
. Figur 1. Identifiera parapineal cell ursprung använder PSmOrange photoconversion systemet i levande zebrafisk embryon (A - F) Dorsal åsikter med främre till toppen fokuserad på rygg diencephalon av en tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) transgena embryot belyser tallkottkörteln (P) och parapineal celler (pp) vid (A - F) 26 HPF omedelbart efter photoconversion och (A '- F & # 39;) 26 timmar senare vid 52 HPF. Embryot injicerades med mRNA som kodar H2B-PSmOrange. Bilderna visar 3D-rekonstruktioner. Expression av (A, A ') transgen GFP, (B, B') omvandlas inte H2B-PSmOrange (röd kanal) och (C, C ') efter photoconversion (långt röda kanalen). Vita streckade cirklar belysa området photoconversion, som saknar orange / röd fluorescens. (D, D ') Merge av alla tre kanaler (grönt, rött, långt röd), (E, E') röda och långt röda kanaler och (F, F ') gröna och långt röda kanaler. (A'-F ') Vita pilspetsar markerar platsen för parapineal celler, som visar grönt, orange / röd och långt röd fluorescens. (AF) Skalan bar visas på nedre högra hörnet av varje bild.pload / 53604 / 53604fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Fas | Antal Loop | aktiva Lasrar |
| förvärvet | 1 cykel | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
| Stimulering | 15 till 30 cykler | 488 nm |
| Mognande | 1 min | # |
| förvärvet | 1 cykel | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
Tabell 1: Villkor för H2B-PSmOrange photoconversion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transgena embryon som bär fluorescerande reportrar har bidragit väsentligt att förstå embryonal utveckling. Det finns emellertid fortfarande den väsentligt behov av promotorer för att underlätta den specifika visualisering av särskilda strukturer. I sin frånvaro, forskare förlitar sig på tekniker såsom photoconversion av fluorescerande proteiner för att ta reda på om ursprung och utveckling av deras struktur av intresse. Detta är i sin tur en avgörande förutsättning för att identifiera de molekylära mekanismer som är involverade i utvecklingen. Tekniska framsteg i zebrafisk området tillåter nu att ersätta FP i transgena linjer med, till exempel, photoconvertible proteiner med hjälp av en crispr-Cas9 medierad knock tillvägagångssätt 14,15. Är emellertid relativt tidsödande och inte alltid framgångsrik denna teknik. I kontrast, tillämpningen av ubiquitously uttryckt H2B-PSmOrange i GFP och möjligen andra transgena bakgrunder är en rättfram teknik för att följa celler genom embryonic utveckling.
Till exempel, ursprung zebrafisk ventrala habenulae, en del av en konserverad neural ledningssystem i rygg diencephalon av ryggradsdjur har varit svårfångade tills nyligen och därmed ingen genetisk kaskad bakom dess utveckling avslöjades. Med användning av PSmOrange systemet och långtidstidsförlopp analys för att följa migrerande celler, kunde vi visa att till skillnad från de dorsala habenular kärnor, som har sitt ursprung till vänster och höger intill epifysen, ventrala habenular neuroner utveckla posteriort till denna region i thalamus 3. Denna kunskap tillät oss sedan för att identifiera den avgörande funktion av den kanoniska Wnt signalering nedströms gen Tcf7l2 för ventrala habenular neuron utveckling.
Tillämpningen av den photoconvertible PSmOrange systemet är enkelt, snabbt och har den fördelen framför photoactivatible proteiner som embryon kan väljas för starkt proteinuttryck innan belysning. Synthetic mRNA kodning för H2B-PSmOrange sprutas in i GFP-transgena embryot till ubiquitously uttrycka orange fluorescerande proteinet i alla kärnor. Vi har inte stött på några biverkningar vid injektion och proteinet är stabil under minst 96 h. Proteinet därefter photoconverted i GFP-transgen celler i ROI med användning av en 488 nm excitation laser och embryot kan analyseras för den nu mycket röda fluorescerande protein som innehåller celler i den efterföljande cirka 48 timmar. Det är kritiskt att övervaka den framgångsrika photoconversion eftersom förhållandena kan variera beroende på utvecklingsstadiet av embryot och vävnaden riktade. Mikroskopet bildprogram förvärvar en bild av varje kanal (grön, röd och långt röd) före och efter photoconversion. Den photoconversion effektivitet kan utvärderas mäter den genomsnittliga intensitet fluorescens i ROI mellan de olika kanalerna före och efter photoconversion. Om ingen långt röda fluorescens upptäcks omedelbart efter photoconversion annonsditionella rundor av photoconversion måste tillämpas. GFP blekning är vanligt efter photoconversion. Emellertid den kontinuerliga översättningen av det transgena fluorescerande proteinet övervinner detta problem inom ca 2 h.
En skräddarsydd makro för Fiji ImageJ för att underlätta identifiering av celler som samuttrycker den photoconverted proteinet och den transgena GFP är tillgänglig 3. Framtida etablering av stabila transgena linjer som uttrycker H2B-PSmOrange kommer att ytterligare förenkla förfarandet. Det kommer också att underlätta analysen av utvecklings händelser efter 4 dagar efter befruktningen, vilket kan ha spännande värde forskningsområden som vävnadsregenerering. Dessutom kommer kombinationen av matern uttrycker PSmOrange transgena och time-lapse avbildning 16 vara ett kraftfullt verktyg för att undersöka cellmigrations händelser som börjar före gastrulation på en enda cell nivå. Ytterligare applikationer kan omfatta utbyte av H2B kärn taggen med, feller instans, GAP43 att visualisera cellmembran och potentiellt axoner i det växande embryot.
En begränsning med denna teknik är att den zygotiska proteinet börjar bara uttryckas efter gastrulation och är därför inte tillämplig på analysen av gastrulation processer. Det måste också beaktas att det är ganska svårt att photoconvert proteinet i celler ligger djupt i embryot. Photoconversion inställningar måste anpassas så hög lasereffekt och relativt lång stimulering tid som behövs för photoconversion kan leda till vävnadsskada, som kräver noggrann övervakning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| Plastic Pasteur | alpha laboratories | LW4000 | |
| Original H2B-PSmOrange Plasmid | Addgene | 31920 | The plasmid described in the paper is available in the Carl lab |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Forceps (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| Nikon PLAN Apo λ 20X air objective | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) | Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging | No Number |
References
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
- Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
- Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling (2015).
- Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
