Protocol
1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro transcriptie en mRNA Purification
- Lineariseren de H2B-PSmOrange bevattende pCS2 + plasmide met de NotI restrictie-enzym volgens instructies van de fabrikant.
Opmerking: Voer de volgende stappen met behulp van passende bescherming, zoals handschoenen en een laboratoriumjas aan mRNA vervuiling en degradatie te voorkomen. - Zuiver het DNA gelineariseerd met behulp van een PCR Purification kit of fenol-chloroform gebaseerde methoden volgens de protocollen van de fabrikant.
- Met 1 ug gelineariseerd template DNA voor Sp6-mRNA transcriptie volgens de instructies van de fabrikant.
- Verwijderen DNA door het toevoegen van 1,0 U RNase-vrije DNaseI gedurende 10-20 min bij 37 ° C.
- Schoonmaken van het mRNA met behulp van een RNA opruimen kit volgens het protocol van de fabrikant.
- MRNA zuiverheid en concentratie te verhogen, het mRNA precipiteren door toevoeging van 6 pl natriumacetaat (3,0 M, pH 5,2) en 150 pl 96% ethanol. Incubeer de mEMENGDE oplossing bij -20 ° C gedurende ten minste 30 min en tot 24 uur.
- Verzamel de mRNA door het draaien van de oplossing bij 18,407 g gedurende 45 min bij 4 ° C. Gooi de vloeistof en resuspendeer de mRNA in 150 pl 70% ethanol. Meng en centrifugeer de oplossing gedurende nog 15 min bij 4 ° C. Gooi de vloeistof, droog de pellet gedurende 5 minuten op ijs en resuspendeer de mRNA in 20 ul ultrapuur RNase vrij water.
- Beoordeel de concentratie en zuiverheid van het mRNA door fotometrische meting van een 1: 100 verdunning mRNA (1 pl mRNA in 99 ui RNase vrij ultrazuiver water).
- Voor de korte termijn opslag, houd de mRNA-oplossing bij -20 ° C. Voor de lange termijn opslag, houd de mRNA bij -80 ° C.
2. H2B-PSmOrange mRNA micro-injectie in zebravis embryo's
- Het opzetten van paring paren de avond voor injectie met behulp van tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) dubbele transgene vis (of een andere GFP transgene vis). Laat vis gescheiden door een spacertussen het tijdstip van paring controleren.
- Verwijder de afstandhouder in de ochtend van injectie en laat de vis partner voor 20 min.
- Tijdens de paartijd, verdunnen de H2B-PSmOrange mRNA om de uiteindelijke concentratie van 130 pg / nl (in RNase gratis water) en de overdracht 6 pl injectie oplossing in een micro-injectie capillair met behulp van een microloader tip. Controleer de injectie volume met een gekalibreerde glasplaatje. Stel de inspuitdruk tot 2 nl mRNA-oplossing (260 pg) geïnjecteerd.
- Verzamel de eieren in een gesteriliseerde plastic petri-schaaltje met 1x Embryo (E3) medium.
- Transfer 20 tot 30 embryo's om een injectie schotel met een kunststof pasteurpipet.
- Injecteer 2 nl mRNA bevattende oplossing in de cel of net onder de cel in de dooier op één-cellig stadium 11.
- Transfer geïnjecteerde embryo's in een petri-schaaltje met 1x E3 medium, verwijderen of onbevruchte niet normaal ontwikkelende embryo en ze groeien bij 28 ° C.
Opmerking: Lichte bescherming of het embryo niet vereist gedurende het experiment. - Verhogen zebravis embryo 1x E3 en na nog gastrulatie voeg 0,2 mM PTU (1-fenyl-2 thioureum) pigmentatie remmen. Verander het medium tweemaal per dag om het gevaar van bacteriële verontreinigingen te minimaliseren.
3. Embryo Embedding
- Selecteer het GFP (groen) en PSmOrange (oranje / rood) co-expressie embryo met een binoculaire microscoop uitgerust met een fluorescentielamp en passende emissiefilters. Breng de positieve embryo's in een steriele petri-schaaltje met 1x E3 medium.
- Dechorionate embryo's onder een stereomicroscoop behulp van een tang 12.
- Transfer één embryo in een 1,5 ml buisje met 1,0 ml voorverwarmde 1,0% laag smeltpunt agarose (LMA) in ultrapuur water bereid door het gebruik van een cut-tip pipet (P200). Opmerking: Verwarm de LMA tot 80 ° C en afkoelen gedurende 3-5 minuten bij kamertemperatuur vóór inbedding het embryo.
- Breng de embryo in 150 pl in een LMAchambered dekglaasje uit en richt het embryo, bijvoorbeeld dorsale zijde in de beschreven voor de omgekeerde confocale laser scanning microscoop A1R + (of elk ander geschikt microscoop) experiment met een fijne plastic tip. Als de LMA is gepolymeriseerde, vult de kamer met vis water dat 0,2 mM PTU en 0,02% ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat (tricaïne) voor anesthesie.
- Voor de beeldvorming van het monster, 15 min wachten om het effect van tricaïne bepalen. De verdoving voorkomt embryo bewegingen die kunnen worden geanalyseerd met een stereomicroscoop uitgerust met helderveld belichting.
Let op: De kamers kan twee keer worden hergebruikt.
4. PSmOrange Photoconversion
- Leg het monster onder de confocale microscoop en scan de specimen om het gebied te identificeren photoconvert behulp van 488 nm en 561 nm lasers voor respectievelijk beeldvorming GFP en PSmOrange.
Opmerking: Gebruik de omgekeerde confocale laser scanning microscoop A1R + op de omgekeerde stage TiEcontrolled de microscoop beeldverwerkingssoftware en met 488 nm, 561 nm en 640 nm lasers voor photoconversion en beeldvorming. De toepassing wordt zeker niet zolang de laserlijnen voor conversie en beeldvorming zijn beperkt tot deze microscoop.- Zet de doelstelling 20X lucht in plaats (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
- Gebruik de volgende microscoop instellingen om de PSmOrange eiwit te ontdekken voordat photoconversion: 561 nm laser, 0,74 mW gemeten aan de focus vliegtuig boven de doelstelling.
Opmerking: Dit komt overeen met 40% op dit systeem (meting in de focus vliegtuig is de enige manier om het effectieve vermogen bepalen). Stel het laservermogen volgens experimentele behoefte de efficiëntie van H2B-PSmOrange injecties kunnen variëren. - Voeg zoom factoren om het gebied van belang te benadrukken. Hogere vergrotingen verminderen beeldacquisitie tijd en dus fototoxiciteit.
- Het verwerven van een z-stack die de structuurs van belang met behulp van 488 nm en 561 nm lasers in de sequentiële modus (line modus 1-> 4). Bevestig de z-stap tussen 1,0 en 2,0 um. Gemiddelde ruwheid en scanfrequentie kan worden gebruikt om de beeldkwaliteit te optimaliseren.
- Scan de monster en selecteer de regio van belang (ROI) tool om het gebied te photoconvert markeren. Bevestig de ROI als stimulatie omgeving. Selecteer de foto Activering / Bleaching module, activeert de 488 nm laser door het controleren van de respectieve en stel de 488 nm laser 80% (1 mW laservermogen gemeten op de doelstelling). Stel de scansnelheid tot 0,5 sec / Frame.
- Open het photoconversion hulpprogramma (ND Stimulation) en geef de photoconversion instellingen.
- Klik op het commando "Add" om de photoconversion protocol op te geven.
- Stel "Phase" 1 in het menu "Acquisition / Stimulation" naar "Acquisition" en geven het aantal beelden voordat photoconversion in het menu "Loops" te verwerven.
- Set "Fase" 2 "Stimulation "en voer het nummer van de stimulatie events uit te voeren.
- Adjust "Phase" 3 zoals beschreven voor "Fase" 1. Optioneel, plaatst u een wachttijd "Phase" na "Phase" 2 Door de tijd om te wachten voor de laatste ronde van het beeld acquisitie te voeren.
- Zodra alle parameters zijn ingesteld, gelden de stimulatie-instelling en voer het photoconversion.
Let op: Laser macht, de frequentie van het scannen en het aantal iteraties voor elke ronde van photoconversion kunnen variëren en verschillen van embryo tot embryo. Een instelling beginnen wordt weergegeven in tabel 1.
- Het verwerven van een laatste z-stack met behulp van 488 nm, 561 nm en 640 nm lasers toepassen van de instellingen als hierboven. Stel de 640 nm laser om de geconverteerde PSmOrange met behulp van hoge laservermogen visualiseren (tot 4,5 mW).
5. Demonteer Embryo van LMA
- Verwijder de embryo bevattende kamer van de microscoop. Verwijder het embryo voorzichtig uit de agarose uzingen tang.
- Breng de embryo in een nieuw gesteriliseerde plastic petrischaal of in een gesteriliseerde 6-well-plaat met 1x E3 en 0,2 mM PTU. Incubeer de embryo bij 28 ° C totdat de gewenste ontwikkelingsstadium.
6. Het analyseren van het lot van photoconverted PSmOrange eiwit tot expressie brengen
- Re-insluiten het embryo, zoals beschreven in de punten 3.3 en 3.4.
- Leg het monster onder de confocale microscoop en scan de specimen photoconverted cellen (640 nm) in de GFP transgene structuur van belang (488 nm) te identificeren.
- Het verwerven van een z-stack die de structuren van belang met behulp van 488 nm, 561 nm en 640 nm lasers in de sequentiële modus (line modus 1-> 4). Bevestig de z-stap tussen 1,0 en 2,0 um. Gemiddelde ruwheid en scanfrequentie kan worden gebruikt om de beeldkwaliteit te optimaliseren.
- Gebruik een van de volgende methoden om cellen te identificeren, die co-express GFP en de photoconverted eiwit.
- automatische Custom made Fiji AfbeeldingJ Macro 3
- Convolve de oorspronkelijke stack met behulp van de "GaussianBlur" plugin (→ Proces → Filters → GaussianBlur) en trek de soepele stapels van het origineel met behulp van de "Image Calculator" plugin (→ Proces → Image Calculator). Met deze stap om de structuren van belang te visualiseren en vermindering van de berekeningstijd voor de analyse.
- Solliciteer specifieke drempels om de groene en ver-rode kanalen met het oog op de photoconverted cellen te markeren (→ Beeld → Aanpassen → Threshold). Gebruik de "Analyseer Deeltjes" tool om de drempel op te sporen met een geschikte instelling (→ analyseren → Analyseer Deeltjes).
- Open het "Beeld Calculator" plugin en de overlappende ROI in de groene en ver-rode kanaal weer te geven in het geel (→ Proces → Image Calculator).
- Microscoop imaging software voor 3D-data evaluatie
- Geef de stapel3D met behulp van de weergave optie toon volume (→ 3D-visualisatie Menu → Show Volume View). Gebruik de grafische interface om de groene, rode en ver-rode kanalen te selecteren, de helderheid en het contrast aan te passen en snijden de 3D-stack naar het photoconverted gebied (figuur 1) te markeren.
Let op: Vergelijkbare methodes voor het analyseren van de gegevens beschikbaar zijn in de meeste van de gemeenschappelijke software voor beeldanalyse.
- Geef de stapel3D met behulp van de weergave optie toon volume (→ 3D-visualisatie Menu → Show Volume View). Gebruik de grafische interface om de groene, rode en ver-rode kanalen te selecteren, de helderheid en het contrast aan te passen en snijden de 3D-stack naar het photoconverted gebied (figuur 1) te markeren.
- automatische Custom made Fiji AfbeeldingJ Macro 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 illustreert een voorbeeld van het PSmOrange photoconversion systeem. De pijnappelklier complex is een geconserveerde structuur in de gewervelde dorsale diencephalon. Zoals in vele andere gewervelde dieren, complex, bestaande uit de pijnappelklier orgel in het midden van het diencephalon en linkszijdige parapineal cellen. Elegant, maar tijdrovende uncaging experimenten toonden aan dat parapineal cellen ontstaan in het voorste deel van de pijnappelklier orgel 13. In tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) transgene embryo's, zijn beide pijnappelklier en parapineal cellen gemerkt tijdens de ontwikkeling. Om de geschiktheid van het PSmOrange systeem te beoordelen we gebruikten deze embryo's naar de gerapporteerde pijnappelklier complex ontwikkeling reproduceren. 260 pg mRNA dat codeert voor de nucleaire vorm van PSmOrange, H2B-PSmOrange, werd geïnjecteerd in één cel stadium dubbele transgene embryo's aan het eiwit in alle celkernen uit te drukken. Geïnjecteerde embryo's werden geïncubeerd bij 28 ° C tot 24 uur na fertilization (HPF), geselecteerd voor GFP en sterke H2B-PSmOrange expressie en ingebed in LMA in een chambered dekglaasje systeem met de dorsale zijde gericht naar de bodem. Het monster werd onder een omgekeerde confocale laser scanning microscoop bestuurd door microscoop imaging software en uitgerust met een 488 nm, 561 nm en 640 nm lasers en een 20X objectief voor photoconversion en het bijhouden van de lucht geplaatst. Twee celgroepen in het voorste deel van de pijnappelklier werden photoconverted onmiddellijk afgebeeld (Figuur 1 A - F). De photoconverted cellen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van de 640 nm laser (ver rood - figuur 1C), maar niet met de laser 561 nm (oranje / rood - Figuur 1B). GFP-expressie in deze cellen werd aanvankelijk ook verminderd wegens fotobleken (Figuur 1A, 1D, 1F). Op 52 HPF GFP en H2B-PSmOrange werd gedetecteerd in de photoconverted H2B-PSmOrange eiwitten tot expressie brengen (Figuur 1A '- F'). Inderdaad, een paar van deze cellen vormden de parapineal aan de linkerkant van de hersenen (pijlen in Figuur 1A - F '). Dit resultaat is in overeenstemming met eerdere rapporten over de parapineal celoorsprong en toont de toepasbaarheid van de techniek PSmOrange de levende vertebraten embryo.
. Figuur 1. Het identificeren van de parapineal cel oorsprong met behulp van de PSmOrange photoconversion systeem in levende zebravis embryo's (A - F ') Dorsale gedachten met anterior naar boven gericht op de dorsale diencephalon van een tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) transgene embryo aandacht voor de pijnappelklier (P) en de parapineal cellen (pp) bij (A - F) 26 HPF onmiddellijk na photoconversion en (A '- F & # 39;) 26 uur later op 52 hpf. Het embryo werd geïnjecteerd met mRNA dat codeert H2B-PSmOrange. De foto's tonen 3D-reconstructies. Expressie van (A, A ') transgene GFP, (B, B') niet omgezet H2B-PSmOrange (rode kanaal) en (C, C ') na photoconversion (ver-rode kanaal). Wit gestippelde cirkels markeren het gebied van photoconversion, die verstoken is van oranje / rode fluorescentie. (D, D ') samenvoegen van de drie kanalen (groen, rood, far-red), (E, E) rode en ver-rode kanalen en (F, F') groene en ver-rode kanalen. (A'-F ') Witte pijlpunten wijzen op de locatie van parapineal cellen, die groen, oranje / rood en ver-rode fluorescentie tonen. (AF) De schaal balk wordt weergegeven op de rechter benedenhoek van elke foto.Pbelasting / 53604 / 53604fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Fase | Aantal Loop | actieve Lasers |
| acquisitie | 1 cyclus | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
| stimulatie | 15-30 cycli | 488 nm |
| Rijping | 1 minuut | # |
| acquisitie | 1 cyclus | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
Tabel 1: Voorwaarden voor H2B-PSmOrange photoconversion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transgene embryo's met TL-reporters hebben fundamenteel bijgedragen aan de embryonale ontwikkeling te begrijpen. Er is echter nog een essentiële noodzaak tot promoters de specifieke visualisatie van bepaalde structuren te vergemakkelijken. In hun afwezigheid, onderzoekers vertrouwen op technieken zoals de photoconversion van fluorescerende eiwitten te weten te komen over het ontstaan en de ontwikkeling van hun structuur van belang. Hierdoor is een essentiële voorwaarde om de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling te identificeren. Technische vooruitgang bij de zebravis gebied kunnen nu ook de FP vervangen transgene lijnen met bijvoorbeeld photoconvertible eiwitten met een CRISPR Cas9-gemedieerde klop aanpak 14,15. Deze techniek is relatief tijdrovend en niet altijd succesvol. In tegenstelling, de toepassing van alom tot expressie H2B-PSmOrange in GFP en eventueel andere transgene achtergronden is straight-forward techniek om cellen door em volgenbryonic ontwikkeling.
Bijvoorbeeld, de oorsprong van de zebravis ventrale habenulae, een deel van een geconserveerd neuraal geleidingssysteem in de dorsale diencephalon van vertebraten is ongrijpbaar tot voor kort en derhalve geen genetische cascade onderliggende de ontwikkeling werd blootgelegd. Met het PSmOrange systeem en lange termijn time-lapse analyse om migrerende cellen volgen, kunnen we zien dat in tegenstelling tot de dorsale habenular kernen, die afkomstig zijn links en rechts naast de epifyse, ventrale habenular neuronen ontwikkelen posterieur van deze regio in de thalamus 3. Deze kennis konden we vervolgens naar de cruciale functie van de Wnt signalering stroomafwaarts gen TCF7L2 voor ventrale habenular neuron ontwikkeling te identificeren.
De toepassing van de photoconvertible PSmOrange systeem is eenvoudig, snel en heeft het voordeel boven fotoactiveerbare eiwitten die embryo's kunnen worden geselecteerd voor een sterke eiwitexpressie voor verlichting. synthetische mRNA dat codeert voor H2B-PSmOrange wordt geïnjecteerd in de GFP-transgene embryo naar oranje fluorescerend eiwit in alle kernen alomtegenwoordig tot expressie. We hebben geen bijwerkingen na injectie ondervonden en het eiwit is stabiel gedurende tenminste 96 uur. Het eiwit wordt vervolgens in photoconverted GFP-transgene cellen in het ROI met een 488 nm laser excitatie en het embryo kan worden geanalyseerd op de nu ver-rood fluorescerend eiwit bevattende cellen in de daaropvolgende ongeveer 48 uur. Het is essentieel voor de succesvolle photoconversion de omstandigheden kunnen variëren afhankelijk van het ontwikkelingsstadium van het embryo en het weefsel doelwit volgen. De microscoop beeldverwerkingssoftware verkrijgt een beeld van elk kanaal (groen, rood en ver-rood) voor en na photoconversion. De photoconversion efficiëntie kan worden geëvalueerd meten van de gemiddelde intensiteit van fluorescentie in de ROI tussen de verschillende kanalen voor en na photoconversion. Als er geen ver-rode fluorescentie onmiddellijk wordt gedetecteerd nadat photoconversion advertentienele ronden photoconversion moeten worden toegepast. GFP bleken is vaak voor na photoconversion. De continue vertaling van de transgene fluorescent eiwit lost dit probleem binnen ongeveer 2 uur.
Een maat voor macro Fiji ImageJ tot de identificatie van cellen die co-expressie brengen van het eiwit photoconverted en transgene GFP beschikbaar 3 verlichten. Toekomstige oprichting van stabiele transgene lijnen uiting van de H2B-PSmOrange zal deze procedure verder te vereenvoudigen. Het zal ook de analyse van ontwikkelingsstoornissen gebeurtenissen na 4 dagen na de bevruchting, die intrigerende waarde naar gebieden te onderzoeken, zoals weefselregeneratie zou kunnen hebben te vergemakkelijken. Bovendien zal de combinatie maternaal tot expressie PSmOrange transgenen en time-lapse imaging 16 een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van cellen trekkende gebeurtenissen beginnen voor gastrulatie op een enkele cel niveau. Andere toepassingen kan de uitwisseling van de H2B nucleaire tag met f omvattenof bijvoorbeeld GAP43 celmembranen en mogelijk axonen te visualiseren in de zich ontwikkelende embryo.
Een beperking van deze techniek is dat de zygote eiwit begint pas tot expressie na gastrulatie en dus niet voor die analyse van gastrulatie processen. Ook moet worden overwogen dat het vrij moeilijk om het eiwit in cellen photoconvert diep in het embryo. Photoconversion instellingen moeten worden aangepast als de hoge laservermogen en relatief lange stimulatie tijd die nodig is voor photoconversion kan leiden tot weefselbeschadiging, die zorgvuldige controle vereist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| Plastic Pasteur | alpha laboratories | LW4000 | |
| Original H2B-PSmOrange Plasmid | Addgene | 31920 | The plasmid described in the paper is available in the Carl lab |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Forceps (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| Nikon PLAN Apo λ 20X air objective | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) | Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging | No Number |
References
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
- Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
- Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling (2015).
- Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
