Summary
우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다.
Introduction
유형 III 분비 시스템 (T3SS)는 많은 그람 음성 병원균에 필수적인 독성 결정이다. 또한 바늘 착체라고도 injectisome은 진핵 숙주 세포를 1, 2로 박테리아에서 이펙터 단백질의 직접적인 전좌 필요한 중앙 T3SS 기계이다. injectisome가 외 바늘 기저 체 및 세포질 착체를 포함라고도 정렬 복잡한 3 등. 이전의 연구는 중요한 기초 체 단백질 (4, 5)의 원자 구조와 함께, 살모넬라 및 시겔로부터 정제 injectisomes의 3 차원 구조를 해명했다. 살모넬라, 시겔 라 (Shigella), 및 예 르시 니아에서 injectisomes의 동일계 구조 최근-ET 크라이 (6)에 의해 드러난 7. 그러나, 이펙터 선택 및 니들 어셈블리에 필수적인 세포질 단지는, 그 구조에 가시화되지 않았습니다.
곳을 알아내는 - 동부 MOS입니다(원위치) 네이티브 휴대 맥락 나노 해상도 기계 분자 이미징에 적합한 기술을 t. 그럼에도 불구하고, 극저온 동부에 의해 달성 해상도는 시편의 두께에 의해 제한된다. 단점을 극복하기 위해, 우리는 유 전적으로 크라이 동부 충분히 얇은 minicells을 생산하기 위해 수정 된 악성 시겔 flexneri 변형에 그대로 injectisomes 군데. 극저온 ET의 또 다른 한계는 매우 신속하게 샘플 고해상도 정보를 파괴 전자빔에 의한 조사에 시료의 감도이다. 적합한 투여 량은 전체 기울기 계 사이에 분산 될 수 있도록 그 결과, 매우 낮은 투여 량은 개개의 틸트 - 이미지에 사용된다. 이것은 매우 어려운 단층 소음의 다량에서 피사체의 구조적 특징을 구별 할 수있게하고 cryo-에 의해 달성 될 수있는 해상도를 제한 최종 재구성 된 신호 대 잡음비 (SNR)를 낮춘다 동부. Conventi이러한 푸리에 리얼 공간 필터로서뿐만 아니라, 다운 샘플링 ONAL 화상 처리는 콘트라스트를 높이기 위해 사용하지만, 고해상도 많은 정보를 필터링을 희생 할 수있다. 최근에는, 서브 - 단층 평균화 가능 크게 SNR을 증가시키고 서브 - 나노 미터 수준 (8, 9)에 어떤 경우에는 이후에 최종 해상도로했다. 착물의보다 상세한 분석이 가능해진다 계산적 함유 서브 단층 촬영 수천 추출하여 정렬하고 하위 단층 촬영을 평균 원래 단층 촬영 및 관심 분야는 높은 SNR 및 높은 해상도와 현장 복잡한 구조에서 결정합니다. 이러한 방법은 거대 분자 어셈블리와 네이티브 휴대 문맥에서의 동적 배좌에 더욱 통찰력을 제공하는 유전자 접근법과 통합 될 수있다.
일반적으로 수십 또는 서브 - 단층 촬영 천 수백 고 판정하기 위해 평균화 될 필요현장에서 -resolution 구조. 틸트 시리즈의 충분한 수의 인수는 서브 단층 촬영이 많은 빠르게 병목 현상이 생산하는 데 필요한. 그 결과 틸트 시리즈는 종종 재건하기 전에 정렬로 기울기 시리즈를 가지고 해결해야 빔에 의한 변화, 무대 반발뿐만 아니라, 확대, 회전 및 기울이기 결함에 의해 영향을 받는다. 틸트 시리즈는 일반적으로 또 다른 병목 현상을 일으키는 원인이 전통적으로 수동 기울기 시리즈의 검사를 통해 선택 추적 금 기준 마커,에 의해 정렬됩니다. 많은 소프트웨어 패키지 (11), (12), 틸트 계 정렬 및 재구성 (13) (14)와 서브 - 단층은 평균 15-18 컴퓨터 제어 전자 현미경 (10)을 통해 자동 기울기 계 획득을 위해 개발되어왔다. 이러한 패키지는 극저온 ET의 흐름에서 개별 작업을 처리, 그것은 SYSTEMA에 프로세스에 높은 레벨의 추상화를 구축하는 것이 바람직하게학적으로 하나의 파이프 라인으로 전체 체계를 간소화. 따라서 집중적으로 각 성분의 전체 구성을 유지하면서 간단한 사용자 조작을 허용 하나 반 자동화 기기에이 패키지의 번호를 정리하기위한 "tomoauto"소프트웨어 래퍼 라이브러리를 개발했다. 도서관은 온라인 원격 소스 코드 저장소 (http://github.com/DustinMorado/tomoauto)에 의해 오픈 소스, 잘 문서화 지속적으로 개발 및 사용을위한 자유롭게 사용할 수, 맞춤형 개발 또는 추가 통합이다.
이 높은 처리량 크라이 동부 파이프 라인 (S)에 그대로 injectisomes을 시각화하기 위해 이용되고있다 flexneri minicells. 1,917 단층 촬영의 총 서브 단층 (19)을 평균함으로써 결정 세포질 정렬 플랫폼을 포함한 컴퓨터 본래의 동일계 구조 고해상도을 드러내는,이 방법을 사용하여 생성 하였다. 함께 야생 타입 및 m-의 분자 모델링utant 기계는, 우리의 높은 처리량 파이프 라인은 네이티브 휴대 컨텍스트 손상 injectisome의 구조와 기능을 이해하기위한 새로운 수단을 제공한다.
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Protocol
1. Minicell 준비
- S.을 만들려면 flexneri minicells는 구조적으로 스펙 티노 마이신 내성 플라스미드 5 μL electrocompetent 스트렙토 마이신 내성 혈청 형 5A (M90T-SM) 전기에 의해 세포로 낮은 복사본에서 대장균 세포 분열 유전자 ftsQ, ftsA 및 ftsZ을 표현 플라스미드 pBS58, 1 μl를 변환 1mm 큐벳에 5 밀리 2.5 kV의에.
- 1.5 ml의 극저온 마이크로 튜브 15 % 글리세롤에서 -80 ° C에서 보관 minicell 샘플. 사용하기 위해, 4 ml의 세포를 피펫 팁을 사용하여 unthawed 마이크로 튜브에서 세포의 약 5 μl를 긁어 일시 중지 준비가되면 스펙 티노 마이신과 트립신 간장 국물 / ㎖ 농도 100 μg의 추가. 37 ° C에서 O / N 성장.
- 피펫 다시 100 μg의 / ml의 농도에 추가 스펙 티노 마이신 1.2 (200)에 ㎖의 트립신 간장 국물의 문화 2 ㎖. 늦은 로그 상에 37 ℃에서 성장한다.
- minicells, 원심 분리 농축5 분 1,000 XG에 1.3에서 문화 200 ㎖. 조심스럽게 10 분 동안 20,000 XG에 새로운 원심 분리 튜브에서 원심 분리로 상청액 분획을 붓는다. 조심스럽게 부어과 상청액 분획을 폐기하고, 부드럽게 피펫 팁을 이용하여 잔여 액체로 펠릿을 혼합하여 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 펠릿의 혼합물을 약 100 μl를 옮긴다.
2. EM 그리드 준비
- 유리 슬라이드에 R2 / 2 구멍 투성이의 탄소 필름 200 메쉬 구리 그리드 탄소 측면을 놓습니다.
주 : R2 / 2의 200 메시 그리드는 여전히 표본을지지하고 카메라의 분야에서 탄소막의 에지를 배치하는 동안 하나의 그리드 사각형은 취득하기 위해서 설정 될 수 틸트 계의 수를 최대화하도록 선택된다 원하는 배율로. 미세한 메쉬 그리드 및 R1.2 같은 작은 구멍 투성이 탄소막 / 1.3 400 메쉬 높은 배율에서 영상화 시료에 사용될 수있다; 같은 R3.5으로 더 큰 구멍 투성이의 탄소 필름 / 1 200 메쉬 사용 할 수 있습니다샘플 D는 낮은 배율에서 영상화 또는 현미경은 R1과 같은 큰 간격 탄소 에지 구멍 투성이 탄소막 없어야한다면 / 4 200 메쉬 관심 영역으로 스테이지를 정렬로부터 지역을 보호 돕기 위해 사용될 수있다 과다 노출 루틴을 집중하고 추적한다. - 글로우 방전 장치의 플랫폼에서 슬라이드를 놓습니다.
주 : 우리는 양극과 플랫폼이 진공 데시 케이 터로 가공되었고, 고주파 발생기에 의해 구동되는 내부 소자를 사용한다. 진공을 생성 한 후, 글로우 방전 그리드 1 분간 프로브에 양극과 전원에 고주파 발생기 프로브를 부착. 필요한 시간은 그리드 분 몇 초에 이르기까지 다양 글로우 방전합니다. 글로우 방전 시간을 가변하는 시료 농도없이 유리체 얼음 건조 나타나는 격자의 문제를 진단하는데 사용될 수있다. - 집게 세트와 그리드를 제거하고 집게가 탄성 B와 닫힌 된 자물쇠과.
- 1.4에서 제조 된 minicells와 microcentrifuge 관에 10 나노 콜로이드 금 용액 100 μl를 추가하고 부드럽게 손가락으로 튜브를 쓸어 넘겨 섞는다. 2.2 제조 그리드 혼합물의 새로운 피펫 장소 4 μL와.
주 : 콜로이드 금 크기와 치료의 다양한 가능 금의 크기는, 획득 된 확대 크기로 처리 될 현미경의 화소 사이즈 주어진보다 5 화소 인 것을주의해야한다 모호한 기능에 너무 크게되지 않는 반면 관심. - 플 런지 동결 장치를 준비; 액체 질소와 외부 냉동 컨테이너를 작성 후 액체 에탄과 내부 챔버를 입력합니다. 플런저로드에 그리드와 집게를 부착하고 상승 된 위치로 플런저로드를 잠급니다.
주 : 20 Iancu 등을 상업적 런지 냉동 장치의 사용을 설명하기위한 프로토콜.. - 신중 t하는 여과지를 터치함으로써 그리드를 가릴그는 즉시 그리드를 동결, 플런저로드를 해제, 그리드 및 필터 종이 분리하여 정지 필터 종이에 심지 사이의 메 니스 커스 (meniscus)까지의 샘플 놓습니다. 조심스럽게 플런저로드에서 집게를 제거하고 그리드 홀더에 그리드를 배치합니다.
- 액체 질소로 적재 영역과 흡수 펌프 용기를 충전함으로써 크라이 EM 전송 스테이션을 준비한다. 적재 영역은 그리드 홀더 적재 영역에서 현미경 시편 카트리지가 액체 질소 온도 장소되면.
- 조심스럽게 이전 Polara 현미경 이상 모델에 C 스타일의 클립 링에 작은 나사 잠금 고리 중 하나 인 잠금 링을 제거; 집게를 사용하여 카트리지에 EM 그리드를 배치하고 부드럽게 그리드를 고정하는 카트리지에 다시 잠금 고리를 다시 연결합니다.
- 현미경에서 여러 시편 홀더를 제거하고 전송 스테이션에 연결합니다. 카트리지 집게를 사용하여 표본 홀더에 카트리지를 배치적재 영역에서 홀더를 후퇴하고 현미경으로 다시 여러 시험편 홀더를 전송 거라고.
참고 :. 첸 등 21 2.1-2.9을 자세히 설명하는 시각적 프로토콜을 참조하십시오.
3. 높은 처리량 자동 기울기 시리즈 컬렉션
- 낮은 배율지도의 컬렉션
- SerialEM (10)의 '네비게이터'메뉴에서 '열기'를 클릭하여 새 탐색기 창을 엽니 다 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
- 허용 이미징 조건을 포함 그리드 사각형 찾기 (즉, 얇은 얼음, 아니 오염, 관심의 대상이) 낮은 배율에서 형광 스크린을 사용하여 (~ 2,300X minicell 표본에 대한).
참고 : [선택 :.이 단계는 전체 그리드를 montaging에 의해 SerialEM으로 자동화 할 수 있습니다, 그러나 그것은 단순히 수동으로 몇 지역을 선택 빠를 수 있습니다] - 다음 조정 50 °에 시편 홀더를 기울여 eucentric 높이로 단계를 조정XY 스테이지의 번역까지 Z-높이 기울어 기울지보기간에 최소이다.
- 그리드 광장의 중심으로 이동하고 현재 단계의 위치를 저장하기 위해 탐색기 창에서 '추가 단계 순위'버튼을 클릭합니다.
- 모두 허용 그리드 사각형 무대 위치가 저장 될 때까지 위의 단계 3.1.1-4를 계속합니다.
- '파일'메뉴에서 '새 몽타주'를 클릭하여 새 몽타주 MRC 파일을 엽니 다. 열어 몽타주 설정 대화 상자에서 전체 그리드 광장 (표준 200 메쉬 그리드에 대한 예를 들어, 10 × 10)을 취득한다 X와 Y의 조각의 수를 선택합니다. '대신 이미지 쉬프트의 스테이지를 이동'및 라디오 버튼 '조각 정렬하는 데 사용되는 상관 관계 건너 뛰기'를 8 등 높은 비닝 (binning)을 사용하여 선택합니다.
- 네비게이터 창에서 첫 번째 단계 위치를 클릭하고는 '획득'확인란을 선택하여 얻을 수 설정. 탐색기 창에서 각 단계의 위치에 대해이 작업을 반복합니다.
- 네비게이터는 '네비게이터'메뉴에서 '포인트에서 획득'를 클릭하여 대화 상자를 획득 엽니 다. '획득 맵 이미지'와 '거친 eucentricity'확인란을 선택하고 다른 모든 확인란이 체크되어 있는지 확인하십시오. 각 단계의 위치에서 몽타주를 수집하기 위해 '진행'을 클릭합니다.
- 틸트 - 시리즈 수집
- 네비게이터 창에서 획득 한지도 중 하나를 선택하고 '로드 맵'버튼을 클릭합니다.
- 네비게이터 창에서 틸트 - 시리즈를 취득하는지도에있는 버튼 '점 추가'를 선택 점을 클릭합니다. 그런 다음 버튼 '포인트 추가 중지'를 클릭합니다. 수집 된 각 맵에 대해 반복합니다.
- 카메라 메뉴에서 '매개 변수'를 선택하고 초점, 시험 및 기록 모드에 대한 매개 변수를 정의합니다. [선택 :. 데이터가 기록 모드에 대한 매개 변수를 지정할 수 있습니다 투여 량 - 분획]
- 탐색기 창에서 지점을 선택하고 '틸트 - 시리즈를 확인9; 상자를 선택합니다. 매개 변수를 선택 열리는 틸트 - 시리즈 설정 대화 창에서 틸트 시리즈 수집을 위해 원하는. 탐색기 창에서 선택된 지점의 나머지 부분에 대한 반복하지만,지도를 선택하지 마십시오.
- 탐색기 메뉴에서 다시 '지점에서 취득'을 선택합니다. 네비게이터 대화 선택 '항목을 다시 정렬', 자동 초점 '과'거친 eucentricity 취득 '예비 작업 등을하고'틸트 시리즈를 취득 '기본 작업으로, 선택'할 때 모든 열을 닫습니다 '끝에 닫기 열 밸브 점으로 수집되었다. 틸트 - 시리즈를 진행하면 각 맵의 각 지점에서 수집됩니다.
4. 높은 처리량 자동 기울기 시리즈 처리 및 재건 Tomoauto 사용
- 용량 - 분획 데이터 빔에 의한 모션의 보정 [선택 사항]
참고 : Tomoauto는 MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.ht를 사용㎖) 용량 분획 현미경 사진에서 빔 유도 동작을 제거합니다. NOTIONCORR (16)이 시스템에 설치되어 있어야합니다.- 명령을 실행 터미널에서 원래의 기울기 시리즈, 현재 작업 디렉토리에 SerialEM (10)의 출력 로그 및 개별 용량 분별 이미지 모두와 함께 :
dose_fractioned_to_stack <filename.st>
<filename.st> 처리 할 수있는 틸트 시리즈의 이름입니다.
- 명령을 실행 터미널에서 원래의 기울기 시리즈, 현재 작업 디렉토리에 SerialEM (10)의 출력 로그 및 개별 용량 분별 이미지 모두와 함께 :
- 틸트 - 시리즈의 정렬 및 재건
참고 : 기본적으로는 틸트 Tomoauto 계 자동화 기점 모델 생성, 정렬, 콘트라스트 전송 기능 (CTF), CTF 정정 (23)의 판정 처리 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) IMOD (13)을 사용하고 재건. 또한 사용자는 자동 기점 모델 생성, CTF에 대한 (IMOD에 포함) RAPTOR (24)를 사용하는 tomoauto의 옵션이 있습니다FIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) CTF을 결정하고, tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) 재건 또는 소프트웨어 패키지의 조합에 의한에 구성. 각각의 패키지로 제공이 구성뿐만 아니라, 매개 변수는 로컬 구성 파일은 또한 특정 시료에 사용 세부 파라미터 수집하기 위해 생성 될 수 있지만 가장 일반적으로 실험실에서 사용 된 값에 맞게 편집 할 수있는 전역 구성 파일에서 처리 설정 또는 개별 틸트 시리즈. 사용하고자하는 모든 패키지는 시스템에 설치되어 있어야합니다.- 현재 작업 디렉토리의 기울기 시리즈로, 터미널에서 명령을 실행
tomoauto --CTF --mode = 정렬 <filename.st> <fid_diam>
<filename.st> 처리 할 수있는 틸트 시리즈 및 <fid_diam>는 diame입니다나노 미터의 기준 마커의 터. 이 명령은 정렬과 자동 기울기 시리즈의 CTF을 추정됩니다. 이 명령 --CTF 옵션을 제거하여 CTF 처리를 건너 뛸 수있다. - 배향 처리에있어서 임의의 에러를 시각적으로 두드러진 경사 배향 계를 조사하고 명령을 실행함으로써 추정 CTF 검사 :
3dmod <파일 이름> .ali
submfg <파일 이름> _ctfplotter.com
각각, 여기서 <파일 이름> 접미사없이 기울기 시리즈의 이름입니다. 또한 얼라인먼트 품질 통계치 정량적 인 배향에 의해 생성 평균 예측 오차를 표시 tomoauto 명령의 출력을 확인. - 허용 정렬 주어진 명령을 실행하여 처리를 진행합니다 :
tomoau에 --CTF --mode = 재구성 <filename.st> <fid_diam>
4.2.1에서와 같은 사용자와 대체. 이 명령은, CTF를 해결 기울기 시리즈에서 기준 마커를 지우고 재건을 계산합니다. 다시 CTF 처리는 4.2.1에서와 같이 건너 뛸 수 있습니다. - [선택] 육안 검사 단계를 건너 뛰고 완전히 처리 및 복원 명령을 실행 자동화하는
tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam> - [선택] 로컬 구성 파일을 생성하는 방법에 대한 tomoauto 문서를 참조하십시오, 특정 로컬 구성을 사용하여 다음 명령을 실행합니다
tomoauto [옵션] -L <local_config> <filename.st> <fid_diam>
여기서 <local_config>는 지역의 conf의 이름입니다프린터의 구성 파일.
- 현재 작업 디렉토리의 기울기 시리즈로, 터미널에서 명령을 실행
5. 하위 단층 평균화
참고 : 15은 (http://www.electrontomography.org/) 서브 단층 평균화 실험을 처리하기 위해, 그러나 프로토콜 설명 I3 패키지를 사용하는 대부분의 사용 가능한 서브 - 단층 평균화 소프트웨어 packages16to 프로세스 서브 단층 평균화 실험에 일반적으로 적용 그러나 대부분의 프로토콜은 사용 가능한 서브 단층 평균화 된 소프트웨어 패키지에 일반적으로 적용되는 16 ~ 18 기재.
- 현재 작업 디렉토리에 복원 된 단층 촬영으로 명령을 실행하여 입자 따기위한 단층 촬영을 엽니 다
tomopick <파일 이름> .rec
여기서 <파일 이름> 4.2.2과 같다. injectisome을 선택하고 tomogra의 조각을 통해 서민 위쪽 및 아래쪽 화살표 키를 사용하여 먼저 기초 신체 후 바늘 끝을 클릭 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 열리는 창에서엠. 이러한 방식으로 모든 볼 injectisomes을 선택합니다. 이 구조의 장축을 정의뿐만 아니라 세 개의 오일러의 두 구조의 배향을 나타내는 각도 추정 텍스트 파일의 좌표를 저장한다. - 계산적 추출 명령을 실행하여 정의 장축의 중앙에 중심을 단층 400 3 복셀 큐브 :
클립 크기 조정 -cx <X> -cy <Y> -cz <Z> -ix 400 -iy 400 -iz 400
<파일 이름> .rec <파일 이름> _001.mrc
여기서 <X>, <Y>, <Z> 구조의 중간 좌표는과 <파일 이름> 4.2.2과 같다. 추출 된 입방체의 크기는 사용 된 구조와 배율에 따라 다양해야하고, 충분히이 샘플 (400) 3 인 관심 복셀 구조를 묶 할만큼 충분히 커야한다. - 다운 샘플 (BIN) 명령을 실행함으로써, 초기 배향을위한 연산 시간을 줄이기 위해 4 배수로 서브 단층 :
binvol -b 4 <파일 이름> _001.mrc <파일 이름> _001.bin4.mrc
여기서 <파일 이름> 5.2과 같다. - 결정된 오일러 서브 단층 촬영 각도에 적용하고 명령을 실행하여 초기 템플릿을 생성하기 위해 세계 평균을 계산한다.
I3totsum.sh - 정렬하고 세포질 영역의 이진 분류 마스크를 사용하여 다운 샘플링 하위 단층 촬영을 분류합니다. 단층의 특성 누락 쐐기 아티팩트를 최소화하기 위해 푸리에 공간에서 서브 단층 평균을 수행합니다. 4 데이터를 비닝를 들어, SAMPFACT = "4 4 4"를 이용하시기 바랍니다.
i3mramsacls.sh - 5.5 단계를 반복하여 서브 두 단층 촬영 (SAMPFACT = 배만큼 다운 샘플링# 34 2 2 2 ")과 다시 한번 원래 데이터 (SAMPFACT ="1 1 1 ").
i3mramsacls.sh
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Representative Results
minicells S의 샘플 flexneri 수집 및 그림 2에 설명 된 파이프 라인을 다음 tomoauto 사용하여 회로도 그림 1에서 보여로 처리했다. 틸트 시리즈는 낮은 배율 몽타주 맵에 사용자가 지정한 지점에서 높은 처리량 틸트 계 취득 가능 SerialEM (10) (도 3)를 사용하여 수집 하였다. 현미경은 빔 유도 모션 22 (도 4)을 감소시키기 위해 직접 검출 장치의 카메라에 용량 분별 모드를 사용하여 수집 하였다. Tomoauto MOTIONCORR 22는 각 처리 용량 분획 현미경 사진의 컬렉션을 복용하는 움직임 보정을 조정 및 틸트 - 시리즈로 결과를 상기 (동영상 1) 처리 될 어셈블.
tomoauto의 가장 일반적인 응용 프로그램은 사설입니다초기 기울기 시리즈의 C 정렬. Tomoauto는 조악 틸트 계 정렬 및 최종 정렬을 생성하기 위해 사용되어 차례로 시료 중의 콜로이드 성 금 입자를 추적 기점 초기 모델을 생성하는 IMOD (13)에 필요한 명령의 순차적 인 실행을 구성한다. 이 기점 모델의 정확도는 재구성 된 단층 화상의 품질에 필수적이기 때문에, 사용자는 육안으로 직접 처리해야 틸트 계열을 식별하기 위해 이후에 재구성을 진행하기 이전에 자동으로 계산 기점 모델을 검사 할 수있다.도 5 도표 두 기울기 시리즈가 조악 정렬 및 tomoauto에 의해 생성 된. 결정된 기준점 모델 5A, C는 기울어지지 않은 이미지를 표시하고 기준점 모델 모두에서 기준 마커를 중심으로 모델 포인트 올 피규어 것은. 5B 피규어, 대응을 기울임 보여 D 도 5b에 모델도에서 50하면서 일련 그림 5D의 여러 모델 포인트 (빨간색)은 대응하는 금 마커에서 탈선과 모델은 미세 조정에 적합하지 않습니다했다. 이러한 에러는 모델 지점의 중심과 금 마커의 가능성 중심 간의 평균 예측 오차로서 정량적으로 측정 할 수 있고, tomoauto은 측정 오류 검사를 신속하게 사용자 정의 임계 값을 초과하면 사용자에게 경고하도록 구성 될 수있다. 불충분하게 자동 정렬 틸트 시리즈 수동 정렬 될 수있다. 우리는 tomoauto이 성공적으로 약 80 %의 우리의 수집 틸트 시리즈 (영화 2)의 -90 %를 정렬 것을 찾을 수 있습니다.
틸트 시리즈가 성공적으로 정렬 한 후,이를 최종 단층로 재구성되어야한다. 사용자가 사용하는 IMOD (13) 또는 최종 재구성을 생성하기 위해 26 tomo3d Tomoauto 수 있도록 설계되었다. 우리는 현재 T를 사용omo3d 크게 재구성 시간을 줄이기 위해 현대 컴퓨터의 멀티 코어 처리 장치 (CPU의)의 여러 기능을 활용할 수있다. 도 6 및 영화 3과 같이 최종 단층은 분할하여 셀룰러 주석, 또는 샘플 내의 분자 기계의 높은 해상도 정보를 획득하기 위해 평균화 서브 단층 사용될 수 묘화 샘플의 3 차원 볼륨이다. 서브 단층 평균화 증가 SNR 모두 개별 단층 촬영 소음의 높은 수준을 평균과 관련하여 임의의 방향의 잘 분산 세트 내의 다수의 서브 - 단층 촬영을 이용함으로써 누락 된 쐐기에 의해 생성 된 아티팩트를 감소 쐐기 누락하는 것은 유물을 제한하고 최종 해상도를 향상시킬 수 있습니다. 본래의 S. 2.7nm 서브 단층 평균 이 기술을 공동으로 할 수있는 큰 개선을 보여줍니다 EMDB (EMD-2667)에 증착 된 flexneri T3SS는 그림 7에 표시됩니다도 6b에 단일 단층에 표시 injectisome에 mpared.
그림 1. 높은 처리량 냉동 전자 단층 촬영의 도식 개요. 액체 현탁액을 빠르게 EM 그리드 및 틸트 시리즈의 세트에 동결은 자동화 된 컴퓨터 제어 전자 현미경으로 수집됩니다. 그 결과 현미경은 단층을 생성하는 tomoauto를 사용하여 자동으로 처리됩니다. 여기서 마지막 단계 인 세그먼트 S. 후 등. 2015 15에서이 프로토콜에 의해 생성 된 단층 촬영에서 flexneri minicell. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 tomoauto 과정 2. 순서도. tomoauto 워크 플로우의 분석 데이터가 모든 방법을 최종 하위 단층 평균 용량 분별 현미경의 컬렉션에서 처리하는 방법을 보여줍니다. 하위 프로세스 상징 세부 구성 적절한 소프트웨어를 실행하여 입력을 처리 할 좌표를 tomoauto 작업. 문서 및 다중 심볼 문서가 실제로 사용자에 의해 처리 결과를 표시하는 동안 데이터 심볼은 일반적으로 사용자에 의해 사용되지 않는 출력을 보여준다. 마지막으로 사용자 개입 워크 플로에서 발생하는 기호는 표시가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
SerialEM 네비게이터 그림 3. 배치 틸트 시리즈 수집. 무대 위치로 저장됩니다 몽타주지도의 위치 (도시 selecti화면의 좌측에 도시 된 네비게이터 창 목록과 현재로드 맵)에 대한 인수는 맵에 추가 적십자사 수치 레이블 선택된 지점과 함께 버퍼 윈도우에 표시된다. 획득 포인트는 탐색기 창에서 레이블로 나열되고. "틸트 시리즈"체크 상자를 사용하여 취득하도록 설정할 수 있습니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 용량 분획 데이터에 모션 보정 4. 효과. (A)이 기울어지지하고 나안 현미경 사진을 도시하고 (MOTIONCORR 처리) 움직임 보정 된 화상 (B)에 도시되고, 콘트라스트 보정 후의 약간 개선된다. 개선 푸리에 TRANSF 보면 더 명백하게 알 수있는현미경의 ORM (C) 전 (D)의 움직임 보정 후의. 이미지는 EH 같은 정보를 표시하지 않지만 콘트라스트 감소와 C와 D에 표시 톤 반지 60도, 기울어 진 현미경으로 더 이상 높은 경사에서 볼 수 있습니다. 스케일 바 250 나노 미터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 tomoauto 자동 기울기 시리즈 정렬 5. 좋고 나쁜 결과. (A) 기울지 대략 정렬 현미경 자동 tomoauto을 사용하여 제조 기점 모델. (B) 50도 경사의 기점 결정된 모델. 모델이 여전히 잘 맞는 적절한 기준 마커를 중심으로한다. (C, D) (A, B)를 보여줍니다. 이 틸트 시리즈 1.06 화소 평균 잔차와 정렬 하였다. (E) 다른 틸트 시리즈 및 50도 경사의 (F) 시리즈에서 기울어지지 않은 현미경 사진과 기점 모델. 여기에서 우리는 그 모델 (빨간색으로 표시) 여러 기준 마커의 트랙을 잃은보고이 나쁜 자동화 된 추적의 대표입니다. (G, H) 박스 영역에 확대 각각 (E, F)의 모델을 보여줍니다. 이 경사 시리즈는 3.51 픽셀의 평균 잔여 오류로 정렬 시리즈의 수동 정렬에 의해 처리 할 수 있었다. (A) 스케일 바 500 nm의 (C) 스케일 바 50 nm의. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.
![그림 6]("/files/ftp_upload/53608/53608fig6.jpg"/>)
그림 6. 단층 촬영은 tomoauto에 의해 자동으로 생성. (A) 이것은도 4a에 표시된 기울기 계의 재구성의 중심에서 일곱 조각 투영 표시. 스케일 바는 250nm. (B)는 (A)에서 박스형 영역의 확대보기를 디스플레이 그대로 injectisome. 스케일 바 100 나노 미터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그대로 S의 그림 7. 하위 단층 평균 flexneri 유형 III 분비 시스템. (A) 본래의 S. 2.7 nm의 서브 단층의 평균 중앙 조각 EMDB (EMD-2667)에서 flexneri T3SS. (B) 전체 투사 따라볼륨의 X 축. (C)의 IMOD (130)의 형상에서 본 임계 부피있는 isosurface 렌더링. 스케일 바는 5nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1 : 애니메이션이 정렬되지 않은 틸트 일련의 (오른쪽 다운로드를 클릭). 이 애니메이션으로 처음 SerialEM에 의해 수집 된 기울기 시리즈를 통해 실행됩니다. 번역 상 변화는 쉽게 눈에 띄지 결함이 재구성 될 수 기울기 시리즈 전에 수정해야와 함께 개별 기준점 이미지 이미지 마커, 이러한 변화의 엉뚱한 패스에 의해 식별된다.
![영화 2]("/files/ftp_upload/53608/53608Movie2.jpg"/>)
영화 2 :. 정렬 틸트 시리즈의 애니메이션 (오른쪽 다운로드를 클릭) 이 애니메이션은 tomoauto에 의해 자동 정렬 후 영화 1에 표시된 같은 현미경 사진을 통해 실행됩니다. 기준 마커의 불규칙한 경로 해주기 틸트 일련 부드러운 궤적을 따르고, 경사 축은 뷰어에 대해 수직으로 정렬된다.
영화 3 :. 애니메이션 복원 틸트 일련의 (오른쪽 다운로드를 클릭) 이 애니메이션 영화 2 (B)에 표시되는 틸트 시리즈의 그림 6 생성 된 후 자동 재건에 표시된 단층 촬영을 통해 실행Y tomoauto.
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Discussion
여기에 기술 된 고 처리량 방법이 1,917 크라이 틸트 계를 처리하고 그대로 S. 4,500 이상의 서브 단층 촬영을 생성 할 수있었습니다 flexneri 19 injectisome. 수집 된 데이터는 복잡한 정렬 세포질을 포함하여 현장 injectisome에서의 세부 특성화되었다. 방법은 또한 injectisome의 정렬 플랫폼의 구성을 명료하게 도왔다 추정의 단백질 성분의 특정 결실, 여러 돌연변이 세포를 시각화하기 위해 이용 하였다. 우리의 방법은 injectisome의 구조 - 기능 관계를 조사하기 위해 새로운 길을 제공했다. 그 결과, 새로운 스테이지 T3SS 매개 분비 기전을 기본 메커니즘 상기 절개에 대해 설정 하였다.
여기에 제시된 프로토콜은 그대로 S의 높은 처리량 극저온 동부 설명 flexneri,하지만 크라이 ET 적합한 어떤 프로젝트에 적용 가능하다. 이 방법은 구조물의 사용되었습니다보렐리 아 burgdorferi에 (27)의 편모 모터의 RAL 특성, E.의 감염 E.에서 박테리오파지 T7 (28)에 의해 대장균 minicells 및 화학 수용체 배열 대장균 (29). 대량의 데이터 세트의 수집을 용이하게함으로써 다수의 변이체뿐만 아니라 이미지와 같은 기계 조립체 (27)와 파지 감염 (28)의 진행 과정의 동적 추론을 허용하는 조건 중 다수 선별 할 수있다. 여러 소프트웨어 패키지를 수집하고 처리 실행을 완벽하게 제어 할 수 있도록함으로써, 사용자는 최적의 결과에 대한 패키지의 다른 조합을 사용자 정의 할 수 있습니다. 등. 21 첸 이전 틸트 계 IMOD 13 장 처리 및 RAPTOR 24 Leginon 12 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터를 수집하는 자동화 기술과 유사한 프로토콜을 발표했다. 현재의 프로토콜은 공동 다른 방법을 자세히 설명이 방법을 보완llecting 및 처리 데이터는 또한 기술 및 절차는 용량 분별 데이터, 자동화 CTF 추정 및 보정, 및 내보다 강력한 자동 정렬 루틴, 고급 서브 단층 평균화 통해 고해상도에 증가 된 초점으로 구동 얼마나 많은 나타내면서 IMOD (13). 이전의 프로토콜 데이터 수집 강조한 영상 내용이수록되어 있지만,이 방법은, 수집 된 데이터를 처리의 상세에 초점을 맞춘다.
주요 병목 프로젝트와 행동을 느리게 지루한 사용 설명서 개입의 양을 제한하면서 높은 처리량 방법은 현미경과 컴퓨터 자원의 사용을 최대화 대규모 데이터 수집 할 수 있습니다. 랩퍼 라이브러리 tomoauto은 간단하고 집중적으로 각 소프트웨어 패키지에 사용 된 모든 파라미터의 전체 구성을 허용하고있다. 적절한 구성이 결정되면, 그것은 전체 D로 설정을 적용 후 용이ataset. 작은 서브 세트를 수동으로 처리 할 필요가있는 동안 틸트 계의 대부분은, 허용 가능한 결과 (도 4a)으로 처리 될 수있다. 이 경사 시리즈는 일반적으로 과도한 이미지 이동, 빈약 한 반면, 또는 실패 자동화 기점 추적 루틴을 야기 충분한 기준 마커의 부족 (그림 4B)에 의해 퍼진 적은 이상적인 인수 있습니다. 최상의 단층 촬영을 얻으려면, 광범위한주의 이미지 처리에 샘플 준비, 이미지 수집, 매주 중요한 단계에서주의해야합니다.
자동화 된 서브 단층 템플릿 매칭에 의해 추출 및 tomoauto 같은 기존의 워크 플로우 파이프 라인에 같은 디나모 현대 하위 단층 평균 소프트웨어 패키지의 통합과 같은 높은 처리량 크라이 동부의 추가 개발이 현재 연구되고있다. 차세대 직접 검출 장치 카메라의 최근의 출현은 틸트 시리즈 SNR을 증가 MOR 수 있도록 주요 개선했다때문에 검출기의 높은 효율로 전자 일관된 CTF 결정. 새로운 전체 금 격자 형태의 사용은 수작업 30 덜 필요로 자동 기울기 계 처리 및 재건 성공률을 향상 틸트 계 컬렉션 결함을 감소시킬 수있다. 마지막으로 컴퓨터 클러스터 및 그래픽 처리 장치 (GPU)의 현재 유비쿼터스 사용하여 사용자에게 제공, 병렬화 큰 데이터 세트 처리, 곧 희망 시간 일부터 실행 시간을 단축 할 수있을 것이다 이러한 시스템을 이용할 수 배관의 개발을 빠르게 여전히 실험 설계 및 의미있는 데이터 분석 사이에서 더 적은 가동 중지 시간은 여전히 데이터 세트의 크기를 증가 및 높은 해상도를 달성한다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 의견 박사 윌리엄 Margolin 감사합니다. 우리는 박사에서 SerialEM의 지원에 감사합니다. 데이비드 Mastronarde과 첸 쑤. DM, BH와 JL은 웰치 재단 알레르기 및 전염병 국립 연구소, 일반 의료 과학 국립 연구소 (NIGMS)에서 보조금 R01GM110243과 R01GM107629, 그랜트 AU-1714에서 그랜트 R01AI087946에 의해 지원되었다. 직접 전자 검출기는 건강 상 S10OD016279의 국립 연구소에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 ml Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
References
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