Protocol
1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro-Transkription und mRNA Purification
- Linearisieren die H2B-PSmOrange enthält pCS2 + Plasmid, das die NotI-Restriktionsenzym unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers.
Hinweis: Führen Sie die nächsten Schritte mit geeigneten Schutzmaßnahmen wie Handschuhe und Kittel mRNA Verschmutzung und Verschlechterung zu verhindern. - Reinige den linearisierten DNA einer PCR Purification Kit oder Phenol-Chloroform-basierte Verfahren nach Herstellerprotokollen.
- Verwenden 1 ug linearisierte Matrizen-DNA für Sp6-mRNA-Transkription nach Herstellerangaben.
- Entfernen DNA durch Zugabe von 1,0 U RNase freie DNaseI für 10-20 min bei 37 ° C.
- Clean up the mRNA eine RNA bereinigen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Zur Erhöhung der mRNA Reinheit und Konzentration, fallen die mRNA durch Zugabe von 6 ul Natriumacetat (3,0 M, pH 5,2) und 150 & mgr; l 96% Ethanol. Inkubieren Sie die mixed Lösung bei -20 ° C für mindestens 30 min und bis zu 24 Stunden.
- Sammeln Sie die mRNA, indem die Lösung bei 18,407 xg Zentrifugieren für 45 min bei 4 ° C. Entsorgen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren die mRNA in 150 ul 70% Ethanol. Mischen und Zentrifugieren der Lösung für weitere 15 min bei 4 ° C. Entsorgen Sie die Flüssigkeit, trocknet das Pellet für 5 Minuten auf Eis und resuspendieren die mRNA in 20 ul ultrareinem RNase freies Wasser.
- Bewerten Sie die Konzentration und Reinheit der mRNA durch photometrische Messung einer 1: 100-mRNA-Verdünnung (1 ul mRNA in 99 & mgr; l ultrareinem RNase freies Wasser).
- Für kurzzeitige Lagerung, halten Sie die mRNA-Lösung bei -20 ° C. Für die langfristige Lagerung, halten Sie die mRNA bei -80 ° C.
2. H2B-PSmOrange mRNA Mikroinjektion in Zebrafischembryonen
- Richten Sie Paare in der Nacht vor der Injektion Paarung mit tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) doppelt transgenen Fisch (oder jede andere GFP transgenen Fische). Lassen Sie den Fisch getrennt durch einen Abstandshalter platzierenzwischen ihnen die Zeit der Paarung zu steuern.
- Entfernen Sie die Abstandshalter am Morgen der Einspritzung und lassen die Fische Kumpel für 20 min.
- Während der Zeit der Paarung, verdünnte die H2B-PSmOrange mRNA zur endgültigen Konzentration von 130 pg / nl (in RNase freies Wasser) und Transfer 6 ul Injektionslösung in einem Mikroinjektion Kapillare eine Micro Trick. Schauen Sie sich die Einspritzmenge mit einem kalibrierten Glasträger. Stellen Sie den Einspritzdruck zu injizieren 2 nl mRNA-Lösung (260 pg).
- Sammeln Sie die Eier in eine sterilisierte Kunststoffpetrischale mit 1x Embryo (E3) Medium.
- Übertragen Sie 20 bis 30 Embryonen zu einem Einspritzschale mit einem Kunststoffpasteurpipette.
- Injizieren 2 nl mRNA Lösung in der Zelle enthalten oder direkt unter der Zelle in das Eigelb an der Ein-Zell-Stadium 11.
- Transfer injizierten Embryonen in eine Petrischale 1x E3-Medium, das Entfernen unbefruchtete oder nicht normal Embryonen und wachsen sie bei 28 ° C zu entwickeln.
Hinweis: Lichtschutz of den Embryonen nicht während des ganzen Experiments erforderlich. - Heben Zebrafischembryonen in 1x E3 Medium und fügen 0,2 mM PTU (1-Phenyl-2 Thioharnstoff) nach gastrulation Pigmentierung zu hemmen. Ändern Sie das Medium zweimal pro Tag, um die Gefahr von bakteriellen Kontaminationen zu minimieren.
3. Embryo Einbetten
- Wählen Sie das GFP (grün) und PSmOrange (orange / rot) co-exprimierenden Embryonen ein Binokular mit einem Fluoreszenz-Lampe und angemessene Emissionsfiltern. Übertragen Sie die positiven Embryonen in eine sterile Petrischale mit 1x E3 Medium.
- Dechorionate Embryonen unter einem Stereomikroskop Pinzette 12.
- Transfer eines Embryos in ein 1,5 ml Röhrchen mit 1,0 ml vorgewärmten 1,0% niedrig schmelzender Agarose (LMA) in ultrareinem Wasser hergestellt, indem ein Cut-Spitze Pipette (P200) verwendet. Hinweis: Wärmen Sie die LMA bis 80 ° C und Abkühlung für 3-5 Minuten bei Raumtemperatur, bevor der Embryo Einbettung.
- Übertragen Sie die Embryos in 150 ul LMA in einemKammerdeckgläser und passen Sie die Ausrichtung des Embryos, zum Beispiel Rückenseite nach unten in das Experiment für den invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop A1R + (oder einem anderen geeigneten Mikroskop) beschrieben, eine feine Spitze aus Kunststoff verwenden. Wenn die LMA polymerisiert wird, füllen Sie die Kammer mit Fisch Wasser, das 0,2 mM PTU und 0,02% Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat (Tricaine) für die Anästhesie.
- Bevor die Probe Bildgebung, warten Sie 15 Minuten, um die Wirkung von Tricaine zu ermitteln. Die Anästhesie verhindert Embryo Bewegungen, die ein Stereomikroskop mit Hellfeldbeleuchtung überwacht werden kann.
Anmerkung: Die Kammern zweimal wiederverwendet werden kann.
4. PSmOrange Photokonversion
- Legen Sie die Probe unter dem konfokalen Mikroskop und scannen die Probe um den Bereich zu identifizieren, um photoconvert mit 488 nm und 561 nm Laser zur Abbildung GFP und PSmOrange sind.
Hinweis: Mit der umgekehrten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop A1R + auf dem umgekehrten stage TiEcontrolled durch das Mikroskop Imaging-Software und ausgestattet mit 488 nm, 561 nm und 640 nm Laser für die Photokonversion und Bildgebung. Jedoch ist die Anwendung sicher nicht auf diese beschränkt Mikroskop solange die Laserlinien zur Umwandlung und Bild verfügbar sind.- Setzen Sie den 20X Luft Objektiv ein (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
- Verwenden Sie die folgenden Einstellungen des Mikroskops die PSmOrange Protein vor Photokonversion zu erkennen: 561-nm-Laser, 0,74 mW bei der Fokusebene über dem Ziel gemessen.
Hinweis: Diese auf diesem System bis zu 40% entspricht (in der Fokusebene messen, ist der einzige Weg, um die Wirkleistung zu bestimmen). Stellen Sie die Laserleistung nach experimentellen Anforderungen wie die Effizienz der H2B-PSmOrange Injektionen variieren. - In Zoomfaktoren den Bereich von Interesse zu markieren. Höhere Vergrößerungen reduzieren Bildaufnahmezeit und damit Phototoxizität.
- Erwerben Sie eine Z-Stack für den Aufbaus von Interesse unter Verwendung von 488 nm und 561 nm Laser im sequenziellen Modus (Zeilenmodus 1-> 4). Befestigen Sie die z-Schritt zwischen 1,0 und 2,0 um. Rauh und Scan-Frequenz kann verwendet werden, um Bildqualität zu optimieren.
- Scannen Sie die Probe und wählen Sie die Region of Interest (ROI) Werkzeug, um den Bereich zu markieren, um photoconvert. Befestigen Sie den ROI als Stimulationsbereich. Wählen Sie das Foto Aktivierung / Bleaching-Modul, aktivieren Sie die 488-nm-Laser durch das entsprechende Kontrollkästchen aktivieren und stellen Sie die 488-nm-Laser bis 80% (1 mW Laserleistung auf dem Ziel gemessen). Stellen Sie die Scan-Geschwindigkeit bis 0,5 sec / Frame.
- Öffnen Sie die Photo Dienstprogramm (ND Stimulation) und die Photo Einstellungen angeben.
- Klicken Sie auf den Befehl "Hinzufügen" die Photo Protokoll anzugeben.
- Stellen Sie "Phase" ein in der "Erwerb / Stimulation" -Menü auf "Übernahme" und geben Sie die Anzahl der Bilder vor Photo erworben werden in der "Loops" -Menü.
- Stellen Sie "Phase" 2 auf "St.imulation "und die Anzahl der Stimulationsereignisse geben durchgeführt werden.
- Stellen Sie "Phase" 3 wie für "Phase" 1. Optional beschrieben, legen Sie eine Warte "Phase" nach der "Phase" 2 durch die Zeit vor der letzten Runde der Bildaufnahme zu warten eingeben.
- Sobald alle Parameter eingestellt werden, gelten die Stimulation Einstellung und die Photo laufen.
Hinweis: Die Laserleistung, die Frequenz des Scannens und der Anzahl der Wiederholungen für jede Runde von Photo variieren und unterscheiden sich von Embryos Embryos. Eine Einstellung zu beginnen, ist in Tabelle 1 gezeigt.
- Erwerben Sie eine endgültige Z-Stapel mit 488 nm, 561 nm und 640 nm Laser, wie oben die Einstellungen zu übernehmen. Stellen Sie die 640-nm-Laser die konvertierte PSmOrange mit hoher Laserleistung (bis zu 4,5 mW) zu visualisieren.
5. Demontieren Embryo aus LMA
- Entfernen Sie den Embryo aus dem Mikroskop enthaltenden Kammer. Entfernen Sie vorsichtig den Embryo aus der Agarose usingen Zange.
- Bringen Sie den Embryo in eine neue sterilisierte Kunststoffpetrischale oder in eine sterilisierte 6-Well-Platte mit 1x E3 und 0,2 mM PTU. Inkubieren des Embryos bei 28 ° C, bis die gewünschte Stufe der Entwicklung.
6. Die Analyse der Fate of photokonvertiertem PSmOrange Protein exprimierenden Zellen
- Re-einbetten den Embryo als 3.3 und 3.4 unter den Punkten beschrieben.
- Legen Sie die Probe unter dem konfokalen Mikroskop und scannen die Probe zu photokonvertiertem Zellen (640 nm) in der GFP transgenen Struktur von Interesse (488 nm) zu identifizieren.
- Erwerben Sie eine Z-Stapel Abdecken der Strukturen von Interesse unter Verwendung von 488 nm, 561 nm und 640 nm Laser im sequenziellen Modus (Zeilenmodus 1-> 4). Befestigen Sie die z-Schritt zwischen 1,0 und 2,0 um. Rauh und Scan-Frequenz kann verwendet werden, um Bildqualität zu optimieren.
- Verwenden Sie eine der folgenden Methoden, um Zellen zu identifizieren, die Co-express GFP und die photokonvertiertem Protein.
- Maß automatische Fidschi BildJ Makro 3
- Convolve der Originalstapel die "Weichzeichnen" Plugin (→ Bearbeiten → Filter → Weichzeichnen) und subtrahieren die glatten Stapel von der ursprünglichen Verwendung der "Bild Rechner" Plugin (→ Prozess → Bildrechner) verwenden. Verwenden Sie diesen Schritt, um die Strukturen von Interesse zu visualisieren und zur Verringerung der Rechenzeit für die Analyse.
- Übernehmen bestimmte Schwellenwerte zu den grünen und dunkelroten Kanäle, um die photokonvertiertem Zellen zu markieren (→ Bild → → Stellen Threshold). Verwenden Sie den "Analyze Particles" Werkzeug, um die Schwelle Bereiche mit einem passenden Rahmen zu erkennen (→ Analysieren → Analysieren Partikel).
- Öffnen Sie die "Bild Rechner" Plugin und zeigen die überlappenden ROIs im grünen und dunkelroten Kanal in gelb (→ Prozess → Bildrechner).
- Microscope Imaging-Software für 3D-Datenauswertung
- Zeigen Sie den Stapel in3D die Show Volumen Ansichtsoption (→ 3D-Visualisierung Menü → Show Volume anzeigen) verwenden. Verwenden Sie die grafische Schnittstelle, um die grünen, roten und dunkelrotes Kanäle, die Helligkeit, den Kontrast und die Ernte der 3D-Stapel zu wählen Sie die photokonvertiertem Bereich (Abbildung 1) zu markieren.
Hinweis: Ähnliche Verfahren werden die Daten sind in den meisten der gemeinsamen Software zur Bildanalyse zu analysieren.
- Zeigen Sie den Stapel in3D die Show Volumen Ansichtsoption (→ 3D-Visualisierung Menü → Show Volume anzeigen) verwenden. Verwenden Sie die grafische Schnittstelle, um die grünen, roten und dunkelrotes Kanäle, die Helligkeit, den Kontrast und die Ernte der 3D-Stapel zu wählen Sie die photokonvertiertem Bereich (Abbildung 1) zu markieren.
- Maß automatische Fidschi BildJ Makro 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1 veranschaulicht ein Beispiel des PSmOrange Photosystem. Die Zirbeldrüse Komplex ist eine konservierte Struktur im Wirbeltier dorsalen Zwischenhirn. Wie in vielen anderen Wirbeltieren besteht dieser Komplex der Pinealorgan in der Mitte des Zwischenhirns und den linksseitigen parapineal Zellen. Elegant, aber zeitaufwendig Uncaging Experimente zeigten, dass parapineal Zellen 13 in den vorderen Teil des Pinealorgan stammen. In tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) transgenen Embryos sowohl Zirbeldrüse und parapineal Zellen während der Entwicklung gekennzeichnet. Um die Eignung der PSmOrange System bewerten verwendeten wir diese Embryonen die gemeldete Zirbeldrüse komplexen Entwicklung zu reproduzieren. 260 pg mRNA, die das Kern Form PSmOrange, H2B-PSmOrange codiert, wurde in einem Zellstadium doppelt transgenen Embryonen injiziert, um das Protein in allen Zellkernen zu äußern. Injizierten Embryonen wurden bei 28 ° C bis 24 Stunden nach fertilizat inkubiertIon (HPF), ausgewählt für GFP und starke H2B-PSmOrange Ausdruck und in LMA in einem Kammerdecksystem mit der Rückenseite nach unten orientiert eingebettet. Die Probe wurde unter einem umgekehrten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit dem Mikroskop Imaging-Software und ausgestattet mit 488 nm, 561 nm und 640 nm Laser und einem 20X Luft Ziel für Photokonversion und Tracking gesteuert platziert. Zwei Zellhaufen im vorderen Teil der Zirbeldrüse wurden photokonvertiertem und sofort abgebildet (1A - F). Die photokonvertiertem Zellen könnte unter Verwendung der 640 nm-Laser (far red - 1C) sichtbar gemacht, aber nicht mit dem 561-nm-Laser (orange / rot - 1B). GFP-Expression in diesen Zellen wurde zunächst reduziert auch durch Photobleaching (1A, 1D, 1F). Mit 52 HPF GFP und H2B-PSmOrange wurde in den photokonvertiertem H2B-PSmOrange Protein exprimierenden Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 1A '- F'). Tatsächlich ist die parapineal auf der linken Seite des Gehirns (Pfeilspitzen in 1A '- F') gebildet einige dieser Zellen. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit früheren Berichten über die parapineal Zelle Ursprung und zeigt die Anwendbarkeit der Technik PSmOrange im lebenden Wirbeltierembryo.
. Abbildung 1. parapineal Zell-Ursprung mit dem PSmOrange Photosystem Identifizierung in Zebrafischembryonen leben (A - F ') Rückenansichten mit vorderen nach oben auf der Rückenzwischenhirn eines tg konzentriert (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) transgenen Embryo Hervorhebung der Zirbeldrüse (P) und die parapineal Zellen (pp) zu (A - F) 26 hpf unmittelbar nach Photokonversion und (A '- F & # 39;) 26 Stunden später bei 52 HPF. Der Embryo wurde mit mRNA H2B-PSmOrange injiziert. Die Bilder zeigen 3D-Rekonstruktionen. Die Expression von (A, A ') transgenen GFP, (B, B') nicht H2B-PSmOrange (roter Kanal) und (C, C ') nach Photokonversion (weit-roten Kanal) umgewandelt. Weiß gepunktete Kreise markieren den Bereich der Photokonversion, die von orange / rote Fluoreszenz frei ist. (D, D ') Merge aller drei Kanäle (grün, rot, dunkelrotes), (E, E') rot und dunkelrotes Kanäle und (F, F ') grün und dunkelrotes Kanäle. (A'-F ') Weiß Pfeilspitzen die Lage der parapineal Zellen markieren, die grün zeigen, orange / rot und dunkelrote Fluoreszenz. (AF) Der Maßstab ist auf der rechten unteren Ecke von jedem Bild angezeigt.pload / 53604 / 53604fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Phase | Anzahl der Schleifen | aktive Laser |
| acquistion | 1 Zyklus | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
| Stimulation | 15 bis 30 Zyklen | 488 nm |
| Reifung | 1 Minute | # |
| acquistion | 1 Zyklus | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
Tabelle 1: Bedingungen für die H2B-PSmOrange Photokonversion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transgene Embryonen fluoreszierenden Reporter trägt grundlegend zu verstehen, die embryonale Entwicklung geholfen. Es besteht jedoch immer noch die wesentliche Notwendigkeit für Promotoren die spezifische Visualisierung von besonderen Strukturen zu erleichtern. In ihrer Abwesenheit, verlassen sich die Forscher auf Techniken wie die Photokonversion von fluoreszierenden Proteinen über den Ursprung und die Entwicklung ihrer Struktur von Interesse zu erfahren. Dies wiederum ist eine wesentliche Voraussetzung, die molekularen Mechanismen bei der Entwicklung beteiligt zu identifizieren. Mit einem CRISPR-Cas9 vermittelte Klopfen in Ansatz 14,15 Technische Fortschritte in der Zebrafisch-Feld erlauben nun die FP in transgenen Linien mit, zum Beispiel, Photokonvertierbare Proteine zu ersetzen. Allerdings ist dieses Verfahren relativ zeitaufwendig und nicht immer erfolgreich. Im Gegensatz dazu ist die Anwendung von ubiquitär exprimiert H2B-PSmOrange in GFP und möglicherweise anderen transgenen Hintergründe eine unkomplizierte Technik Zellen durch em folgenbryonic Entwicklung.
Zum Beispiel kann der Ursprung des Zebrafischbauch habenulae, ein Teil eines konservierten System neuronalen Leitungs im dorsalen Zwischenhirn der Wirbeltiere, hat bis vor kurzem und somit keine genetische Kaskade zugrunde liegenden seiner Entwicklung wurde aufgedeckt schwer gewesen. Mit dem PSmOrange System und langfristige Zeitraffer-Analyse wandernden Zellen zu folgen, konnten wir zeigen, dass im Gegensatz zu den dorsalen habenulären Kerne, die ihren Ursprung links und rechts neben der Epiphyse, ventralen habenulären Neuronen hinter dieser Region im Thalamus 3 entwickeln. Dieses Wissen erlaubt uns dann die entscheidende Funktion des kanonischen Wnt-Signal nachgeschaltete Gen TCF7L2 für ventralen habenulären Neuron Entwicklung zu identifizieren.
Die Anwendung des Photokonvertierbare PSmOrange System ist einfach, schnell und hat den Vorteil, über photoaktivierbare Proteine, die Embryonen für starke Proteinexpression vor Beleuchtung gewählt werden. synthetische mRNA-Codierung für H2B-PSmOrange in die GFP-transgenen Embryos injiziert ubiquitär die orangefarbene fluoreszierende Protein in allen Kernen auszudrücken. Es wurden keine Nebenwirkungen bei der Injektion festgestellt und das Protein mindestens 96 Stunden stabil. Das Protein wird dann in GFP-transgenen Zellen in der ROI unter Verwendung eines 488 nm Erregungslaser photokonvertiertem und der Embryo kann für die jetzt weit rot fluoreszierendes Protein analysiert werden, die Zellen innerhalb der anschließenden etwa 48 hr. Es ist wichtig, die erfolgreiche Photokonversion zu überwachen, wie Bedingungen abhängig vom Entwicklungsstadium des Embryos variieren kann und das Gewebe gezielt. Das Mikroskop Imaging-Software erwirbt ein Bild von jedem Kanal (grün, rot und dunkelrotes) vor und nach der Photokonversion. Die Photoeffizienz kann zwischen den verschiedenen Kanälen vor und nach der Photo die mittlere Fluoreszenzintensität in dem ROI ausgewertet werden messen. Wenn keine weit rote Fluoreszenz wird unmittelbar nach der Photo Anzeige erkanntliche Runden Photo angewandt werden müssen. GFP Bleichen ist üblich, nach Photokonversion. Jedoch überwindet die kontinuierliche Translation des transgenen fluorescent protein dieses Problem innerhalb von etwa 2 Std.
Ein Maß Makro für Fidschi ImageJ die Identifizierung von Zellen Co-Expression der photokonvertiertem Protein zu erleichtern und die transgene GFP ist 3 zur Verfügung. Zukünftige Etablierung stabiler transgenen Linien der H2B-PSmOrange exprimiert wird diesen Vorgang zu vereinfachen. Es wird auch die Analyse von Entwicklungsereignisse nach 4 Tagen nach der Befruchtung zu erleichtern, die faszinierende Wertebereiche zu erforschen, wie die Geweberegeneration haben könnte. Darüber hinaus wird die Kombination von maternal exprimiert PSmOrange Transgenen und Zeitraffer-Bildgebung 16 ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Zellwanderungs Ereignisse vor Gastrulation auf Einzelzellebene zu starten. Weitere Anwendungen können den Austausch der H2B Kernmarke mit, f umfassenoder beispielsweise GAP43 an Zellmembranen visualisieren und potentiell Axone in den sich entwickelnden Embryo.
Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass die zygotischen Protein beginnt erst nach der Gastrulation exprimiert werden und ist daher nicht anwendbar auf die Analyse der Gastrulation Prozesse. Es hat auch zu berücksichtigen, dass es ziemlich schwierig ist, das Protein in Zellen im Embryo tief gelegen photoconvert. Photo Einstellungen müssen wie die hohe Laserleistung angepasst werden und relativ zeit lange Stimulation für Photokonversion erforderlich zu Gewebeschäden führen, die eine sorgfältige Überwachung erfordert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| Plastic Pasteur | alpha laboratories | LW4000 | |
| Original H2B-PSmOrange Plasmid | Addgene | 31920 | The plasmid described in the paper is available in the Carl lab |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Forceps (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| Nikon PLAN Apo λ 20X air objective | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) | Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging | No Number |
References
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
- Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
- Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling (2015).
- Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
