Protocol
1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro trascrizione e mRNA Purification
- Linearizzare il H2B-PSmOrange contenente pCS2 + plasmide con l'enzima di restrizione NotI secondo le istruzioni del produttore.
Nota: eseguire i passi successivi utilizzando adeguate protezioni quali guanti e camice da laboratorio per evitare la contaminazione mRNA e il degrado. - Purificare il DNA linearizzato utilizzando un kit di purificazione o di fenolo-cloroformio PCR metodi basati secondo protocolli produttori.
- Utilizzare 1 mg di DNA modello linearizzato per Sp6-mRNA trascrizione secondo le istruzioni del produttore.
- Rimuovere DNA con l'aggiunta di 1,0 U RNasi libero DNasiI per 10-20 minuti a 37 ° C.
- Pulire l'mRNA utilizzando un RNA ripulire kit secondo il protocollo del produttore.
- Per aumentare mRNA purezza e la concentrazione, precipitare l'mRNA aggiungendo 6 microlitri di acetato di sodio (3,0 M, pH 5,2) e 150 microlitri 96% di etanolo. Incubare il msoluzione ixed a -20 ° C per almeno 30 minuti e fino a 24 ore.
- Raccogliere il mRNA facendo girare la soluzione a 18,407 xg per 45 min a 4 ° C. Eliminare il liquido e risospendere il mRNA in 150 ml 70% di etanolo. Mescolare e centrifugare la soluzione per altri 15 min a 4 ° C. Eliminare il liquido, asciugare il pellet per 5 minuti in ghiaccio e risospendere il mRNA in 20 microlitri ultrapura RNasi acqua libera.
- Valutare la concentrazione e la purezza del mRNA mediante misurazione fotometrica di una diluizione 1: 100 di mRNA (1 ml mRNA in 99 microlitri ultrapura RNasi acqua libera).
- Per la conservazione a breve termine, mantenere la soluzione mRNA a -20 ° C. Per la conservazione a lungo termine, mantenere l'mRNA a -80 ° C.
2. H2B-PSmOrange mRNA microiniezione in embrioni di zebrafish
- Impostare accoppiamento coppie la sera prima iniezione utilizzando tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) doppio pesci transgenici (o qualsiasi altro pesce transgenico GFP). Lasciare il pesce separato inserendo un distanziatoretra di essi per controllare il tempo di accoppiamento.
- Rimuovere il distanziale di mattina di iniezione e lasciare che il compagno di pesce per 20 minuti.
- Durante il tempo di accoppiamento, diluire il H2B-PSmOrange mRNA alla concentrazione finale di 130 pg / nl (in RNasi acqua libera) e il trasferimento 6 ml soluzione per l'iniezione in un capillare microiniezione utilizzando una punta microloader. Controllare il volume di iniezione con un vetrino calibrato. Regolare la pressione di iniezione per iniettare 2 soluzione di mRNA nl (260 pg).
- Raccogliere le uova in una piastra di Petri di plastica sterilizzati contenente 1x Embryo (E3) di media.
- Trasferimento da 20 a 30 embrioni per un piatto di iniezione con una pipetta di plastica Pasteur.
- Iniettare 2 mRNA nl contenenti soluzione nella cella o appena sotto la cella nel tuorlo allo stadio unicellulare 11.
- Trasferire gli embrioni iniettato in una piastra di Petri contenente medio 1x E3, rimuovere gli embrioni normalmente in via di sviluppo non fecondate o meno e crescere a 28 ° C.
Nota: la protezione della luce of embrioni non è richiesto durante l'esperimento. - Sollevare embrioni di zebrafish in media 1x E3 e aggiungere 0,2 mM PTU (1-fenil-2 tiourea) dopo gastrulation per inibire la pigmentazione. Cambiare il mezzo due volte al giorno per minimizzare il rischio di contaminazioni batteriche.
3. Embrione Embedding
- Selezionare la GFP (verde) e PSmOrange (arancione / rosso) embrioni co-esprimono usando un microscopio binoculare dotato di una lampada a fluorescenza e filtri di emissione adeguati. Trasferire gli embrioni positivi in una piastra di Petri sterile contenente medio 1x E3.
- Embrioni Dechorionate sotto uno stereomicroscopio con pinze 12.
- Trasferimento un embrione in una provetta da 1,5 ml contenente 1,0 ml di pre-riscaldato 1,0% agarosio basso punto di fusione (LMA) preparato in acqua ultrapura utilizzando una pipetta di cut-tip (P200). Nota: Riscaldare la LMA a 80 ° C e raffreddare per 3-5 minuti a temperatura ambiente prima di incorporare l'embrione.
- Trasferire l'embrione in 150 ml LMA in unchambered coprioggetti e regolare l'orientamento dell'embrione, ad esempio lato dorsale giù nell'esperimento descritto per la invertita laser confocale microscopio a scansione A1R + (o qualsiasi altro microscopio adatto), utilizzando una punta plastica fine. Quando la LMA è polimerizzato, riempire la camera con pesci d'acqua contenente 0,2 mM PTU e 0,02% di etile 3 amminobenzoato methansulfonate (Tricaine) per l'anestesia.
- Prima di imaging del campione, attendere 15 min per accertare l'effetto di Tricaine. L'anestesia impedisce i movimenti di embrioni, che possono essere monitorati utilizzando uno stereomicroscopio dotato di illuminazione campo chiaro.
Nota: Le camere possono essere riutilizzati due volte.
4. PSmOrange Fotoconversione
- Posizionare il campione sotto il microscopio confocale e scansione dei campioni per identificare l'area da photoconvert utilizzando 488 nm e 561 nm laser per l'imaging rispettivamente GFP e PSmOrange.
Nota: Utilizzare il invertito confocale a scansione laser microscopio A1R + sul STA invertitage TiEcontrolled dal software di imaging del microscopio e dotato di 488 nm, 561 nm e 640 nm laser per fotoconversione e di imaging. Tuttavia, l'applicazione non è certamente limitato a questo microscopio finché le linee laser per la conversione e l'imaging sono disponibili.- Mettere l'obiettivo di aria 20X in posizione (NA: 0,75; WD: 1,0 mm, FOV: 0,64 x 0,64 mm).
- Utilizzare le seguenti impostazioni microscopio per rilevare la proteina PSmOrange prima fotoconversione: 561 nm laser, 0.74 mW misurata in corrispondenza del piano di messa a fuoco sopra l'obiettivo.
Nota: Questo corrisponde al 40% su questo sistema (misura nel piano focale è l'unico modo per determinare la potenza effettiva). Regolare la potenza del laser in base alle esigenze sperimentali come l'efficienza delle iniezioni H2B-PSmOrange può variare. - Aggiungere fattori di zoom per evidenziare l'area di interesse. ingrandimenti maggiori riducono i tempi di acquisizione delle immagini e quindi fototossicità.
- Acquisire un z-stack che copre la strutturas di interesse utilizzando 488 nm e 561 nm laser in modalità sequenziale (modalità riga 1-> 4). Fissare la z-passo tra 1,0 e 2,0 micron. media e la frequenza di scansione possono essere utilizzate per ottimizzare la qualità dell'immagine.
- Scansione campione e seleziona la regione di interesse utensile (ROI) per evidenziare la zona per photoconvert. Fissare il ROI come area di stimolazione. Selezionare il modulo Photo Attivazione / candeggio, attivare il laser 488 nm selezionando la rispettiva casella e impostare il laser 488 nm a 80% (1 mW potenza laser misurato allo scopo). Impostare la velocità di scansione di 0,5 sec / Frame.
- Aprire l'utilità fotoconversione (ND Stimulation) e specificare le impostazioni fotoconversione.
- Fare clic sul comando "Aggiungi" per specificare il protocollo fotoconversione.
- Impostare "Fase" 1 nel menu "acquisizione / stimolazione" a "Acquisizione" e indicare il numero di immagini da acquisire prima fotoconversione nel menu "Loop".
- Impostare "Fase" 2 su "Stimulation "e inserire il numero di eventi di stimolazione da eseguire.
- Regolare "Fase" 3 come descritto per "Fase" 1. Facoltativamente, inserire una attesa "Fase" dopo "Fase" 2 inserendo il tempo di attesa prima che l'ultimo round di acquisizione delle immagini.
- Una volta impostati tutti i parametri, applicare l'impostazione stimolazione ed eseguire il fotoconversione.
Nota: potenza del laser, la frequenza di scansione e numero di iterazioni per ogni turno di fotoconversione può variare e differiscono da embrione embrione. Un ambiente per cominciare è mostrato in Tabella 1.
- Acquisire un z-stack finale utilizzando 488 nm, 561 nm e 640 nm laser che applicano le impostazioni come sopra. Impostare il laser 640 nm per visualizzare la PSmOrange convertito con alto potere del laser (fino a 4,5 mW).
5. Smontare embrione da LMA
- Rimuovere l'embrione camera di contenimento dal microscopio. Rimuovere con attenzione l'embrione dalla u agarosiocantare pinze.
- Trasferire l'embrione in una nuova plastica sterilizzati petri-piatto o in un 6-pozzetti-sterilizzati contenente 1x E3 e 0,2 mM PTU. Incubare l'embrione a 28 ° C fino alla fase di sviluppo desiderato.
6. Analizzando il destino di Photoconverted PSmOrange proteine cellule che esprimono
- Re-inserire l'embrione come descritto ai punti 3.3 e 3.4.
- Posizionare il campione sotto il microscopio confocale e la scansione del campione per identificare le cellule photoconverted (640 nm) nella struttura transgenico GFP di interesse (488 nm).
- Acquisire un z-stack che copre le strutture di interesse utilizzando 488 nm, 561 nm e 640 nm laser in modalità sequenziale (modalità riga 1-> 4). Fissare la z-passo tra 1,0 e 2,0 micron. media e la frequenza di scansione possono essere utilizzate per ottimizzare la qualità dell'immagine.
- Utilizzare uno dei seguenti metodi per identificare le cellule, che GFP co-express e la proteina photoconverted.
- Una soluzione su misura automatica Fiji ImmagineJ 3 Macro
- Convolve lo stack originale utilizzando il plugin "GaussianBlur" (→ Processo → Filtri → GaussianBlur) e sottrarre le pile lisce dall'originale utilizzando il plug-in "Immagine calcolatore" (→ Processo → calcolatore di immagine). Utilizzare questo passaggio per visualizzare le strutture di interesse e di ridurre il tempo di calcolo per l'analisi.
- Applicare soglie specifiche per i canali verde e lontano-rosso al fine di evidenziare le cellule photoconverted (→ Immagine → Regola → Soglia). Utilizzare lo strumento "Analisi Particelle" per rilevare le aree di soglia con un ambiente adatto (→ Analisi → Analisi Particelle).
- Aprire il plugin "immagine Calcolatore" e visualizzare i ROI sovrapposte nel canale verde e lontano-rosso in giallo (→ Processo → Immagine Calculator).
- software di imaging Microscopio per la valutazione dei dati 3D
- Visualizzare lo stack in3D utilizzando l'opzione di visualizzazione Mostra volume (→ Visualizzazione 3D Menu → Visualizza Volume View). Utilizzare l'interfaccia grafica per selezionare i canali verde, rosso e rosso lontano, regolare la luminosità ed il contrasto e ritagliare stack 3D per evidenziare l'area photoconverted (Figura 1).
Nota: Metodi simili per analizzare sono disponibili i dati nella maggior parte del software comune per l'analisi delle immagini.
- Visualizzare lo stack in3D utilizzando l'opzione di visualizzazione Mostra volume (→ Visualizzazione 3D Menu → Visualizza Volume View). Utilizzare l'interfaccia grafica per selezionare i canali verde, rosso e rosso lontano, regolare la luminosità ed il contrasto e ritagliare stack 3D per evidenziare l'area photoconverted (Figura 1).
- Una soluzione su misura automatica Fiji ImmagineJ 3 Macro
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Representative Results
La Figura 1 illustra un esempio del sistema PSmOrange fotoconversione. Il complesso pineale è una struttura conservata nel diencefalo dorsali vertebrati. Come in molti altri vertebrati, il complesso costituito dall'organo pineale nel centro del diencefalo e le cellule parapineal sinistre. Elegante ma in termini di tempo esperimenti uncaging hanno dimostrato che le cellule parapineal hanno origine nella parte anteriore dell'organo pineale 13. In tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) embrioni transgenici, le cellule sia pineale e parapineal sono etichettati durante lo sviluppo. Per valutare l'idoneità del sistema di PSmOrange abbiamo usato questi embrioni per riprodurre il riportata sviluppo complesso pineale. 260 mRNA codificanti PG forma nucleare di PSmOrange, H2B-PSmOrange, è stato iniettato in fase uno-Cell Double embrioni transgenici per esprimere la proteina in tutti i nuclei delle cellule. embrioni iniettati sono state incubate a 28 ° C fino a 24 ore dopo fertilization (HPF), selezionati per GFP e forte espressione H2B-PSmOrange e incorporato in LMA in un sistema a camera coprioggetto con il lato dorsale orientata verso il basso. Il campione è stato posto sotto un inverted laser confocale a scansione microscopio controllato dal software di imaging microscopio e dotato di 488 nm, 561 nm e 640 nm laser e un obiettivo d'aria 20X per fotoconversione e di monitoraggio. Due gruppi di cellule nella parte anteriore della pineale stati photoconverted e subito ripreso (Figura 1A - F). Le cellule photoconverted potrebbero essere visualizzati utilizzando il laser 640 nm (rosso lontano - Figura 1C), ma non con il laser 561 nm (arancione / rosso - Figura 1B). Espressione GFP in queste cellule è stato inizialmente ridotto anche a causa photobleaching (Figura 1A, 1D, 1F). Al 52 HPF è stato rilevato GFP e H2B-PSmOrange nelle cellule che esprimono proteine photoconverted H2B-PSmOrange (Figura 1A '- F'). Infatti, alcune di queste cellule costituito la parapineal sul lato sinistro del cervello (frecce in Figura 1A '- F'). Questo risultato è coerente con le precedenti relazioni sulla origine da cellule parapineal e mostra l'applicabilità della tecnica PSmOrange nel vivere vertebrati dell'embrione.
. Figura 1. Identificare l'origine delle cellule parapineal utilizzando il sistema PSmOrange fotoconversione in embrioni di zebrafish vivere (A - F ') vista dorsale anteriore alla parte superiore incentrata sulla dorsale del diencefalo un tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) embrione transgenico evidenziando la pineale (P) e le cellule parapineal (pp) in (A - F) 26 HPF immediatamente dopo fotoconversione e (A '- F & # 39;) 26 ore dopo a 52 HPF. L'embrione è stato iniettato con mRNA codifica H2B-PSmOrange. Le immagini mostrano ricostruzioni 3D. Espressione di (A, A ') GFP transgenici, (B, B') non convertito H2B-PSmOrange (canale rosso) e (C, C ') dopo fotoconversione (canale rosso lontano). cerchi bianco punteggiato evidenziare l'area di fotoconversione, che è privo di colore arancione / rosso fluorescenza. (D, D ') di unione di tutti e tre i canali (verde, rosso, far-rosso), (E, E') canali rosso e lontano-rosso e canali verde e lontano-rosso (F, F '). (A'-F ') frecce bianche evidenziano la posizione delle celle parapineal, che mostrano verde, arancione / fluorescenza rossa e di vasta rosso. (AF ') La barra di scala viene visualizzato nell'angolo in basso a destra di ogni immagine.PLOAD / 53604 / 53604fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Fase | Numero di Loop | Laser attivi |
| acquistion | 1 ciclo | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
| Stimolazione | 15 a 30 cicli | 488 nm |
| Maturazione | 1 minuto | # |
| acquistion | 1 ciclo | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
Tabella 1: Condizioni di H2B-PSmOrange fotoconversione.
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Discussion
embrioni transgenici portatori giornalisti fluorescenti hanno contribuito fondamentalmente a comprendere lo sviluppo embrionale. Tuttavia, vi è ancora la necessità essenziale per i promotori per facilitare la visualizzazione specifica di particolari strutture. In loro assenza, i ricercatori si basano su tecniche come la fotoconversione di proteine fluorescenti per scoprire l'origine e lo sviluppo della loro struttura di interesse. Questo a sua volta è un prerequisito fondamentale per identificare i meccanismi molecolari coinvolti nel suo sviluppo. I progressi tecnici nel campo zebrafish ora permettono di sostituire la FP in linee transgeniche con, ad esempio, le proteine fotoconvertibile utilizzando un knock mediata CRISPR-Cas9 approccio 14,15. Tuttavia, questa tecnica è relativamente molto tempo e non sempre successo. Al contrario, l'applicazione di ubiquitariamente espresso H2B-PSmOrange in GFP e, eventualmente, altri sfondi transgenici è una tecnica straight-forward per seguire cellule attraverso emsviluppo embrionali.
Per esempio, l'origine del habenulae ventrale zebrafish, una parte di un sistema di conduzione neuronale conservata nel diencefalo dorsale vertebrati, è stato sfuggente fino a poco tempo e quindi non cascata genetica sottostante suo sviluppo è stato scoperto. Utilizzando il sistema PSmOrange e analisi time-lapse a lungo termine per seguire cellule migranti, abbiamo potuto dimostrare che a differenza delle dorsali nuclei habenular, che hanno origine a destra ea sinistra adiacenti alla epifisi, ventrali neuroni habenular sviluppano posteriore a questa regione nel talamo 3. Questa conoscenza ci ha permesso quindi di identificare la funzione cruciale del Wnt canonica di segnalazione gene a valle TCF7L2 per ventrale lo sviluppo dei neuroni habenular.
L'applicazione del sistema di PSmOrange fotoconvertibile è semplice, veloce e ha il vantaggio rispetto proteine photoactivatible che gli embrioni possono essere selezionati per l'espressione della proteina forte prima illuminazione. sintetico mRNA codifica per H2B-PSmOrange viene iniettato nella dell'embrione GFP-transgenico per esprimere la proteina ubiquitariamente arancio fluorescente tutti i nuclei. Non abbiamo riscontrato alcun effetto collaterale su iniezione e la proteina è stabile per almeno 96 ore. La proteina viene poi photoconverted nelle cellule GFP-transgenico nel ROI utilizzando un laser di eccitazione 488 nm e l'embrione può essere analizzato per la proteina fluorescente ormai lontano-rosso contenente cellule entro i successivi di circa 48 ore. E 'fondamentale per monitorare la fotoconversione successo come condizioni possono variare a seconda della fase di sviluppo dell'embrione e il tessuto bersaglio. Il software di imaging microscopio acquisisce l'immagine di ciascun canale (verde, rosso e rosso lontano) prima e dopo fotoconversione. L'efficienza fotoconversione può essere valutata misurando la fluorescenza intensità media nella ROI tra i vari canali prima e dopo fotoconversione. Se nessuna fluorescenza far-rosso viene rilevato immediatamente dopo annuncio fotoconversionegiri zionali di fotoconversione devono essere applicate. GFP sbiancamento è comune dopo fotoconversione. Tuttavia, la traduzione continua della proteina fluorescente transgenica supera questo problema in circa 2 ore.
Una macro su misura per Fiji ImageJ per facilitare l'identificazione delle cellule co-esprimono la proteina photoconverted e la GFP transgenico è disponibile 3. creazione futura di linee transgeniche stabili che esprimono il H2B-PSmOrange semplificherà ulteriormente questa procedura. Esso faciliterà anche l'analisi degli eventi evolutivi dopo 4 giorni dopo la fecondazione, che potrebbero avere valore intrigante ai settori di ricerca come la rigenerazione dei tessuti. Inoltre, la combinazione di esprimere maternamente transgenici PSmOrange e time-lapse imaging 16 sarà un potente strumento per indagare cellulari eventi migratori a partire prima di gastrulazione su un unico livello cellulare. Ulteriori applicazioni possono includere lo scambio di tag nucleari H2B con, fo istanza, GAP43 di visualizzare le membrane cellulari e potenzialmente assoni nello sviluppo dell'embrione.
Una limitazione di questa tecnica è che la proteina zygotic inizia solo dopo essere espressa gastrulation e non è quindi applicabile all'analisi dei processi gastrulazione. Si deve anche considerare che è piuttosto difficile photoconvert la proteina nelle cellule situate nel profondo l'embrione. impostazioni Fotoconversione devono essere adattati come la potenza laser ad alta e il tempo relativamente lungo stimolo necessario per fotoconversione può causare danni ai tessuti, che richiede un attento monitoraggio.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| Plastic Pasteur | alpha laboratories | LW4000 | |
| Original H2B-PSmOrange Plasmid | Addgene | 31920 | The plasmid described in the paper is available in the Carl lab |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Forceps (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| Nikon PLAN Apo λ 20X air objective | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) | Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging | No Number |
References
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