Protocol
1. H2B-PSmOrange基因体外转录 mRNA纯化
- 线性化使用根据制造商的说明的NotI限制性内切酶含有PCS2 +质粒H2B-PSmOrange。
注意：请使用适当的保护措施，如手套和白大褂，以防止污染的mRNA降解，并在接下来的步骤。 - 纯化使用根据制造商的协议的PCR纯化试剂盒或苯酚 - 氯仿基础的方法的线性化的DNA。
- 根据制造商的说明使用线性模板DNA 1微克了SP6-mRNA的转录。
- 通过在37℃下加入1.0单位RNAse游离DNA酶I 10-20分钟除去的DNA。
- 使用的RNA，根据制造商的协议清理试剂盒清理的mRNA。
- 以增加mRNA的纯度和浓度，通过加入6微升乙酸钠（3.0M，pH5.2）和150微升96％乙醇沉淀出的mRNA。孵育并购在-20℃ixed溶液至少30分钟，长达24小时。
- 通过在4℃下纺丝在18.407 XG的溶液45分钟收集的mRNA。弃去液体，并在150微升70％乙醇重悬的mRNA。混合和离心的溶液在4℃额外的15分钟。弃去液体，干燥在冰上5分钟，将沉淀，并在20微升超纯无RNase水重悬的mRNA。
- 100的mRNA稀释液（在99微升超纯无RNase水1微升mRNA）的：由1的光度测量评估mRNA的浓度和纯度。
- 对于短期存储，保持在-20℃的mRNA的溶液。对于长期存储，保持的mRNA在-80℃。
2. H2B-PSmOrange基因微量注射的斑马鱼胚胎
- 设置使用TG注射前对交配夜（FOXD3：GFP）; TG（FLH：GFP）的双转基因鱼（或任何其他的GFP转基因鱼）。离开鱼放置一个隔板隔开在它们之间，以控制交配的时间。
- 除去在注射的早晨隔板和让鱼交配20分钟。
- 在交配时，淡化H2B-PSmOrange的mRNA 130皮克的最终浓度/ NL（在无RNA酶的水），并转让6微升注射溶液成使用微加载尖端的显微注射毛细管。检查注射量与校准的载玻片。调节注射压力注射2 NL的mRNA溶液（260皮克）。
- 收集鸡蛋放入含有1x胚胎（E3）中无菌塑料培养皿。
- 转移20到30的胚胎，使用一个塑料巴斯德吸管的喷射盘。
- 注入含有溶液到细胞或正下方的细胞进入蛋黄在单细胞阶段11 2 NL的mRNA。
- 转印注射胚胎成含有1x E3介质的培养皿，除去未受精或不能正常发育中的胚胎，并在28℃下生长它们。
注：轻保障oF中的胚胎，不需要在整个实验。 - 提高在1×E3介质斑马鱼的胚胎和原肠胚形成后添加0.2mM的PTU（1-苯基-2-硫脲），以抑制色素沉着。改变介质每天两次，以减少细菌污染的危险。
3.胚胎嵌入
- 选择的GFP（绿色）和PSmOrange使用装有荧光灯和适当的发射滤光片双目显微镜（橙色/红色）共表达的胚胎。转移的积极胚胎成含有1x E3介质的无菌培养皿。
- Dechorionate胚胎使用镊子12在立体显微镜下。
- 在含有1.0毫升1.5毫升管传送一个胚胎预热用的切口尖端吸管（P200）在超纯水中制备1.0％低熔点琼脂糖（LMA）。注：在预热至LMA 80℃和嵌入胚胎前冷却在室温下3-5分钟。
- 转移胚胎在150微升LMA成腔玻璃罩和调节胚胎的取向，例如背侧中为倒共聚焦激光扫描显微镜A1R +（或任何其它合适的显微镜）中描述的实验下来，用细塑料小费。当向LMA是聚合的，用含有0.2mM的PTU和0.02％3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（三卡因）麻醉鱼水填充腔室。
- 使样品成像之前，等待15分钟，以确定三卡因的效果。麻醉防止胚胎运动，可以使用装备有明照明立体显微镜进行监测。
注意：室可两次重复使用。
4. PSmOrange光转化
- 放置共焦显微镜下的样品和扫描试样，以确定该地区使用488纳米和561纳米激光器分别成像GFP和PSmOrange到photoconvert。
注意：使用倒置激光共聚焦显微镜A1R +上的倒站GE TiEcontrolled用显微镜成像软件，并配备了488纳米，561纳米和640纳米激光器光转化和成像。然而，应用程序当然没有限制，只要转换和成像激光线路可用限于此显微镜。- 把20X空中目标到位（NA：0.75; WD 1.0毫米; FOV：0.64点¯x0.64毫米）。
- 使用下面的显微镜设置光转化之前检测PSmOrange蛋白质：561纳米的激光，在聚焦平面上的目标上述测定0.74毫瓦。
注意：这对应于40％的在该系统上（在聚焦平面的测量是确定有效功率的唯一方式）。根据实验的需要为H2B-PSmOrange注射的效率可以变化调整激光功率。 - 添加缩放因子，突出感兴趣的区域。放大倍率越高，降低图像采集时间，因此光毒性。
- 收购Z堆栈覆盖结构的S使用488纳米和在顺序模式（线模式1-> 4）561纳米激光器的兴趣。修正1.0和2.0微米之间的z步骤。线平均和扫描频率可用于优化图像质量。
- 扫描样本并选择感兴趣（ROI）工具，该地区要突出以photoconvert的区域。修复投资回报率的刺激区域。选择照片激活/漂白模块，通过检查各个框激活488纳米激光器和488nm的激光设定为80％（在目标测量1毫瓦的激光功率）。设置扫描速度0.5秒/帧。
- 打开光转化工具（ND刺激），并指定光转换设置。
- 点击“添加”命令指定的光转化协议。
- 在“采集/刺激”菜单“获取”设置“相位”1和表示在“循环”菜单光转换之前获得的图像的数量。
- 设置“相位”2“圣要执行imulation“和输入的刺激的事件的数量。
- 调整“相位”3作为“相位”1可选描述，插入一个等待“相位”通过输入时间上轮图像采集前要等待“相位”后2。
- 一旦所有的参数都设置，应用刺激设置和运行该光转化。
注意：激光功率，扫描和迭代次数为每一轮光转化可以变化的频率和从胚胎不同胚胎。的设置来启动与表1中示出。
- 收购使用488纳米，561纳米和640纳米的激光应用设置如上一个最终的Z堆栈。设置640纳米的激光来可视化使用高的激光功率的转换PSmOrange（高达4.5毫瓦）。
5. LMA胚胎下马
- 除去从显微镜容纳室胚胎。小心地从琼脂糖ü取出胚胎唱镊子。
- 转移胚胎成新灭菌塑料培养皿或进入无菌含有1x E3和0.2mM的PTU 6-孔板。孵育在28℃的胚胎直至发展所需的阶段。
6.分析光转换PSmOrange蛋白表达细胞的命运
- 下点3.3和3.4中所述重新嵌入胚胎。
- 放置共聚焦显微镜下的样品和扫描样本，以确定的利息（488纳米）的GFP转基因结构光转换细胞（640纳米）。
- 收购Z堆栈覆盖感兴趣的结构采用488纳米，561纳米和连续模式（行模式1-> 4）640 nm激光。修正1.0和2.0微米之间的z步骤。线平均和扫描频率可用于优化图像质量。
- 使用下列方法之一来识别细胞，其共表达GFP和所述光转换蛋白。
- 定制自动斐济图片Ĵ宏3
- 卷积使用“高斯模糊”插件原来栈（→处理→过滤器→高斯模糊），并减去从原来的使用“图像计算器”插件（→处理→图像计算器）顺利堆栈。使用此步骤可视化感兴趣的结构，并减少计算时间用于分析。
- 适用于绿色和远红外通道特定的阈值，以突出的光转换单元（→图像→调整→阈值）。使用“分析粒子”工具，使用合适的设置来检测阈值的区域（→分析→分析颗粒）。
- 打开“图像计算器”插件和黄（→处理→图像计算器）显示在绿色和远红外通道重叠的投资回报。
- 显微镜图像处理软件的3D数据评估
- 显示在堆栈3D使用show量视图选项（→三维可视化菜单→显示卷视图）。使用图形界面来选择绿色，红色和远红色频道，调节亮度，对比度和作物的三维堆叠以突出显示光转换区域（ 图1）。
注意：类似的方法来分析在大多数用于图像分析的通用软件的数据是可用的。
- 显示在堆栈3D使用show量视图选项（→三维可视化菜单→显示卷视图）。使用图形界面来选择绿色，红色和远红色频道，调节亮度，对比度和作物的三维堆叠以突出显示光转换区域（ 图1）。
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Representative Results
图1示出了PSmOrange光转换系统的一个例子。松果体复杂的是在脊椎动物背间脑的保守结构。像在许多其他脊椎动物中，此复合体由在间脑和左双面parapineal细胞的中心松果体器官。优雅但费时解笼锁的实验表明，parapineal细胞松果体器官13的前部产生。在TG（FOXD3：GFP）; TG（FLH：GFP）转基因胚胎，无论松果体和parapineal细胞发育过程中的标签。为了评估PSmOrange系统的适用性，我们使用这些胚胎重现报道松果体复杂的开发。编码PSmOrange，H2B-PSmOrange的核形式260皮克的mRNA，注入单细胞阶段的双转基因胚胎表达在所有细胞核的蛋白质。注射的胚胎在28℃下培养，直到24小时后fertilizat离子（HPF），选择GFP和强大的H2B-PSmOrange的表达，并与朝底部面向背侧一个墓室盖玻片系统嵌入在LMA。将样品置于通过显微镜成像软件控制的，并配有488纳米，561纳米和640纳米激光器和用于光转化和跟踪一个20X空气物镜的倒共聚焦激光扫描显微镜下。在松果体的前部的两个细胞群光转换，并立即成像（图1A - F）。所述光转换单元可以使用640纳米的激光（远红- 图1C）被可视化，但不与561 nm激光（橙色/红色- 图1B）。在这些细胞中的GFP表达，最初也减少由于光漂白（图1A，1D，1F）。在52高倍视野中的光转换H2B-PSmOrange蛋白表达细胞中检测到GFP和H2B-PSmOrange（图1A' - F“）。事实上，几个这些细胞的形成在脑的左侧parapineal（在图1A箭头' - F“）。这一结果与上parapineal细胞来源以前的报告一致，显示在活脊椎动物胚胎PSmOrange技术的适用性。
图1.使用PSmOrange光转化系统在活斑马鱼胚胎识别parapineal细胞来源 （A - F'）与前向聚焦在TG的背间脑顶背视图（FOXD3：GFP）; TG（FLH：GFP）转基因胚胎突出的松果体（P）和parapineal细胞（PP）（A - F）26日之后立即HPF光转化和 （A' - F＆＃ 39;）26小时后在52高倍视野。胚胎与基因编码H2B-PSmOrange注入。图片显示 三维重建。光电转换器（远红色通道）后未转换（A，A'）的转基因绿色荧光蛋白，（B，B'）的表达H2B-PSmOrange（红色通道）和（C，C'）。白色虚线圆突出光转化的面积，这是缺乏橙色/红色荧光。 （D，D'）所有三个通道的合并（绿，红，远红），（E，E'）红色和远红外通道和（F，F'）绿色和远红外通道。 （A'-F'）白色箭头突出显示parapineal细胞，其显示绿色，橙色/红色和远红色荧光的位置。显示在每幅图像的右下角（AF“）的比例尺。PLOAD / 53604 / 53604fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
| 相 | 回路数 | 主动激光 |
| 习得 | 1个周期 | 488纳米，561纳米，640纳米 |
| 促进 | 15到30个循环 | 488纳米 |
| 成熟 | 1分钟 | ＃ |
| 习得 | 1个周期 | 488纳米，561纳米，640纳米 |
表1：H2B-PSmOrange光转化的条件。
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Discussion
携带荧光记者转基因胚胎有助于从根本上了解胚胎发育。然而，仍然有启动子的基本需要，以促进特定结构的特定的可视化。在他们的缺席，研究人员依靠技术，如荧光蛋白的光转化，了解他们的利益结构的起源和发展。这又是鉴定参与在其发展的分子机制的关键先决条件。在斑马鱼领域的技术进步，现在允许更换FP在方法14,15使用CRISPR-Cas9介导的敲除转基因系与，例如，photoconvertible蛋白质。然而，这种技术是比较费时且并不总是成功的。与此相反，遍在应用表达H2B-PSmOrange在GFP和可能的其它转基因的背景是一个直接的技术遵循通过青霉细胞bryonic发展。
例如，斑马鱼腹侧habenulae的起源，在脊椎动物的背间脑保守的神经传导系统的一个组成部分，一直难以捉摸直到最近，因此没有遗传梯级发展基本被揭露。使用PSmOrange系统和长期的时间推移分析遵循迁移细胞，我们可以表明，不同于背缰核，其中发起左和右相邻的骨骺腹面缰神经元培养后到该区域在丘脑3。这方面的知识让我们接着来确定经典Wnt信号下游基因TCF7L2的腹侧神经元缰发展的关键作用。
该photoconvertible PSmOrange系统的应用非常简单，快捷，拥有了胚胎可以照明之前选择强表达photoactivatible蛋白的优势。合成先生NA编码H2B-PSmOrange注入GFP转基因胚胎遍表达在所有核橙色荧光蛋白。我们没有遇到在注射任何副作用和蛋白质是稳定至少96小时。蛋白质然后在在ROI的GFP转基因的细胞使用488nm的激发激光光转换和胚胎可以分析含有随后约48小时之内的细胞的现在远红色荧光蛋白。关键是要监控成功的光转化为条件可以根据胚胎的发育阶段和定位的组织而变化。显微镜成像软件之前和光转换后获得的每个信道（绿色，红色和远红色）的图像。的光转换效率进行评估测量的不同信道之间的投资回报率的平均强度荧光之前和光转换之后。如果没有远红荧光光转化广告后，立即检测光转化的ditional轮必须应用。 GFP漂白光转化后是常见的。然而，转基因荧光蛋白的连续翻译克服约2小时内该问题。
斐济ImageJ的一个定制的宏来缓解细胞共表达光转换蛋白和转基因GFP可用3的识别 。未来建立表达H2B-PSmOrange将进一步简化此过程中稳定的转基因株系。这也将有利于后4天受精后发育事件，这可能要研究领域，如组织再生耐人寻味的价值分析。此外，母体表达PSmOrange，转基因和延时成像16的组合将是用于研究在单个细胞水平原肠胚形成之前起始细胞迁移性事件的有力工具。进一步的应用可能包括H2B核标记物与，女的交流或实例，GAP43可视化细胞膜和潜在的轴突在发育中的胚胎。
这种技术的一个限制是该合子蛋白仅开始原肠胚形成后待表达，因此不适用于原肠胚形成过程的分析。它也必须考虑，这是相当困难的photoconvert蛋白质中位于深处的胚胎细胞。光电转换器设置必须适应作为高激光功率和所需的光转换可能会导致组织损伤，这就需要仔细监测相对较长的刺激时间。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| Plastic Pasteur | alpha laboratories | LW4000 | |
| Original H2B-PSmOrange Plasmid | Addgene | 31920 | The plasmid described in the paper is available in the Carl lab |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Forceps (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| Nikon PLAN Apo λ 20X air objective | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) | Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging | No Number |
References
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