Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

Published: February 5, 2016 doi: 10.3791/53604
Automatic Translation
1,2,3, 2, 2, 1
1Medical Faculty Mannheim, Department of Cell and Molecular Biology, Heidelberg University, 2COS and Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg, Heidelberg University, 3Excellenzcluster CellNetworks, University of Heidelberg

Protocol

1. תמלול mRNA H2B-PSmOrange במבחנה טיהור mRNA

  1. Linearize את PSmOrange H2B המכיל pCS2 + פלסמיד באמצעות אנזים הגבלה NotI פי הוראות היצרן.
    הערה: בצע את השלבים הבאים באמצעות הגנות מתאימות כגון כפפות וחלוק מעבדה על מנת למנוע זיהום והשפלה mRNA.
  2. לטהר את ה- DNA לינארית באמצעות שיטות המבוססות ערכת טיהור PCR או פנול, כלורופורם על פי פרוטוקולים של היצרנים.
  3. השתמש 1 מיקרוגרם של תבנית ה- DNA לינארית עבור שעתוק SP6-mRNA על פי הוראות היצרן.
  4. הסר DNA על ידי הוספת 1.0 U RNase חינם DNaseI במשך 10-20 דק 'ב 37 ° C.
  5. לנקות את ה- mRNA באמצעות RNA לנקות ערכה על פי פרוטוקול של היצרן.
  6. כדי להגדיל טוהר mRNA וריכוז, לזרז את mRNA על ידי הוספת 6 נתרן אצטט μl (3.0 M, pH 5.2) ו 150 μl 96% אתנול. דגירה מפתרון ixed ב -20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות עד 24 שעות.
  7. אסוף את ה- mRNA על ידי ספינינג הפתרון ב 18.407 XG במשך 45 דקות ב 4 ° C. מחק את הנוזל ו resuspend mRNA ב 150 μl 70% אתנול. מערבבים צנטריפוגות הפתרון עבור 15 דקות נוספות ב 4 ° C. מחק את הנוזל, לייבש את הגלולה במשך 5 דקות על קרח ו resuspend mRNA ב 20 מים חינם μl ultrapure RNase.
  8. להעריך את ריכוז והטוהר של mRNA על ידי מדידה photometric של דילול 1: mRNA 100 (mRNA 1 μl ב 99 μl מים חינם ultrapure RNase).
  9. עבור אחסון לטווח קצר, לשמור על פתרון mRNA ב -20 ° C. עבור אחסון לטווח ארוך, לשמור על mRNA ב -80 מעלות צלזיוס.

2. H2B-PSmOrange mRNA Microinjection לעוברי דג הזברה

  1. הגדרת ההזדווגות זוגות בלילה לפני הזריקה באמצעות TG (foxD3: GFP); TG (FLH: GFP) דג מהונדס כפול (או כל דג מהונדס GFP אחר). השאירו את הדגים מופרדים על ידי הצבת spacerביניהם כדי לקבוע את הזמן של הזדווגות.
  2. הסר את spacer בבוקר ההזרקה ולתת זוג דגים למשך 20 דקות.
  3. במהלך ההזדווגות זמן, לדלל את ה- mRNA H2B-PSmOrange לריכוז סופי של 130 pg / NL (במים חינם RNase) פתרון הזרקת μl העברת 6 לתוך נימי microinjection באמצעות קצה microloader. בדוק את עוצמת זריקה עם שקופית זכוכית מכוילת. התאם את לחץ ההזרקה להזריק 2 פתרון mRNA NL (260 pg).
  4. אסוף את הביצים לתוך צלחת פטרי פלסטיק מעוקר המכילים עובר 1x בינוני (E3).
  5. עבר 20 עד 30 עובר למנת הזרקה בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק.
  6. להזריק 2 mRNA NL המכיל פתרון לתוך התא או סתם מתחת לתא בחלמון בשלב אחד התא 11.
  7. העברת עוברים מוזרק לתוך צלחת פטרי שמכילה בינוני 1x E3, להסיר בדרך כלל מופרית או לא עוברים לפתח ולגדל אותם על 28 מעלות צלזיוס.
    הערה: o הגנת אורf עובר אינו נדרש לאורך הניסוי.
  8. תרים עוברי דג הזברה במדיום 1x E3 ולהוסיף 0.2 מ"מ PTU (1-פניל-2 thiourea) לאחר gastrulation לעכב פיגמנטציה. שינוי המדיום פעמים ביום כדי למזער את הסכנה של זיהומים חיידקיים.

3. עובר והטבעה

  1. בחר את ה- GFP (ירוק) ו PSmOrange (כתום / אדום) עובר להביע שיתוף באמצעות מיקרוסקופ משקפת מצוידת מנורת קרינה ומסנני פליטה מתאימות. מעביר את העוברים החיוביים לתוך פטרי צלחת סטרילי המכילה בינוני 1x E3.
  2. עוברים dechorionate תחת סטראו באמצעות מלקחיים 12.
  3. העברת עובר אחד בתוך שפופרת 1.5 מ"ל המכיל 1.0 מ"ל של מחומם מראש agarose התכה נמוכה 1.0% (אה"ע) שהוכנו מים ultrapure באמצעות פיפטה לחתוך קצה (P200). הערה: מומלץ לחמם את אה"ע 80 ° C ו להתקרר במשך 3-5 דקות ב RT לפני הטבעה העובר.
  4. מעבירים את העובר ב -150 אה"ע μl לתוךתאיים coverglass ולהתאים את האוריינטציה של העובר, בצד הגבי למשל למטה בניסוי שתואר על A1R מיקרוסקופ סורק לייזר confocal הפוכה + (או כל מיקרוסקופ מתאימה אחרת), באמצעות קצה פלסטיק משובח. כאשר אה"ע הוא polymerized, למלא את התא במים דגים המכיל 0.2 מ"מ PTU ו 0.02% אתיל 3-aminobenzoate methansulfonate (Tricaine) עבור הרדמה.
  5. לפני הדמיה המדגם, לחכות 15 דקות כדי לקבוע במדויק את השפעת Tricaine. ההרדמה מונעת תנועות עוברות, אשר ניתן לנטר באמצעות סטראו מצויד תאורת brightfield.
    הערה: התאים ניתן לעשות שימוש חוזר פעמים.

4. PSmOrange photoconversion

  1. מניחים את המדגם תחת מיקרוסקופ confocal ולסרוק את הדגימה כדי לזהות את האזור photoconvert באמצעות 488 ננומטר ו 561 nm לייזרים הדמיה GFP ו PSmOrange בהתאמה.
    הערה: השתמש A1R מיקרוסקופ סורק לייזר confocal הפוכה + על sta הפוכהge TiEcontrolled ידי תוכנת הדמיה מיקרוסקופ ומצוידים 488 ננומטר, 561 ננומטר ו 640 nm לייזרים עבור photoconversion והדמיה. עם זאת, היישום הוא בהחלט לא מוגבל מיקרוסקופ זה כל עוד קווי לייזר לגיור הדמיה זמינים.
    1. שים את המטרה אוויר 20X למקומו (NA: 0.75; WD: 1.0 מ"מ; FOV: 0.64 x 0.64 מ"מ).
    2. השתמש בהגדרות מיקרוסקופ הבא כדי לזהות את החלבון PSmOrange לפני photoconversion: 561 ננומטר לייזר, 0.74 mW הנמדדים המטוס מוקד מעל המטרה.
      הערה: זה מקביל ל -40% במערכת זו (מדידה במישור המוקד הוא הדרך היחידה לקבוע את כוח יעיל). התאם את עוצמת הלייזר בהתאם לצרכים ניסיוניים כמו יעילות של זריקות H2B-PSmOrange יכול להשתנות.
    3. להוסיף גורמי זום כדי להדגיש את תחומי העניין. בהגדלות גדולות להפחית את זמן רכישת תמונה ולכן phototoxicity.
  2. לרכוש Z- מחסנית כיסוי המבנההים של עניין באמצעות 488 ננומטר ו 561 nm לייזרים במצב רציף (מצב קו 1-> 4). תקן ה- z צעד בין 1.0 ו -2.0 מיקרומטר. ממוצע קו ותדיר סריקה ניתן להשתמש כדי לייעל את איכות תמונה.
  3. סרוק את המדגם לבחור את האזור של כלי עניין (ROI) כדי להדגיש את האזור photoconvert. תקן את ההחזר על ההשקעה כאזור גירוי. בחר את מודול הפעלת תמונה / הלבנה, להפעיל את הלייזר 488 ננומטר על ידי סימון התיבה המתאימה ולהגדיר את לייזר 488 ננומטר עד 80% (כוח לייזר 1 mW הנמדדים המטרה). הגדר את מהירות הסריקה ל -0.5 שניות / מסגרת.
  4. פתח את כלי העזר photoconversion (ND גירוי) וציין את ההגדרות photoconversion.
    1. הקש על הפקודה "הוסף" כדי לציין את פרוטוקול photoconversion.
    2. גדר "שלב" 1 בתפריט "רכישה / הגירוי" ל "הרכישה" ומציין את מספר התמונות להירכש לפני photoconversion בתפריט "הלולאות".
    3. גדר "שלב" 2 עד "Stimulation "והזן את מספר אירועי גירוי להתבצע.
    4. התאם "שלב" 3 כמתואר עבור "שלב" 1. לחלופין, כנס המתנה "שלב" אחרי "שלב" 2 על ידי הזנת הזמן לחכות לפני הסיבוב האחרון של רכישת תמונה.
    5. לאחר כל הפרמטרים נקבעים, להחיל את ההגדרה גירוי ולהפעיל את photoconversion.
      הערה: כוח לייזר, תדירות סריקה ומספר חזרות עבור כל סיבוב של photoconversion יכול להשתנות נבדלים העובר העובר. הגדרה להתחיל עם מוצג בטבלה 1.
  5. לרכוש Z- מחסנית הסופי באמצעות 488 ננומטר, 561 ננומטר ו 640 nm לייזרים החלת הגדרות כנ"ל. הגדר את לייזר 640 ננומטר כדי להמחיש את PSmOrange המרה באמצעות כוח לייזר גבוהה (עד 4.5 mW).

5. העובר לרדת מעל אה"ע

  1. הסר את העובר המכיל קאמרית מן מיקרוסקופ. מוציאים בזהירות את העובר מן u agaroseלשיר מלקחיים.
  2. מעבירים את העובר לתוך צלחת פטרי-פלסטיק חדש מעוקר או לתוך צלחת 6-היטב מעוקר המכיל E3 1x ו -0.2 מ"מ PTU. דגירה העובר על 28 מעלות צלזיוס עד לשלב של פיתוח הרצוי.

6. ניתוח הגורל של תאים המבטאים חלבון photoconverted PSmOrange

  1. Re-להטביע את העובר כפי שמתואר תחת נקודות 3.3 ו -3.4.
  2. מניחים את המדגם תחת מיקרוסקופ confocal ולסרוק את הדגימה כדי לזהות תאים photoconverted (640 ננומטר) במבנה מהונדס GFP עניין (488 ננומטר).
  3. לרכוש Z- מחסנית מכסה את המבנים של העניין באמצעות 488 ננומטר, 561 ננומטר ו 640 nm לייזרים במצב רציף (מצב קו 1-> 4). תקן ה- z צעד בין 1.0 ו -2.0 מיקרומטר. ממוצע קו ותדיר סריקה ניתן להשתמש כדי לייעל את איכות תמונה.
  4. השתמש באחת מהשיטות הבאות כדי לזהות תאים, אשר GFP שיתוף מפורש ואת חלבון photoconverted.
    1. מותאם ללקוח תמונת פיג'י אוטומטית3 J מאקרו
      1. שזירת ערימת מסמכי המקור באמצעות תוסף "GaussianBlur" (→ תהליך → מסנן → GaussianBlur) ולחסר את הערימות החלקות מהמקור באמצעות תוסף "מחשבון תמונה" (Image מחשבון → תהליך →). את הצעד הזה כדי לחזות מבנים של עניין ולהפחית את הזמן חישובית לניתוח.
      2. החל סף ספציפי הערוצים הירוקים ומרחיקים בצבע האדום על מנת להדגיש את תאי photoconverted (→ תמונה → התאם → סף). השתמש באפשרות "לנתח חלקיקים" כדי לזהות את תחומי סף עם הגדרה מתאימה (→ לנתח → לנתח חלקיקים).
      3. פתח את תוסף "מחשבון תמונה" ולהציג את ROIs חופף בערוץ ירוק ומרחיקות האדומים בצהוב (→ מחשבון תמונת → תהליך).
    2. תוכנת הדמיה מיקרוסקופ להערכת נתוני 3D
      1. הצג את המחסנית3D באמצעות אפשרות הצגת נפח הצגה (→ צפה נפח צג → תפריט ויזואליזציה 3D). השתמש בממשק הגרפי כדי לבחור את הערוצים הירוקים, אדום ומרחיקות האדומים, להתאים את הבהירות הניגודיות לחתוך את מחסנית 3D כדי להדגיש את אזור photoconverted (איור 1).
        הערה: שיטות דומות כדי לנתח את הנתונים זמינים ברוב התוכנות הנפוצות לניתוח תמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מדגים דוגמה של מערכת photoconversion PSmOrange. מתחם האצטרובל הוא מבנה משומר ב diencephalon הגבה חוליות. כמו חוליות רבות אחרות, מורכבים זה מורכב של איבר האצטרובל במרכז של diencephalon ותאי parapineal צדדי-השמאל. ניסויים משחררים רפרוף אלגנטיים אבל גוזל זמן הראו כי תאי parapineal מקורן בחלק הקדמי של איבר האצטרובל 13. ב TG (foxD3: GFP); TG (FLH: GFP) עוברים מהונדס, שני תאים האצטרובל ואת parapineal מסומנים במהלך הפיתוח. כדי לבחון את התאמת מערכת PSmOrange השתמשנו עובר אלה לשחזר את פיתוח מורכבי אצטרובל דיווח. 260 mRNA pg קידוד בצורה הגרעינית של PSmOrange, H2B-PSmOrange, הוזרק עוברת מהונדסים כפול במה אחת תאים לבטא חלבון בכל הגרעין התא. עוברים מוזרק הודגרו ב 28 ° C עד 24 שעות שלאחר fertilizatיון (hpf), שנבחר עבור GFP וביטוי H2B-PSmOrange חזק מוטבע אה"ע במערכת coverslip תאיים עם הצד הגבי אוריינטציה לכיוון החלק התחתון. הדגימה הושם תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal הפוכה בשליטת תוכנת הדמיה מיקרוסקופ ומצוידים 488 ננומטר, 561 ננומטר 640 לייזרים ננומטר מטרה אוויר 20X עבור photoconversion ומעקב. שני צבירי תאים בחלק הקדמי של האצטרובל היו photoconverted צילמו מיד (איור 1 א - ו). התאים photoconverted יכול להיות דמיינו באמצעות לייזר 640 ננומטר (הרבה אדום - תרשים 1C), אך לא עם לייזר 561 ננומטר (כתום / אדום - איור 1B). ביטוי של GFP בתאים אלה בתחילה הופחת גם בשל photobleaching (איור 1A, 1D, 1F). בשעה 52 hpf GFP ו H2B-PSmOrange זוהה התאים המבטאים H2B-PSmOrange חלבון photoconverted (איור 1A '- ו'). ואכן, כמה תאים אלה יצרו את parapineal בצד השמאלי של המוח (ראשי חץ באיור 1A '- ו'). תוצאה זו עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים על מוצאם תא parapineal ומראה את תחולתה של טכניקת PSmOrange בעובר חוליות החיים.

איור 1
. איור 1. זיהוי ממוצא תא parapineal באמצעות מערכת PSmOrange photoconversion לחיות עוברי דג הזברה (א '- ו') צפיות הגבי עם הקדמי לחלק העליון התמקד הגבי diencephalon של TG (foxD3: GFP); TG (FLH: GFP) העובר מהונדס המדגיש את האצטרובל (P) ואת תאי parapineal (עמ ') בשעה (A - F) 26 hpf מיד לאחר photoconversion ו (א' - ו '& # 39;) 26 שעות לאחר מכן ב 52 hpf. העובר הזריק mRNA קידוד H2B-PSmOrange. התמונות מראות שחזורי 3D. הביטוי של (א ', א') ה- GFP מהונדס, (B, B ') לא להמיר H2B-PSmOrange (מסלול אדום) ו- (ג, ג') לאחר photoconversion (ערוץ מרחיקות אדום). מעגלי מנוקדים לבנים להדגיש באזור photoconversion, שהוא נטול קרינה כתומה / אדום. (ד, ד ') מיזוג של כל שלושת הערוצים (ירוק, אדום, הרבה אדום), (E, E') צ'אנלס' ומרחיקות האדומה (F, F ') ערוצים ירוקים ומרחיקות אדומים. (A'-F ') ראשי חץ לבן להדגיש את המיקום של תאים parapineal, אשר מראים ירוק, כתום / אדום ומרחיקות אדום הקרינה. (AF ') סרגל סולם מוצג בפינה הימנית התחתונה של כל תמונה."Target =" pload / 53,604 / 53604fig1large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שלב מספר Loop לייזרים Active
ורכש מחזור 1 488 ננומטר, 561 ננומטר, 640 ננומטר
גְרִיָה 15 עד 30 מחזורים 488 ננומטר
הַבשָׁלָה דקה 1 #
ורכש מחזור 1 488 ננומטר, 561 ננומטר, 640 ננומטר

טבלה 1: תנאי H2B-PSmOrange photoconversion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עובר מהונדסים נושאת כתבי ניאון סייע ביסודו להבין התפתחות עוברית. עם זאת, יש עדיין הצורך החיוני עבור יזמים כדי להקל על ויזואליזציה הספציפי של מבנים בפרט. בהיעדרם, החוקרים מסתמכים על טכניקות כגון photoconversion של חלבוני ניאון כדי לברר על מוצאם והתפתחותם של מבנה האינטרס שלהם. זה בתורו הוא תנאי חיוני כדי לזהות את המנגנונים המולקולריים המעורבים בפיתוח שלה. התקדמות טכנית בתחום דג הזברה כעת לאפשר להחליף את FP בקווים מהונדסים עם, למשל, חלבוני photoconvertible באמצעות נקישה בתיווך CRISPR-Cas9 בגישת 14,15. עם זאת, טכניקה זו היא יחסית זמן רב ולא תמיד מוצלח. לעומת זאת, היישום של ubiquitously הביע H2B-PSmOrange ב GFP ואולי רקע מהונדס אחרים היא טכניקה ישר קדימה כדי לעקוב אחר תאים באמצעות emפיתוח bryonic.

למשל, את המקור של habenulae דג הזברה הגחון, חלק אחד של מערכת הולכה עצבית משומר הגבי diencephalon של בעלי חוליות, כבר החמקמק עד לאחרונה, ולכן אין מפל הגנטי שבבסיס התפתחות שלה נחשף. השימוש במערכת PSmOrange וניתוח זמן לשגות לטווח הארוך כדי לעקוב אחר תאים נודדים, נוכל להראות שבניגוד גרעיני habenular הגבה, אשר מקורן על ימין ועל שמאל סמכו epiphysis, נוירונים habenular גחון לפתח אחוריים לאזור זה בתלמוס 3. ידע זה מאפשר לנו אז לזהות את התפקיד המכריע של Wnt הקנונית איתות Tcf7l2 גנים במורד זרם לפיתוח נוירון habenular גחון.

היישום של מערכת PSmOrange photoconvertible הוא פשוט, מהיר ויש לו היתרון על פני חלבוני photoactivatible כי עוברי ניתן לבחור עבור ביטוי חלבון חזק לפני התאורה. מר סינתטיNA קידוד עבור H2B-PSmOrange מוזרק לתוך העובר GFP מהונדס כדי לבטא את חלבון פלואורסצנטי כתום בכל מקום בגוף בכל גרעינים. אנחנו לא נתקלנו בשום תופעות לוואי על הזרקת החלבון יציב במשך שעות 96 לפחות. חלבון הוא photoconverted אז בתאים GFP מהונדס ההחזר על ההשקעה באמצעות לייזר עירור 488 ננומטר העובר ניתן לנתח את החלבון עכשיו מרחיקות אדום ניאון המכיל תאים בתוך 48 שעות כ שלאחר מכן. זה קריטי כדי לפקח על photoconversion המוצלח כתנאים יכולים להשתנות בהתאם לשלב ההתפתחותי של עובר ואת הרקמה ממוקדת. תוכנת הדמית מיקרוסקופ רוכשת תמונה של כל ערוץ (ירוק, אדום ומרחיקות האדומים) לפני ואחרי photoconversion. היעילות photoconversion ניתן להעריך מדידת הקרינה בעוצמה ממוצעת ההחזר על ההשקעה בין הערוצים השונים לפני ואחרי photoconversion. אם לא קרינה מרחיקה אדומה מזוהית מייד לאחר מודעת photoconversionסיבובים ditional של photoconversion צריך להיות מיושם. הלבנת GFP נפוצה לאחר photoconversion. עם זאת, תרגום הרציף של חלבון פלואורסצנטי המהונדס מתגבר על הבעיה הזו בתוך כ -2 שעות.

מאקרו בהתאמה אישית עבור פיג'י ImageJ כדי להקל על זיהוי של תאי שיתוף המבטא את חלבון photoconverted ואת GFP המהונדס זמין 3. הקמת עתיד של קווים מהונדסים יציבה המבטאים את H2B-PSmOrange יהיה עוד יותר לפשט הליך זה. זה יהיה גם להקל על ניתוח של אירועים התפתחותיים לאחר ההפריה 4 ימים, אשר יכול להיות ערך מסקרן לחקור בתחומים כמו סיוע בשיקום הרקמות. בנוסף, שילוב של transgenics PSmOrange האימהי לביטוי הזמן לשגות הדמיה 16 יהיה כלי רב עצמה על חקירת אירועים נודדים תא החלו לפני gastrulation ברמת תא בודד. יישומים נוספים עשויים לכלול חילופי התג הגרעיני H2B עם, fאו למשל, GAP43 לדמיין קרום תא ואפשרות אקסונים בעובר מתפתח.

מגבלה אחת של טכניקה זו היא כי חלבון zygotic מתחיל רק להתבטא לאחר gastrulation ולכן הוא לא החלים על הניתוח של תהליכי gastrulation. כמו כן, יש לקחת בחשבון שזה די קשה photoconvert החלבון בתאים הממוקמים עמוק בתוך העובר. צריך להיות מותאם הגדרות photoconversion ככוח לייזר גבוהה וזמן גירוי ארוך יחסית הדרושים photoconversion עלול לגרום נזק לרקמות, המחייב מעקב צמוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PCR Purification Kit Qiagen 28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit Ambion AM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kit Qiagen 74204
Plastic Pasteur alpha laboratories LW4000
Original H2B-PSmOrange Plasmid Addgene 31920 The plasmid described in the paper is available in the Carl lab
FemtoJet Microinjector Eppendorf 5247 000.013
Forceps (5 Inox) NeoLab 2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System  Nunc 155382
Nikon A1R+ Nikon GmbH Germany No Number
Nikon PLAN Apo λ 20X air objective  Nikon GmbH Germany No Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging No Number

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
  2. Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
  3. Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
  4. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
  5. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
  6. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
  7. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
  8. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
  9. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
  10. Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
  11. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
  12. JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling (2015).
  13. Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
  14. Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
  15. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
  16. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 108 דג זברה אצטרובל photoconversion מעקב תא PSmOrange קרינה הדמיה CLSM, פיתוח
מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beretta, C. A., Dross, N., Engel,… More

Beretta, C. A., Dross, N., Engel, U., Carl, M. Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System. J. Vis. Exp. (108), e53604, doi:10.3791/53604 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter