Abstract
Molti studi cercano di identificare e mappare le regioni del cervello coinvolte nella specifica normativa fisiologici. I c-fos proto-oncogene, un gene precoce immediato, è espressa nei neuroni in risposta a vari stimoli. Il prodotto proteina può essere facilmente rilevata con tecniche immunoistochimiche volti all'utilizzo di rilevamento c-FOS mappare gruppi di neuroni che mostrano cambiamenti nella loro attività. In questo articolo, ci siamo concentrati sull'individuazione di tronco cerebrale neuronale popolazioni coinvolte nell'adattamento ventilatoria all'ipossia o ipercapnia. Due approcci sono stati descritti per identificare popolazioni neuronali coinvolte in vivo negli animali e ex vivo nelle preparazioni del tronco deafferented. In vivo, gli animali sono stati esposti a miscele di gas ipercapnici o ipossia. Ex vivo, i preparativi sono stati deafferented superfused con ipossia o liquido cerebrospinale artificiale ipercapnica. In entrambi i casi, sia il controllo in animali in vivo o ex vivo i preparativi sono stati mantenuti in condizioni normossiche e normocapnica. Il confronto di questi due approcci permette di determinare l'origine del cioè attivazione neuronale, periferica e / o centrale. In vivo ed ex vivo, sono stati raccolti brainstems, fissi, e tagliati in sezioni. Una volta che le sezioni sono state preparate, rilevazione immunoistochimica della proteina c-FOS è stato fatto per identificare i gruppi tronco di cellule attivate da stimoli ipossici o ipercapnici. cellule marcate sono state contate in strutture respiratori del tronco cerebrale. Rispetto alla condizione di controllo, ipossia o ipercapnia aumentato il numero di cellule marcate c-FOS in diversi siti del tronco specifici che sono in tal modo costitutiva dei percorsi neuronali coinvolti nella adattamento del drive respiratorio centrale.
Introduction
Il gene fos c- è stato identificato per la prima volta all'inizio del 1980 1,2 e il suo prodotto è stato caratterizzato nel 1984 come una proteina nucleare avente proprietà gene-attivatore 3,4. Partecipa a meccanismi a lungo termine associati con la stimolazione dei neuroni. Infatti, cambiamenti nell'attività neuronale portano a seconda cascata di segnalazione messaggero che inducono l'espressione dei geni immediati precoce c-fos, che induce la produzione del fattore di trascrizione c-FOS. Quest'ultima avvia l'espressione dei geni tardivi e partecipa quindi in risposta adattativa del sistema nervoso a diversi tipi di stimoli 4. Così, dalla fine del 1980 5,6, rilevamento proteina c-fos è stato frequentemente utilizzato per studiare gli effetti di fattori esogeni sulla trascrizione genica in generale 4 e sull'attività del sistema nervoso centrale (CNS) per mappatura percorsi neuronali coinvolti in diversi fisiologicacondizioni al.
Basale c-fos espressione è stata studiata in varie specie, tra cui topi, ratti, gatti, scimmie, e umano 4. In tal modo, la cinetica della sua espressione è relativamente ben nota. L'attivazione della trascrizione è rapido (da 5 a 20 min) 7,8, e l'accumulo di mRNA raggiunge un massimo tra 30 e 45 minuti dopo l'inizio della stimolazione 9 e diminuisce con una breve emivita di 12 min. La sintesi proteica c-FOS segue accumulo di mRNA e potrebbe essere rilevato mediante immunoistochimica a 20 a 90 min dopo la stimolazione 6.
Analisi dell'espressione di c-fos è classicamente utilizzato in studi in vivo per identificare la rete dell'apparato respiratorio coinvolti nelle risposte ventilatoria all'ipossia o ipercapnia 10-14. Più di recente, questo strumento è stato utilizzato anche in preparazioni ex vivo tronco di esplorare adattamenti rete respiratorie centrali all'ipossia o hypercapnia 15-18. In effetti, questi preparati generano un'attività ritmica classicamente assimilata al drive respiratorio centrale 19. Pertanto, questo tipo di preparazione ha il vantaggio di essere completamente deafferented, e quindi, i risultati riguardanti l'espressione di c-fos solo riflettono le conseguenze di una stimolazione centrale senza alcun intervento di strutture periferiche.
Il rilevamento c-FOS può essere effettuato mediante approcci immunoistochimiche o immunohistofluorescence. immunolocalizzazione indiretta richiede l'uso di un anticorpo primario contro c-FOS e un anticorpo secondario diretto contro le specie in cui è ottenuto l'anticorpo primario. Per il metodo immunoistochimica, l'anticorpo secondario è coniugato con un enzima (perossidasi, per esempio) che agisce su un substrato (H 2 O 2 per la perossidasi). Il prodotto della reazione enzimatica è sviluppato da un cromogeno (tetrahydrochlorid 3,3-diaminobenzidinae), che colora e si osserva al microscopio ottico. La reazione potrebbe essere rafforzata con solfato di nichel ammonio. Questi metodi consentono il rilevamento di attivi neuroni durante diverse sfide fisiologici e quindi l'identificazione e / o la mappatura dei percorsi periferiche e centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche consecutivi.
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Protocol
Nota: rilevamento c-FOS è una procedura standardizzata coinvolge diversi passaggi (Figura 1). Tutti gli esperimenti sono stati condotti su ratti o topi. protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato Etico in esperimenti su animali Charles Darwin (CE5 / 2011/05), fatta in conformità con la direttiva del Consiglio delle Comunità europee del 22 Settembre 2010 (2010/63 / UE) per la cura degli animali, e condotte in conformità con le leggi francesi per la cura degli animali.
1. preparazione di soluzioni
- Preparare tampone fosfato 0.2 M di sodio: aggiungere 6,24 g di NaH 2 PO 4 * 2H 2 O e 22.56 g di Na 2 HPO 4 * H 2 O a 1 L di acqua distillata e mescolare.
- Preparare 4% paraformaldeide (PFA): aggiungere 20 g di PFA a 150 ml di acqua distillata. Riscaldare la soluzione a 80 ° C sotto agitazione. Per cancellare la soluzione, abbassare la fiamma e aggiungere 1 o 2 gocce di 1 N NaOH per aiutare la paraformaldeide sciogliere. Completa per 250 mlcon acqua distillata ed aggiungere 250 ml di 0,2 M tampone fosfato (pH 7,4). Conservare a 4 ° C. Fare attenzione appropriata quando si utilizzano questi reagenti. Maneggiare con guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza sotto una cappa chimica.
Nota: Preparare 4% PFA, il giorno prima delle perfusioni. Determinare il volume del 4% PFA in funzione dell'età, numero e specie di animali. - Preparare la soluzione crioprotettiva: In 250 ml di 0,2 M tampone fosfato salino, mescolare 5 g di polivinil-pirrolidone, 150 g di saccarosio e 2,5 g di cloruro di sodio. Dopo completa dissoluzione, aggiungere 150 ml di glicole etilenico e regolare a 500 ml con acqua distillata. Conservare la soluzione crioprotettiva a 4 ° C.
- Preparare 0,1 M tampone fosfato salino (PBS): aggiungere 18 g di NaCl all'acqua distillata 1 L agitando. Dopo completa dissoluzione, aggiungere 1 L 0,2 M di tampone fosfato di sodio.
- Preparare tampone fosfato isotonico integrato con 0,3% Triton X100 (PBST): Aggiungere 3 ml di Triton X10Da 0 a 997 ml di PBS.
- Preparare 0,05 M Tris-Buffer (pH 7,6): aggiungere 3,03 g di Tris-cloridrato e 0,70 g Tris-base per 500 ml di acqua distillata e mescolare.
- Preparare 2% di siero di capra in PBST: per una piastra, preparare 30 ml di soluzione. Aggiungere 600 ml di siero di capra al 30 ml di PBST e mescolare bene. Aggiungere 2,5 ml per pozzetto.
Nota: Il siero utilizzato deve provenire da specie utilizzate per la produzione di anticorpi secondaria - Preparare coniglio anticorpo policlonale contro la proteina c-FOS (1: 4000, sc-52) in PBST con albumina sierica bovina (0,25%). Per una piastra, preparare 30 ml di soluzione. Aggiungere 75 mg di albumina di siero bovino a 30 ml di PBST e mescolare bene. Quindi, aggiungere 7,5 ml di anticorpo policlonale di coniglio contro la proteina c-FOS.
- Preparare biotinilato anticorpi di capra anti-coniglio (1: 500) in PBST con albumina di siero bovino (0,25%). Per una piastra, preparare 30 ml di soluzione. Aggiungere 75 mg di albumina di siero bovino a 30 ml di PBST e mescolare bene. Poi aggiungi60 ml di capra biotinilato anticorpo anti-coniglio.
- Preparare avidina-biotina-perossidasi (1: 250) in PBST (soluzione ABC). Per una piastra, preparare 30 ml di soluzione. Aggiungere 120 ml di reagente A e 120 ml di reagente B a 30 ml di PBST e mescolare bene.
Nota: soluzione ABC deve essere preparata almeno 30 minuti prima dell'uso. - Preparare la soluzione di substrato. Immediatamente prima dell'uso, preparare la soluzione come segue (per una piastra): aggiungere 20 mg di nichel solfato di ammonio e 10 mg di 3,3-diamminobenzidina tetraidrocloruro a 50 ml di Tris-Buffer. Filtrare e proteggere dalla luce. Aggiungere 2,0 ml per pozzetto. Nella soluzione rimanente (25 ml) aggiungere 17 ml di H 2 O 2 (H 2 O 2 soluzione 30% in H 2 O). Aggiungere 2,0 ml per pozzetto.
Nota: E 'necessario prestare attenzione quando si utilizza questi reagenti. Maneggiare con guanti e camici.
2. c-fos Induction e lavorazione dei tessuti In Vivo
Nota: Gli esperimenti sono stati condotti su ratti Sprague Dawley () o topi (C57BL / 6).
- Posizionare gli animali in un vano ermetico ventilato con una ipossica (O 2 8% N equilibrata 2) o ipercapnica (CO 2 4%, O 2 21% N equilibrata 2) miscela per 2 ore (Figura 2A).
- Anestetizzare l'animale con iniezione intraperitoneale di pentobarbital (100 mg / kg). Profumato il transcardially animale con 4% PFA 20. Maneggiare con guanti per la cura e l'uso sotto una cappa chimica.
- Dopo perfusione, sezionare il cervello 20 ed immergerlo in 7 ml di 4% PFA in una provetta da 15 ml per 48 ore a 4 ° C. Quindi rimuovere il cervello da PFA e immergerlo completamente nella soluzione crioprotettiva. Conservare a -18 ° C (figura 3). Smaltire il resto del corpo dell'animale da parte del pa di trattamento dei rifiuti adeguatothway.
Nota: crioprotezione è un passo tra il PFA la fissazione e il congelamento. Si riduce la formazione di cristalli di ghiaccio in cellule con una soluzione di congelamento cui sarà in forma amorfa. I campioni fissi devono essere impregnate nella soluzione crioprotettiva (preparato al punto 1.3) per almeno 24 ore a 4 ° C. Maneggiare con cura e guanti sotto cappa chimica.
3. c-fos induzione e Tissue Processing Ex Vivo
Nota: Gli esperimenti sono stati condotti nel ratto appena nati o topi solo.
- Isolare il CNS come descritto da Suzue 19. Mettere in una camera di registrazione e superfuse continuamente con fluido cerebro-spinale artificiale ad una velocità di 7,5 ml / min a 26 ° C 21 (aCSF: in mM: 130,0 NaCl, 5.4 KCl, 0,8 CaCl 2, 1.0 MgCl 2, 26,0 NaHCO 3, 30.0 D-glucosio; saturo di O 2 e regolato a pH 7,4 con il gas con 95% O 2 e 5% CO 2) (Figura 2B).
- Sostituire il aCSF con deossigenato aCSF (stessa composizione gorgogliare con il 95% N 2 e 5% CO 2, pH 7,4) per ipossia o da un aCSF acidificato (standard aCSF con NaHCO 3 ridotto a 10,0 mM, bollito con 95% O 2 e 5% di CO 2) per ipercapnia. Applicare la stimolazione per 30 min (Figura 2B).
- Ex vivo, dopo il periodo di induzione, trasferire il SNC di topi neonati o ratti in 2.5 ml di 4% PFA in una provetta da 2,5 ml per 48 ore e conservare a -18 ° C in una soluzione crioprotettiva per un uso successivo (Figura 3).
Nota: ex vivo, non è necessario perfusione animali. Un precedente studio suggerisce che i piccoli campioni di misura inferiore a 10 mm di diametro può essere fissata per semplice diffusione 22. Un tasso di penetrazione indicata (distanza, in mm, per la diffusione fissativo nel tessuto) per l'aldeide è 2 o 3 mm / hr.4. Brainstem sezionamento
Nota: Da questo punto alla fine, il protocollo è strettamente lo stesso in vivo ed ex vivo induzioni.
- Prima di affettare, collocare un individuo ben inserire in un 12-pozzetti e aggiungere 2,5 ml di PBS in ogni pozzetto.
- Rendere seriali sezioni coronali (40 micron) del tronco cerebrale con un criostato e raccoglierli in 12-pozzetti. Per l'intero tronco cerebrale adulta, fare circa 70 fette (Figura 3).
Nota: È possibile tessuti sezione da diversi animali in parallelo in una piastra.
5. Procedure immunoistologiche (Tabella 1)
Nota: Durante la procedura, le sezioni rimangono negli inserti pure.
- Giorno 1 - endogena distruzione perossidasi, non specifico sito di legame blocco, e l'incubazione con l'anticorpo primario (figura 4)
- lavaggiole sezioni per 10 minuti con 0,1 M PBS a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 3 volte.
- Sopprimere l'attività perossidasica endogena incubando le sezioni coronali di 30 minuti a temperatura ambiente con acqua ossigenata H 2 O 2, 3% in PBS 0,1 M (2,5 ml per pozzetto).
- Lavare le sezioni per 10 minuti con 0,1 M PBS a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 3 volte.
- Bloccare il sito di legame non specifico incubando le sezioni coronali per 1 ora a RT con siero di capra (2%) in PBST.
- Incubare le sezioni coronali di 48 ore a 4 ° C con un anticorpo policlonale di coniglio contro la proteina c-FOS (1: 4000, sc-52,) in PBST con albumina sierica bovina (0,25%) (2,5 ml per pozzetto).
- Day 3 - incubazione con l'anticorpo e lo sviluppo di una reazione colore secondario (figura 4)
- Lavare le sezioni per 10 minuti con PBS 0,1 M a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 3 volte.
- incubare ilSezioni coronali per 1 ora a RT con un anticorpo biotinilato di capra anti-coniglio (1: 500) in PBST con albumina sierica bovina (0,25%) (2,5 ml per pozzetto).
Nota: L'investigatore può anche utilizzare un anticorpo secondario accoppiato ad una sonda fluorescente in questa fase. In questo caso, interrompere il protocollo in questa fase ed esaminare direttamente utilizzando un microscopio a fluorescenza. - Lavare le sezioni per 10 min con PBST a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 3 volte.
- Incubare le sezioni coronali per 1 ora con avidina-biotina-perossidasi (1: 250) in PBST (2,5 ml per pozzetto).
- Lavare le sezioni per 10 min con PBST a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 2 volte.
- Lavare le sezioni per 10 min con 0,05 M Tris-Buffer a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 2 volte.
- Incubare le sezioni coronali con 0,02% tetraidrocloride 3,3-diaminobenzidina, 0,04% solfato di nichel ammonio e perossido di idrogeno 0,01% in 0,05 M Tris-tampone (pH 7,6) at RT (2,0 ml per bene). Nella soluzione rimanente (25 ml) aggiungere 17 ml di H 2 O 2 (H 2 O 2 soluzione 30% in H 2 O) (2,0 ml per pozzetto).
Nota: L'investigatore deve stabilire i tempi di sviluppo sotto microscopio ottico. Tuttavia, da 5 a 10 minuti fornisce buona intensità di colorazione. - Quando intensità di colorazione è ottimale (controllata al microscopio luce, vedi Figura 5 e Figura 6), arrestare la reazione lavando sezioni per 10 minuti con 0,1 M PBS a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripeti 4 volte. Poi, lavare sezioni con acqua distillata.
- Campionamento di montaggio (maneggiare con cura e guanti sotto cappa chimica)
- sezioni di montaggio in serie di diapositive e asciugare all'aria. Per questo, si sviluppa con attenzione le sezioni in modo rostro-caudale con spazzole su diapositive. Chiaramente etichettare i vetrini secondo i campioni.
- Disidratare con al assolutacohol: immergere i vetrini per 30 secondi a temperatura ambiente in bagno d'alcol assoluto. Ripetere due volte.
- Trasparente con xilene: immergere le diapositive in bagno xilene per 3 minuti a temperatura ambiente. Ripetere due volte.
- Coprioggetti i vetrini con mezzo di montaggio. Per questo, applicare 5 gocce di mezzo di montaggio sul vetrino e quindi applicare il vetro di copertura guidando le bolle d'aria. Asciugare per 48 ore.
6. I dati e l'analisi statistica
- Esaminare sezioni sotto un microscopio ottico. Visivamente contare i neuroni FLI ad alto ingrandimento (200x) utilizzando punti di riferimento standard di 23,24. Il puntiforme colorazione c-Fos è localizzata nei nuclei di neuroni.
- Per ogni area analizzata, contare il numero di cellule c-FOS-positive per sezione e confrontare il numero medio tra le condizioni di controllo e stimolati. Secondo la normalità dei dati, utilizzare il test t di Student per dati non appaiati o test di Mann-Whitney. Le differenze sono state considerate significative se P0; 0,05. Tracciare la distribuzione dei neuroni FLI su un disegno (ingrandimento 100x) utilizzando un tubo disegno allegato al microscopio e fotografato con una fotocamera digitale (Figura 5).
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Representative Results
Il rilevamento c-FOS è un utile strumento che consente a gruppi identificativi di cellule attivate in condizioni specifiche come ipossia e ipercapnia in vivo (Figura 2A) o in situazioni che imitano queste condizioni ex vivo (Figura 2B). In vivo, neonato, giovane o roditori adulti sono stati posti in un contenitore ermetico in cui l'ambiente gassoso viene continuamente rinnovata da una miscela di gas con una composizione definita con precisione da 30 a 180 min 13,25,26 (Figura 2A). Come gli atti di stimolazione su tutto il corpo, la relativa variazione in c-FOS potrebbe riflettere entrambi i percorsi attivati centrale e periferico. Ex vivo, preparazioni deafferented contenenti midollo allungato e del midollo spinale sono stati collocati in una camera in continuo superfused un aCSF con diversi livelli di o 2 o pH per modellare condizioni di ipossia o ipercapnici (
La CNS è stato fissato con PFA, sia da una perfusione attraverso la circolazione sistemica in vivo, o un'immersione ex vivo (Figura 3). A causa di questa differenza, la diffusione fissativo è più lungo ex vivo che in vivo. Così, il segnale c-FOS possa essere influenzata, in particolare nelle strutture profonde. Tuttavia, poiché l'analisi c-FOS è sempre eseguita in un approccio comparativo tra controllo e stimolato negli animali vivo o ex vivo preparazioni, questa differenza non sarebbe interferire con i risultati da un rigoroso confronto tra controllo e stimolato dati. Dopo di che, il sistema nervoso centrale è stata crioprotetti, sezionato, e impegnata nella imProcedura munohistochemical (Figura 3, Figura 4). In questo modo, alcune aree del tronco cerebrale respiratori sono stati identificati in vivo come modificare la loro attività sotto ipossia o ipercapnici sfide, compreso il nucleo retrotrapezoid (RTN), che è il principale sito centrale di CO 2 chemorecezione 10,13,28,29, la midollare ventrolaterale (VLM), che contiene il generatore inspiratorio ritmo 13, il commissurale e parti mediano del solitarius nucleo del tratto (c / MNT), che sono le aree di proiezione dei corpi carotidei ingresso 13,25,26,30 (Figura 5 ), ed i nuclei del rafe midollari 12,13.
Ex vivo, in condizioni deafferented, neuroni della RTN e VLM sono stati descritti per cambiare la loro immunoreattività c-FOS in condizioni di ridotta O 2 16-18. Il c-FOS deprotezione può anche essere combinato con altri rilevamenti immunoistochimica per caratterizzare il fenotipo di cellule attivate 14,31
Figura 1. Disegno dello studio per l'uso di c-FOS Detection per mappare le strutture neuronali coinvolti negli adattamenti respiratorie all'ipossia o ipercapnia. Passi cronologica della tecnica di rilevamento c-FOS nel sistema nervoso centrale. CNS: Sistema nervoso centrale; IHC:. Immunoistochimica Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. C-FOS induzione. (A) in vivo protocollo induzione. Un animale è stato posto in un c ermeticaHamber ed esposti sia aria (21% O 2; 79% N 2), hypercapnic (21% O 2; 4% CO 2; 75% N 2), o ipossia (10% O 2; 90% N 2) gas miscela per 2 ore. (B) Ex vivo protocollo di induzione. CNS è stato dissezionato dalla roditori neonati di età compresa tra 0 a 4 giorni. Midollo allungato e del midollo spinale sono stati isolati sotto ingrandimento per ottenere i preparativi. Essi sono stati collocati in una camera con superficie ventrale rivolta verso l'alto, con superfused aCSF (pH 7.4) a 26 ± 1 ° C. Modellazione stimolazione ipossica in vivo è stata effettuata riducendo la frazione di O 2 nella aCSF facendo gorgogliare una miscela di gas contenente anossico 95% N 2 e 5% CO 2. Modellazione stimolazione hypercapnic in vivo è stata effettuata utilizzando un aCSF acido che differiva da normale aCSF in termini di NaHCO 3 concentrazione (diminuzione). Il aCSF acido è saturo di O 2 e regosted a pH 7,23 facendo gorgogliare 95% O 2 e 5% CO 2. Ogni condizione di stimolazione è stato applicato per 30 min. aCSF:. liquido cerebrospinale artificiale Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Sistema Nervoso Centrale Sampling. In vivo, il CNS è stato ottenuto mediante dissezione dopo procedure di fissaggio con 4% paraformaldeide perfusi attraverso il sistema vascolare. Ex vivo, il CNS è direttamente immerso in 4% paraformaldeide dopo la dissezione. Successivamente, il CNS è stato crioprotetti mediante immersione in una soluzione crioprotettiva e tagliato a 40 micron di spessore sezioni coronali utilizzando un criostato. Le sezioni rostro-caudale del midollo sono stati collocati in una piastra da 12 pozzetti contenenti PBS before procedure di immunoistochimica. CNS: Sistema nervoso centrale; PBS:. Phosphate-Buffered Saline Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Le procedure di immunoistochimica indiretti. Le sezioni sono state incubate prima con un coniglio anticorpo primario policlonale contro la proteina c-FOS. Successivamente, sono stati trattati con anti-coniglio anticorpo secondario biotinilato di capra contro l'anticorpo primario. Dopo questa incubazione, le sezioni sono state trattate con un complesso avidina-biotina-perossidasi, che si lega strettamente al anticorpo secondario per amplificare il segnale. Infatti, il complesso contiene diverse molecole perossidasi conducono a un'elevata intensità di colorazione. Infine, le sezioni sono state colorate con una soluzione di 3,3-diaminatetraidrocloride obenzidine e solfato di nichel ammonio, che produce un precipitato grigio scuro in presenza dell'enzima perossidasi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. neuroni c-FOS-positivi sulle sezioni del midollo allungato in topi di controllo e topi sottoposti all'ipossia in vivo. (A) Disegno di una sezione del midollo allungato adattato da Paxinos e Franklin 24 (Bregma -7, 48 mm ). L'area tratteggiata delimita le parti commissurali e mediani delle solitarius nucleo del tratto c / Mnts. La casella illustra le strutture illustrate da microfotografie (B1 e B2). (B) Photomicrographs eseguiti (x100) al c / Mnts livello normossia (B1. di controllo, telaio nero) o sotto l'ipossia (B2. cornice blu). Le frecce nere indicano le cellule c-fos-positivo. (C) Istogramma che mostra il numero medio di cellule c-FOS-positivi per sezione a C / livello mnts in normossia (barra nera) o sotto l'ipossia (barra blu). I valori sono espressi come media ± SD. * Indica una differenza significativa tra normossia e ipossia valori - test t di Student spaiato; *** P <0.001. CC: canale centrale del midollo spinale; c / Mnts:. commissural parti e mediano del solitarius nucleo del tratto Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Procedura immunoistologiche. Passi cronologico delle cFProcedura OS. Ab-I, anticorpo primario; Ab-II, anticorpo secondario; BSA, albumina sierica bovina; DAB, tetraidrocloride 3,3-diaminobenzidina; Ni, ammonio solfato di nichel; PBS 0,1 M, 0,1 M tampone fosfato salino (pH 7,4); salina PBST, 0,1 M fosfato tamponata integrato con 0,3% Triton X-100; Serum, siero di specie utilizzate per la produzione di anticorpo secondario. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
C-fos è un gene precoce immediato, e il rilevamento del suo prodotto, la proteina c-FOS, viene classicamente utilizzati per identificare popolazioni neuronali coinvolti nelle risposte respiratorie specifici in vivo ed ex vivo 11,13,25,28 16-18, 27,32,33.
I passaggi critici all'interno del protocollo
Fare attenzione durante la fase di perfusione. La soluzione PFA 4% deve essere ben preparato e le operazioni di fissaggio e post-fissazione deve essere sufficientemente lungo per ottenere taglio ottimale e colorazione. Inoltre, la rivelazione è il passo più importante della procedura; l'intensità della colorazione deve essere controllato per evitare il rumore di fondo.
I vantaggi della tecnica e significative in relazione a metodi esistenti
Anche se alcuni neuroni non sembrano esprimere il gene c-fos 5, questo miThOD è stato dimostrato di essere utili per determinare percorsi neurali attivati, ad esempio nell'adattamento ritmo respiratorio durante sfide chimici. Rispetto ad altri geni precoci immediati, c-fos ha una bassa espressione in assenza di stimolazione, permettendo facile quantificazione dell'attività neuronale in una situazione di prova 6.
Il rilevamento c-FOS è una tecnica cellulare che indica cambiamenti globali nell'attività per analizzare popolazioni neuronali coinvolti in risposta a vari stimoli. Rispetto analisi dell'attività neuronale utilizzando un approccio elettrofisiologico, quale la maggior parte delle preoccupazioni temporali solo un piccolo numero di cellule in una zona del cervello definita, rilevamento c-FOS permessi di apprezzare cambi di attività in un gran numero di cellule e quindi definire attiva aree in tutto il sistema nervoso centrale. rilevazione C-FOS è facilmente compatibile con gli animali sfrenato e svegli, che non è il caso durante la registrazione dell'attività neuronale da elettrophysiology. Questo è un vantaggio perché evita lo stress e l'interferenza degli anestetici con i risultati ottenuti.
Ex vivo, abbiamo usato un periodo di 30 min di stimolazione. È stato precedentemente dimostrato che questa stimolazione è sufficiente ad indurre cambiamenti nell'espressione c-fos a livello neuronale 34-36. Cinque min di stimolazione sono sufficienti ad indurre cambiamenti nell'espressione c-fos, che si osservano dopo un periodo di latenza di 15 a 20 min 37. Gli incrementi relativi di espressione c-fos sono legati alle variazioni di attività che si svolgono durante i primi 10 minuti di stimolazione.
LIMITI DELLA TECNICA
Dopo stimolazione, un ritardo richiesto prima l'accumulo di c-FOS nel nucleo. Questo ritardo di circa 30 min corrisponde mRNA e la sintesi proteica. Questa voce si oppone alla immediatezza dei risultati che possono essere obtained registrando l'attività dei neuroni con elettrofisiologia. Ciò può causare una perdita di informazioni sui rapidi cambiamenti nell'attività neuronale dopo uno stimolo specifico e transitorio.
Come la proteina c-FOS può avere un tempo di dimezzamento di 90 a 100 min 4, la sua espressione potrebbe essere influenzata dalle procedure chirurgiche o stress associati con la manipolazione dell'animale, il suo vincolo, o cambiamenti nel suo ambiente. Pertanto, è necessario ridurre al minimo le manipolazioni che possono indurre cambiamenti nell'attività neuronale non correlate allo stimolo studiato e per eseguire il campionamento tessuto immediatamente dopo la fine dello stimolo fisiologico.
Modifiche e risoluzione dei problemi della tecnica
In questo protocollo, il passo rivelazione utilizzata una soluzione che conteneva tetraidrocloride 3,3-diaminobenzidina, solfato di ammonio di nichel, e perossido di idrogeno, ma i kit commerciali per perossidasi poteva alin modo da essere utilizzata in questa fase.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture plate 12-well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
References
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