Protocol
1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro-transskription og mRNA Purification
- Linearisere H2B-PSmOrange indeholdende pCS2 + plasmid under anvendelse af Notl-restriktionsenzym ifølge producentens anvisninger.
Bemærk: Udfør de næste skridt ved hjælp af passende beskyttelse, såsom handsker og kittel for at forebygge mRNA forurening og nedbrydning. - Oprens lineariseret DNA under anvendelse af et PCR-oprensningskit eller phenol-chloroform baserede metoder i overensstemmelse med producentens protokoller.
- Brug 1 ug lineariseret template-DNA for SP6-mRNA-transkription ifølge producentens anvisninger.
- Fjern DNA ved tilsætning af 1,0 U RNase-frit DNasel i 10-20 minutter ved 37 ° C.
- Rense mRNA under anvendelse af en RNA rense Kit ifølge producentens protokol.
- At øge mRNA renhed og koncentration, udfælde mRNA ved tilsætning af 6 pi natriumacetat (3,0 M, pH 5,2) og 150 pi 96% ethanol. Inkubér mKOMBINERET opløsning ved -20 ° C i mindst 30 minutter og op til 24 timer.
- Opsaml mRNA ved spinding opløsningen ved 18,407 xg i 45 minutter ved 4 ° C. Kassér væsken og resuspender mRNA i 150 pi 70% ethanol. Blandes og centrifugeres opløsningen i yderligere 15 minutter ved 4 ° C. Kassér væsken, tørre pelleten i 5 minutter på is og resuspenderes mRNA i 20 pi ultrarent RNase-frit vand.
- Vurdere koncentrationen og renheden af mRNA ved fotometrisk måling af en 1: 100 mRNA fortynding (1 pi mRNA i 99 pi ultrarent RNase frit vand).
- For kortvarig opbevaring, holde mRNA løsning ved -20 ° C. For langtidsopbevaring, holde mRNA ved -80 ° C.
2. H2B-PSmOrange mRNA mikroinjektion i zebrafisk embryoer
- Opsætning parring par aftenen før injektion under anvendelse tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) dobbelt transgene fisk (eller enhver anden GFP transgene fisk). Efterlad fisken adskilt ved at placere et afstandsstykkemellem dem for at kontrollere, hvornår den parring.
- Fjern afstandsstykket om morgenen af injektion og lad fisken mate i 20 min.
- Under parring tid, fortyndes H2B-PSmOrange mRNA til den endelige koncentration på 130 pg / nl (i RNase-frit vand) og overførsel 6 pi injektionsopløsning til en mikroinjektion kapillær anvendelse af en microloader spids. Kontroller indsprøjtning volumen med en kalibreret objektglas. Juster indsprøjtningstryk at injicere 2 nl mRNA-opløsning (260 pg).
- Saml æggene i en steriliseret plastik petriskål indeholdende 1x Embryo (E3) medium.
- Overfør 20 til 30 embryoer til en injektion skålen ved anvendelse af en plast pasteurpipette.
- Injicer 2 nl mRNA indeholdende opløsning i cellen eller lige under cellen i blommen i et-celle stadium 11.
- Overfør injicerede embryoer i en petriskål indeholdende 1x E3 medium, fjerne ubefrugtede eller ikke normalt udvikle embryoner og dyrke dem ved 28 ° C.
Bemærk: Let beskyttelse of embryonerne er ikke påkrævet under hele forsøget. - Hæv zebrafisk embryoner i 1x E3-medium og tilsæt 0,2 mM PTU (1-phenyl-2 thiourinstof) efter gastrulation at inhibere pigmentering. Skift mediet to gange om dagen for at minimere risikoen for bakterielle forureninger.
3. Embryo Indlejring
- Vælg GFP (grønt) og PSmOrange (orange / rød) co-udtrykkende embryoer ved anvendelse af et binokulært mikroskop udstyret med et fluorescens-lampe og passende emissionsfiltre. Overfør de positive embryoner i en steril petri-skål indeholdende 1x E3-medium.
- Dechorionate embryoner under et stereomikroskop med en pincet 12.
- Overførsel ét embryon et 1,5 ml rør indeholdende 1,0 ml forvarmet 1,0% lavt smeltepunkt agarose (LMA) fremstillet i ultrarent vand ved hjælp af en cut-tip pipette (P200). Bemærk: Varm LMA til 80 ° C og køle ned i 3-5 minutter ved stuetemperatur, før indlejring embryoet.
- Overfør embryo i 150 pi LMA ind i enkamre dækglas og justere fosterets orientering, f.eks dorsale side ned i eksperimentet beskrevet for den inverterede konfokal laser scanning mikroskop A1R + (eller enhver anden egnet mikroskop), med en fin plastik tip. Når LMA er polymeriseret, fylde kammeret med fisk vand indeholdende 0,2 mM PTU og 0,02% ethyl-3-aminobenzoat-methansulfonat (tricaine) til anæstesi.
- Før billeddannelse af prøven, vente 15 min for at fastslå virkningen af tricaine. Den anæstesi forhindrer embryo bevægelser, som kan overvåges ved hjælp af et stereomikroskop udstyret med lysfelt belysning.
Bemærk: Kamrene kan genbruges to gange.
4. PSmOrange fotokonvertering
- Anbring prøven under konfokal mikroskop og scanne prøven for at identificere området for at photoconvert bruge 488 nm og 561 nm lasere til billeddannelse GFP og PSmOrange hhv.
Bemærk: Brug den omvendte konfokal laser scanning mikroskop A1R + på den omvendte stage TiEcontrolled af mikroskop imaging software og udstyret med 488 nm, 561 nm og 640 nm lasere til fotokonvertering og billedbehandling. Imidlertid er anvendelsen bestemt ikke begrænset til dette mikroskop, så længe laser linjer for konvertering og billeddannelse er tilgængelige.- Sæt 20X luft målsætningen på plads (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
- Brug følgende mikroskop indstillinger til at detektere PSmOrange protein før fotokonvertering: 561 nm laser, 0,74 mW målt ved fokus flyet over målet.
Bemærk: Dette svarer til 40% på dette system (måling i fokusplanet er den eneste måde at bestemme den effektive strøm). Juster laser magt i henhold til eksperimentelle behov som effektiviteten af H2B-PSmOrange injektioner kan variere. - Tilføj zoomfaktorer at fremhæve det område af interesse. Højere forstørrelser reducerer erhvervelse billede tid, og derfor fototoksicitet.
- Erhverve en z-stak dækker strukturens af interesse ved hjælp af 488 nm og 561 nm lasere i sekventiel tilstand (line mode 1-> 4). Fastgør z-trin mellem 1,0 og 2,0 um. Linje gennemsnit og scan frekvens kan bruges til at optimere billedkvaliteten.
- Scan prøven og vælg området af interesse (ROI) værktøj til at fremhæve det område at photoconvert. Fastgør ROI som stimulering område. Vælg Photo Aktivering / Blegning modul, aktivere 488 nm laser ved at markere de respektive boksen og sæt 488 nm laser til 80% (1 mW lasereffekt målt ved målet). Indstil scanningen hastighed til 0,5 sek / Frame.
- Åbn fotokonvertering nytte (ND Stimulation) og angive indstillingerne fotokonvertering.
- Klik på kommandoen "Tilføj" for at angive fotokonvertering protokollen.
- Indstil "Fase" 1 i "Køb / Stimulation" menuen til "Acquisition" og angive antallet af billeder, der skal erhverves, før fotokonvertering i menuen "Loops".
- Sæt "Fase" 2 til "Stimulation "og indtaste antallet af stimulering begivenheder, der skal udføres.
- Juster "Fase" 3 som beskrevet for "Phase" 1. Eventuelt indsætte en ventetid "Fase" efter "Phase" 2 ved at indtaste tid til at vente, før den sidste runde af erhvervelse billede.
- Når alle parametre er indstillet, anvende indstillingen stimulation og køre fotokonvertering.
Bemærk: Laser magt, hyppighed af scanning og antal gentagelser for hver runde af fotokonvertering kan variere og afvige fra foster til foster. En indstilling til at starte med, er vist i tabel 1.
- Anskaf en endelig z-stack ved hjælp 488 nm, 561 nm og 640 nm lasere gælder som ovenfor indstillingerne. Sæt 640 nm laser til at visualisere den konverterede PSmOrange ved hjælp af høj laser effekt (op til 4,5 mW).
5. Afmonter Embryo fra LMA
- Fjern embryonet kammer fra mikroskopet. Fjern forsigtigt embryo fra agarose usynge pincet.
- Overfør embryonet ind i en ny steriliseret plast petriskål eller i en steriliseret 6-well-plade indeholdende 1x E3 og 0,2 mM PTU. Inkuber embryoet ved 28 ° C, indtil den ønskede udviklingstrin.
6. Analyse af skæbne Photoconverted PSmOrange Protein udtrykkende celler
- Re-indlejre embryoet som beskrevet under punkt 3.3 og 3.4.
- Anbring prøven under konfokal mikroskop og scanne prøven for at identificere photoconverted celler (640 nm) i GFP transgene struktur af interesse (488 nm).
- Anskaf en z-stack dækker strukturer af interesse ved hjælp af 488 nm, 561 nm og 640 nm lasere i sekventiel tilstand (line mode 1-> 4). Fastgør z-trin mellem 1,0 og 2,0 um. Linje gennemsnit og scan frekvens kan bruges til at optimere billedkvaliteten.
- Brug en af følgende metoder til at identificere celler, som co-express GFP og photoconverted protein.
- Skræddersyet automatisk Fiji billedeJ Makro 3
- Convolve den oprindelige stak ved hjælp af "GaussianBlur" plugin (→ Proces → Filtre → GaussianBlur) og trække de glatte stakke fra den originale ved hjælp af "Image Calculator" plugin (→ Proces → Billede Calculator). Brug dette trin for at visualisere strukturer af interesse og reducere beregningstiden for analysen.
- Påfør specifikke tærskler til de grønne og langt-røde kanaler for at fremhæve de photoconverted celler (→ Billede → Juster → Threshold). Brug "Analyser Partikler" værktøj til at opdage de grænseværdier områder med en passende indstilling (→ Analyze → Analyser Partikler).
- Åbn "Image Calculator" plugin og vise de overlappende ROIs i det grønne og langt-rød kanal i gul (→ Proces → Billede Calculator).
- Mikroskop imaging software til 3D evaluering af data
- Vise stakken i3D ved hjælp af visningen option show volumen (→ 3D Visualisering Menu → Show Volume View). Brug den grafiske brugerflade til at vælge de grønne, røde og langt-røde kanaler, justere lysstyrke og kontrast og beskære 3D stak for at fremhæve det photoconverted område (figur 1).
Bemærk: Lignende metoder til at analysere data er tilgængelige i de fleste af de fælles software til billedanalyse.
- Vise stakken i3D ved hjælp af visningen option show volumen (→ 3D Visualisering Menu → Show Volume View). Brug den grafiske brugerflade til at vælge de grønne, røde og langt-røde kanaler, justere lysstyrke og kontrast og beskære 3D stak for at fremhæve det photoconverted område (figur 1).
- Skræddersyet automatisk Fiji billedeJ Makro 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer et eksempel på PSmOrange fotokonvertering systemet. Den pineal kompleks er en konserveret struktur i hvirveldyr dorsale diencephalon. Ligesom i mange andre hvirveldyr, dette kompleks består af pinealkirtlen organ i centrum af diencephalon og de venstre parapineal celler. Elegant men tidskrævende uncaging forsøg viste, at parapineal celler har oprindelse i den forreste del af pinealkirtlen organ 13. I tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) transgene embryoner, der både pineal og parapineal celler mærkes under udvikling. For at vurdere egnetheden af PSmOrange system, vi brugte disse embryoner til at reproducere den rapporterede pineal kompleks udvikling. 260 pg mRNA, der koder den nukleare form af PSmOrange, H2B-PSmOrange, blev injiceret i en celle trins dobbelt transgene embryoner at udtrykke proteinet i alle cellekerner. Injicerede embryoer blev inkuberet ved 28 ° C, indtil 24 timer efter fertilization (HPF), udvalgt til GFP og stærk H2B-PSmOrange ekspression og indlejret i LMA i et kamre dækglas system med den dorsale side orienteret mod bunden. Prøven blev anbragt under en omvendt konfokal laser scanning mikroskop kontrolleres af mikroskop imaging software og udstyret med 488 nm, 561 nm og 640 nm lasere og en 20X luft mål for fotokonvertering og sporing. To celle klynger i den forreste del af pinealkirtlen blev photoconverted og straks afbildet (figur 1A - F). De photoconverted celler kunne visualiseres ved hjælp af 640 nm laser (langt rød - Figur 1C), men ikke med 561 nm laser (orange / rød - Figur 1B). GFP-ekspression i disse celler var oprindeligt også reduceret på grund af fotoblegning (figur 1A, 1D, 1F). Ved 52 HPF blev påvist GFP og H2B-PSmOrange i photoconverted H2B-PSmOrange protein udtrykkende celler (figur 1A '- F'). Faktisk et par af disse celler dannede parapineal på venstre side af hjernen (pilespidser i figur 1A '- F'). Dette resultat er i overensstemmelse med tidligere rapporter om parapineal celle oprindelse og viser anvendeligheden af PSmOrange teknik i levende hvirveldyr embryo.
. Figur 1. Identifikation af parapineal celle oprindelse ved hjælp af PSmOrange fotokonvertering systemet i levende zebrafisk embryoner (A - F ') Dorsal synspunkter med anterior til toppen fokuseret på dorsale diencephalon af en tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) transgene embryon fremhæve pinealkirtlen (P) og de parapineal celler (pp) ved (A - F) 26 HPF umiddelbart efter fotokonvertering og (A '- F & # 39;) 26 timer senere ved 52 HPF. Embryonet blev injiceret med mRNA, der koder H2B-PSmOrange. Billederne viser 3D-rekonstruktioner. Angivelse af (A, A ') transgene GFP, (B, B') konverteres ikke H2B-PSmOrange (rød kanal) og (C, C ') efter fotokonvertering (langt-rød kanal). Hvide stiplede cirkler fremhæve området fotokonvertering, der er blottet for orange / rød fluorescens. (D, D ') Flet alle tre kanaler (grøn, rød, langt-rød), (E, E') røde og langt-røde kanaler og (F, F ') grøn og langt-røde kanaler. (A'-F ') Hvide pilespidser fremhæve placeringen af parapineal celler, som viser grøn, orange / rød og langt-rød fluorescens. (AF) Målestokken vises i nederste højre hjørne af hvert billede.pload / 53604 / 53604fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
| Fase | Antal Loop | Aktive lasere |
| acquistion | 1 cyklus | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
| Stimulation | 15 til 30 cykler | 488 nm |
| Modning | 1 min | # |
| acquistion | 1 cyklus | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
Tabel 1: Betingelser for H2B-PSmOrange fotokonvertering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transgene embryoner med fluorescerende reportere har hjulpet fundamentalt at forstå fosterudviklingen. Imidlertid er der stadig et væsentligt behov for promotorer til at lette den specifikke visualisering af særlige strukturer. I deres fravær, forskere er afhængige af teknikker såsom fotokonvertering af fluorescerende proteiner for at finde ud af om oprindelsen og udviklingen af deres struktur af interesse. Dette vil til gengæld er en afgørende forudsætning for at identificere de molekylære mekanismer, der er involveret i dets udvikling. Tekniske fremskridt i zebrafisk felt nu muligt at erstatte FP i transgene linjer med for eksempel, photoconvertible proteiner ved hjælp af en CRISPR-Cas9 medieret knock i tilgang 14,15. Men denne teknik er relativt tidskrævende og ikke altid vellykket. I modsætning hertil anvendelsen af ubikvitært H2B-PSmOrange i GFP og muligvis andre transgene baggrunde er en ligefrem teknik til at følge celler gennem embryonic udvikling.
For eksempel oprindelsen af zebrafisk ventrale habenulae, en del af et konserveret neurale ledningssystem i den dorsale diencephalon af hvirveldyr, har været undvigende indtil for nylig, og dermed ingen genetisk kaskade underliggende dens udvikling blev afsløret. Brug af PSmOrange systemet og langsigtet time-lapse-analyse for at følge migrerende celler, kunne vi vise, at i modsætning til de dorsale habenular kerner, som har oprindelse venstre og højre ved siden af epifysen, ventrale habenular neuroner udvikler posterior til denne region i thalamus 3. Denne viden gav os derefter til at identificere den afgørende funktion af den kanoniske Wnt signalering nedstrøms gen Tcf7l2 for ventrale habenular neuron udvikling.
Anvendelsen af photoconvertible PSmOrange systemet er enkelt, hurtigt og har den fordel i forhold photoactivatible proteiner, embryoner kan udvælges til stærk proteinekspression før belysning. Syntetisk mRNA koder for H2B-PSmOrange injiceres i GFP-transgene embryon til ubikvitært udtrykker den orange fluorescerende protein i alle kerner. Vi har ikke fundet nogen bivirkninger ved injektion, og proteinet er stabilt i mindst 96 timer. Proteinet derefter photoconverted i GFP-transgene celler i ROI ved anvendelse af en 488 nm excitation laser og embryoet kan analyseres for den nu langt rødt fluorescerende protein, som indeholder celler inden for de efterfølgende ca. 48 timer. Det er afgørende at overvåge vellykket fotokonvertering som betingelser kan variere afhængigt af udviklingsstadiet af embryoet og vævet målrettet. Mikroskopet imaging software erhverver et billede af hver kanal (grøn, rød og langt-rød) før og efter fotokonvertering. Den fotokonvertering effektivitet kan evalueres måling middelværdien intensitet fluorescens i ROI mellem de forskellige kanaler før og efter fotokonvertering. Hvis der ikke langt-rød fluorescens detekteres umiddelbart efter fotokonvertering annonceligere runder af fotoomdannelse skal anvendes. GFP blegning er almindelige efter fotokonvertering. Men den kontinuerlige oversættelse af det transgene fluorescerende protein overvinder dette problem inden for ca. 2 timer.
En skræddersyet makro til Fiji ImageJ at lette identifikation af celler, der co-udtrykker den photoconverted protein og det transgene GFP er tilgængelig 3. Fremtidig etablering af stabile transgene linjer, der udtrykker H2B-PSmOrange vil yderligere forenkle denne procedure. Det vil også lette analysen af udviklingsmæssige begivenheder efter 4 dage efter befrugtning, som kan have spændende værdi til forskning områder som væv regenerering. Desuden vil kombinationen af moderen udtrykker PSmOrange transgene og time-lapse billeddannelse 16 være et effektivt redskab til at undersøge celle vandrende begivenheder begynder inden gastrulation på en enkelt celle niveau. Yderligere anvendelser kan omfatte udveksling af den H2B nukleare tag med, feller fx GAP43 at visualisere cellemembraner og potentielt axoner i udviklingslandene embryo.
En begrænsning af denne teknik er, at zygotisk protein kun begynder at blive udtrykt efter gastrulation og er derfor ikke anvendelse på analysen af gastrulation processer. Det skal også tages i betragtning, at det er temmelig vanskeligt at photoconvert proteinet i celler placeret dybt i embryoet. Fotokonvertering indstillinger skal tilpasses den høje laser power og relativt lang stimulation nødvendige tid til fotokonvertering kan medføre vævsskader, som kræver nøje overvågning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| Plastic Pasteur | alpha laboratories | LW4000 | |
| Original H2B-PSmOrange Plasmid | Addgene | 31920 | The plasmid described in the paper is available in the Carl lab |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Forceps (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| Nikon PLAN Apo λ 20X air objective | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) | Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging | No Number |
References
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
- Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
- Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling (2015).
- Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
