Protocol
1. H2B-PSmOrange mRNAのin vitro転写およびmRNAの精製
- 製造業者の指示に従ってNotI制限酵素を用いてPCS2 +プラスミドを含むH2B-PSmOrangeを線形。
注：mRNAの汚染や劣化を防ぐために、手袋や白衣などの適切な保護を使用して、次の手順を実行します。 - 製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはフェノール - クロロホルムベースの方法を使用して線状化DNAを精製します。
- 製造元の指示に従ってSp6の-mRNA転写のための線形化の鋳型DNA1μgのを使用してください。
- 37℃で10-20分間、1.0 UのRNaseフリーのDNアーゼIを添加することにより、DNAを削除します。
- RNAを製造業者のプロトコルに従ってキットをクリーンアップを使用したmRNAをクリーンアップします。
- mRNAの純度および濃度を増加させるために、6μlの酢酸ナトリウム（3.0 M、pH5.2）を150μlの96％エタノールを添加することにより、mRNAを沈殿させます。メートルをインキュベート少なくとも30分間、および24時間まで-20℃でixedソリューション。
- 4℃で45分間18.407×gで紡糸溶液により、mRNAを収集します。液体を捨て、150μlの70％エタノール中のmRNAを懸濁します。混合し、4℃でさらに15分間この溶液を遠心分離。 、液を捨て、氷上で5分間ペレットを乾燥し、20μlの超純RNaseを含まない水でのmRNAを懸濁します。
- 100のmRNA希釈（99μlの超純RNaseを含まない水に1μlのmRNAの）：1の測光によるmRNAの濃度および純度を評価します。
- 短期保存の場合、-20℃でのmRNAのソリューションを維持します。長期保存の場合、-80℃でのmRNAを保ちます。
ゼブラフィッシュ胚に2 H2B-PSmOrange mRNAのマイクロインジェクション
- TG（foxD3：GFP）を使用して、注入前の交配ペア夜を設定します。 TG（FLH：GFP）ダブルトランスジェニック魚（または任意の他のGFPトランスジェニック魚）。スペーサーを配置することによって分離された魚を残しますそれらの間の交配の時間を制御します。
- 注射の午前中にスペーサーを取り外し、20分間の魚の伴侶をしましょう。
- 時間を交配時には、130頁の最終濃度にH2B-PSmOrangeのmRNAを希釈/ NLとmicroloaderチップを用いたマイクロインジェクションキャピラリーへの転送6μlの注射液（RNaseを含まない水で）。較正されたスライドガラスに注入量を確認してください。 2 NL mRNAの溶液（260頁）を注入する射出圧力を調整します。
- 1xの胚（E3）培地を含む滅菌プラスチックペトリ皿に卵を収集します。
- プラスチック製パスツールピペットを用いて射出皿に20〜30の胚を転送します。
- 1細胞期11で卵黄への細胞の細胞内へのまたはちょうど下の溶液を含む2 NLのmRNAを注入します。
- 1×E3培地を含むペトリ皿に移す注入された胚は、未受精か正常に発達した胚を除去し、28℃でそれらを成長させます。
注：ライトプロテクトO胚fを実験を通して必要とされていません。 - 1×E3媒体にゼブラフィッシュの胚を高め、色素沈着を抑制するために、原腸形成した後、0.2 mMのPTU（1-フェニル2チオ尿素）を追加します。細菌汚染の危険性を最小限にするために1日2回培地を変更します。
3.胚の埋め込み
- GFP（緑色）とPSmOrange（赤/オレンジ）蛍光ランプ及び適切な発光フィルターを装備した双眼顕微鏡を用いて共発現胚を選択します。 1×E3媒体を含む滅菌ペトリ皿に正の胚を移します。
- 鉗子12を用いて、実体顕微鏡下Dechorionate胚。
- カット先端ピペット（P200）を用いて、超純水中で調製予め温めておいた1.0％低融点アガロース（LMA）の1.0ミリリットルを含む1.5ミリリットルチューブに1胚を転送します。注：80°CにLMAを温め、胚を埋め込む前に、室温で3〜5分間クールダウン。
- 150μlのLMAに胚を移し微細なプラスチックチップを用いて、カバーガラスをチャンバー反転共焦点レーザー走査顕微鏡A1R +（または他の任意の適切な顕微鏡）について記載した実験においてダウン、例えば背側の胚の向きを調整します。 LMAが重合されると、麻酔のために0.2 mMのPTUと0.02％の3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩（トリカイン）を含む魚の水でチャンバーを埋めます。
- サンプルを画像化する前に、トリカインの効果を確認するために15分を待ちます。麻酔は、明視野照明を装備した実体顕微鏡を使用してモニターすることができる胚の動きを、防ぐことができます。
注チャンバは、二回再利用することができます。
4. PSmOrange光変換
- 共焦点顕微鏡下でサンプルを置き、それぞれGFPとPSmOrangeを画像化するための488 nmおよび561 nmのレーザーを使用してphotoconvertする領域を特定するために、検体をスキャンします。
注：反転STAに反転共焦点レーザー走査顕微鏡A1R +を使用GE顕微鏡イメージングソフトウェアによってTiEcontrolledと488 nmの、561 nmおよび光電およびイメージングのための640nmのレーザーを装備。しかし、アプリケーションが確実であれば変換し、イメージング用のレーザラインが利用可能であるように、この顕微鏡に限定されるものではありません。- 所定の場所に（NA：0.75; WD：1.0ミリメートル; FOV：0.64 X 0.64ミリメートル）20X空気目標を置きます。
- 客観上記の焦点面で測定された0.74ミリワット、561 nmのレーザー：光変換前PSmOrangeタンパク質を検出するために、次の顕微鏡の設定を使用します。
注：これは、このシステム上の40％に相当する（焦点面で測定することが効果的なパワーを決定する唯一の方法です）。 H2B-PSmOrange注入の効率などの実験の必要に応じてレーザパワーを調整し変更することができます。 - 関心領域を強調するためにズーム倍率を追加します。高い倍率は、画像取得時間、したがって、光毒性を減少させます。
- 被覆構造zスタックを取得488 nmおよびシーケンシャルモード（ラインモード1-> 4）で561 nmのレーザーを使用して、関心の秒。 1.0と2.0ミクロンの間のzステップを修正しました。ライン平均及び走査周波数は、画質を最適化するために使用することができます。
- サンプルをスキャンし、関心領域をphotoconvertにエリアをハイライトする（ROI）ツールを選択します。刺激領域としてROIを修正しました。写真アクティベーション/漂白モジュールを選択し、それぞれのチェックボックスをオンにして、488 nmのレーザーを活性化し、80％（客観的に測定された1 mWのレーザパワー）に488nmレーザーを設定します。 0.5秒/フレームへのスキャン速度を設定します。
- 光変換ユーティリティ（ND刺激）を開き、光変換設定を指定します。
- 光変換プロトコルを指定するには、「追加」コマンドをクリックします。
- 「取得/刺激」メニューの「取得」の「フェーズ」1に設定し、画像の数が「ループ」メニュー内の光変換前に取得することを示しています。
- セント "に設定し、「フェーズ」2imulation「刺激イベントの数を入力するには、実行されます。
- 調整 "フェーズ" 3 "相" 1.オプションで説明したように、画像取得の最後のラウンド前に待機する時間を入力して、「フェーズ」2後の待機「フェーズ」を挿入します。
- すべてのパラメータを設定したら、刺激の設定を適用し、光変換を実行します。
注意：レーザーパワーを、光変換の各ラウンドのためのスキャンおよび反復回数の周波数が変動し、胚から胚に異なる場合があります。で開始する設定を表1に示します。
- 488 nmの、561 nmおよび上記のように設定を適用する640 nmのレーザーを使用して、最終的なzスタックを取得します。 （4.5 mWまで）高いレーザパワーを使用して、変換PSmOrangeを可視化するために640 nmのレーザーを設定します。
LMAから5.ディスマウント胚
- 顕微鏡からチャンバーを含む胚を削除してください。慎重にアガロースのuから胚を削除鉗子を歌います。
- 新しい滅菌プラスチックペトリ皿にまたは1x E3および0.2 mMのPTUを含む滅菌6ウェルプレートに胚を移します。開発の所望の段階まで、28℃で胚をインキュベートします。
6. Photoconverted PSmOrangeタンパク質発現細胞の運命を分析
- ポイント3.3と3.4で説明したように、胚を再埋め込みます。
- 共焦点顕微鏡下でサンプルを置き、関心のGFPトランスジェニック構造（488 nm）の中でphotoconverted細胞（640 nm）を識別するための試料をスキャンします。
- 488 nmの、561 nmおよびシーケンシャルモード（ラインモード1-> 4）で640 nmのレーザーを使用して、関心の構造をカバーzスタックを取得します。 1.0と2.0ミクロンの間のzステップを修正しました。ライン平均及び走査周波数は、画質を最適化するために使用することができます。
- これは共発現GFPとphotoconvertedタンパク質、細胞を同定するために、次のいずれかの方法を使用します。
- カスタム作られた自動フィジーイメージJマクロ3
- コンボリューション「GaussianBlur」プラグインを使用して、元のスタック（→プロセス→GaussianBlur→フィルター）と「画像電卓」プラグイン（→プロセス→イメージ電卓）を使用して、元からのスムーズなスタックを引きます。関心の構造を視覚化し、分析のための計算時間を短縮するために、この手順を使用します。
- photoconvertedセルを強調表示するために、緑と遠赤チャンネルに特定のしきい値を適用します（→イメージ→→しきい値を調整します）。適切な設定で、閾値領域を検出するために、「粒子の分析」ツールを使用します（→粒子を分析→分析）。
- 「イメージ電卓」プラグインを開き、黄色（→プロセス→イメージ電卓）に緑と遠赤のチャンネルに重複の関心領域を表示します。
- 3Dデータ評価のための顕微鏡イメージング・ソフトウェア
- スタックを表示しますショーのボリュームビューオプション（→3Dビジュアライゼーションメニュー→表示ボリュームビュー）を使用して3D。 、緑、赤と遠赤色のチャンネルを選択明るさとコントラストを調整し、photoconvertedエリア（ 図1）を強調するために3Dスタックをトリミングするグラフィックインターフェースを使用してください。
注：データを分析するための同様の方法は、画像解析のための一般的なソフトウェアのほとんどで利用可能です。
- スタックを表示しますショーのボリュームビューオプション（→3Dビジュアライゼーションメニュー→表示ボリュームビュー）を使用して3D。 、緑、赤と遠赤色のチャンネルを選択明るさとコントラストを調整し、photoconvertedエリア（ 図1）を強調するために3Dスタックをトリミングするグラフィックインターフェースを使用してください。
- カスタム作られた自動フィジーイメージJマクロ3
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Representative Results
図1は、PSmOrange光変換システムの一例を示す図です。松果体複合体は、脊椎動物の背側間脳に保存された構造です。多くの他の脊椎動物のように、この複合体は、間脳の中心部にある松果体器官および左側parapineal細胞で構成されています。エレガントが、時間のかかるアンケージング実験はparapineal細胞が松果体臓器13の前部に由来することを示しました。 Tgの（foxD3：GFP）; TG（FLH：GFP）トランスジェニック胚は、松果体とparapineal両方の細胞は、開発中に標識されています。 PSmOrangeシステムの適合性を評価するために、我々は報告松果体複雑な開発を再現するためにこれらの胚を使用していました。 PSmOrange、H2B-PSmOrangeの核型をコードする260のPG mRNAは、すべての細胞核においてタンパク質を発現させるために1細胞期の二重トランスジェニック胚に注入しました。注入された胚を24時間後fertilizatまで28℃でインキュベートしました。イオン（HPF）、GFPと強いH2B-PSmOrangeの発現のために選択し、底部に向かって指向の背側でのチャンバーカバースリップシステムでLMAに埋め込まれました。試料は、顕微鏡イメージングソフトウェアによって制御され、488 nmで、561 nmおよび640 nmのレーザーと光変換およびトラッキングのための20X空気目的を備えた倒立共焦点レーザー走査顕微鏡下に置きました。松果体の前部にある二つの細胞クラスターはphotoconverted、すぐに（ 図1A - F）画像化しました。しかしない561 nmレーザー（オレンジ/赤- 図1B）と、 - photoconverted細胞（ 図1C遠赤色）640 nmのレーザーを用いて可視化することができました。これらの細胞におけるGFPの発現は、最初にも起因する（ 図1A、1D、1F） を光退色に減少しました。 52 HPFでGFPおよびH2B-PSmOrangeはphotoconverted H2B-PSmOrangeタンパク質を発現する細胞において検出された（ 図 1A ' - F'）。確かに、これらの細胞の数は、脳の左側にparapinealを形成し（ 図1A中の矢頭' - F'）。この結果は、parapineal細胞起源に関する以前の報告と一致していると生きている脊椎動物の胚におけるPSmOrange技術の適用可能性を示しています。
。ゼブラフィッシュの胚を生きているにPSmOrange光変換システムを使用してparapineal細胞起源の識別図1（A - F '）TGの背側間脳に焦点を当ててトップに前方と背側のビュー（foxD3：GFP）; TG（FLH：GFP）トランスジェニック胚での松果体（P）とparapineal細胞（PP）ハイライト（Aを - F）26 HPF直後光電と（A ' - F＆＃ 39;）26時間後に52 HPFで。胚は、mRNAは、H2B-PSmOrangeをコードして注射しました。写真は表示します 3D再構成。 （A、A '）トランスジェニックGFP、（B、B'）の発現がない光電（遠赤チャネル）後H2B-PSmOrange（赤チャネル）および（C、C '）を変換します。白点線の円は、赤/オレンジ色の蛍光を欠いている光変換の面積を、強調表示します。 （D、D '）すべての3つのチャネルのマージ（緑、遠赤、赤）、（E、E'）赤と遠赤チャネルおよび（F、F '）緑と遠赤チャンネル。 （A'-F '）白矢じりは緑、橙/赤と遠赤色蛍光を示しparapineal細胞の位置を強調表示します。 （AF '）スケールバーは、各画像の右下隅に表示されます。PLOAD / 53604 / 53604fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 段階 | ループの数 | アクティブレーザー |
| 集録 | 1サイクル | 488 nmで、561 nmで、640 nmの |
| 刺激 | 15 30サイクル | 488 nmの |
| 成熟 | 1分 | ＃ |
| 集録 | 1サイクル | 488 nmで、561 nmで、640 nmの |
表1：H2B-PSmOrange の光変換のための条件。
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Discussion
蛍光レポーターを有するトランスジェニック胚は、胚の発達を理解するために根本的に貢献しています。しかし、特定の構造の特定の視覚化を容易にするプロモーターに必須の必要性が依然として存在します。彼らの不在下では、研究者が興味のある構造の起源と発展について調べるために、このような蛍光タンパク質の光変換などの技術に依存しています。これにより、その発達に関与する分子機構を同定するための重要な前提条件です。ゼブラフィッシュ分野における技術の進歩は、現在のアプローチ14,15にCRISPR-Cas9媒介ノックを使用して、インスタンスのためのトランスジェニック系統、photoconvertibleタンパク質でFPを交換することができます。しかし、この技術は、比較的時間がかかり、常に成功していません。これとは対照的に、普遍的にGFPにH2B-PSmOrangeを表明し、おそらく他のトランスジェニック背景の適用は、EMを介して細胞を追跡する単純明快な技術でありますbryonic開発。
例えば、ゼブラフィッシュ腹habenulaの複数形の起源、脊椎動物の背側間脳内の保存された神経伝導系の一部は、最近ので、その開発の根底にある遺伝カスケードが明らかにされなくなるまでとらえどころのないされています。移動する細胞を追跡するためにPSmOrangeシステムと長期的タイムラプス解析を用いて、我々は左と骨端の右隣発信背側手綱核とは異なり、腹側手綱ニューロンは視床3に、この領域の後方を開発することを示すことができました。この知識は、私たちはその後、腹側手綱ニューロンの開発のために下流の遺伝子TCF7L2のシグナリング標準的なWntの重要な機能を識別することができました。
photoconvertible PSmOrangeシステムの適用は、迅速、簡単であり、胚が照明の前に強力なタンパク質発現のために選択することができる光活性化タンパク質上の利点を有します。合成はmRH2B-PSmOrangeためのNAをコードは遍在全ての核オレンジ蛍光タンパク質を発現するGFPトランスジェニック胚に注入されます。私たちは、注入時に任意の副作用を発生していないと、タンパク質は、少なくとも96時間安定です。タンパク質は、次いで、488nmの励起レーザーを用いてROIにおけるGFPトランスジェニック細胞においてphotoconvertedされ、胚は、その後、約48時間以内に細胞を含む現在遠赤色蛍光タンパク質について分析することができます。条件が胚および標的組織の発達段階に応じて変えることができるように、それは成功した光変換を監視することが重要です。顕微鏡イメージングソフトウェアは、光変換前後の各チャネル（赤、緑、遠赤）の画像を取得します。光変換効率は、光変換前後の異なるチャネル間のROIの平均強度の蛍光を測定評価することができます。何の遠赤色蛍光を光電広告直後に検出されない場合光変換のditionalラウンドが適用されなければなりません。 GFP漂白は、光変換後に一般的です。しかし、トランスジェニック蛍光タンパク質の連続的な翻訳は、約2時間以内に、この問題を克服します。
カスタムはphotoconvertedタンパク質を共発現する細胞の同定を容易にするために、フィジーImageJのマクロを作って、トランスジェニックGFPは3可能です。 H2B-PSmOrangeを発現する安定なトランスジェニック系統の将来の確立はさらに、この手順を簡素化します。また、組織再生などの分野を検索するには魅力的な価値を持っている可能性がある4日後に受精、後に発生事象の分析を容易にします。また、母性発現しPSmOrangeトランスジェニックとタイムラプスイメージング16の組み合わせは、単一細胞レベルでの原腸陥入前に出発細胞遊走のイベントを調査するための強力なツールとなります。さらに、アプリケーションがf、とH2B核タグの交換を含んでいてもよいですまたは例えば、発生中の胚において細胞膜及び潜在的に軸索を可視化するGAP43。
この技術の1つの制限は、接合体タンパク質のみが原腸形成後に発現され始めるので、原腸形成過程の分析には適用されないということです。それはまた、胚の深い位置する細胞内タンパク質をphotoconvertすることはかなり困難であることを考慮しなければなりません。光変換設定は、高いレーザパワーとして適合しなければならず、光変換のために必要な比較的長い刺激時間は注意深い監視を必要とする組織の損傷をもたらすことができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| Plastic Pasteur | alpha laboratories | LW4000 | |
| Original H2B-PSmOrange Plasmid | Addgene | 31920 | The plasmid described in the paper is available in the Carl lab |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Forceps (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| Nikon PLAN Apo λ 20X air objective | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) | Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging | No Number |
References
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
- Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
- Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling (2015).
- Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
