Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

C-FOS Protein Immunohistologisk Detection: Et nyttig verktøy som en markør av Central Pathways involvere seg i det fysiologiske responser Published: April 25, 2016 doi: 10.3791/53613

Abstract

Mange studier søker å identifisere og kartlegge områder av hjernen som er involvert i konkrete fysiologiske forskrifter. Proto-oncogenet c-fos, en umiddelbar tidlig genet, blir uttrykt i nerveceller i respons til forskjellige stimuli. Proteinproduktet kan lett påvises med immunohistokjemiske teknikker som fører til bruken av c-fos deteksjon for å kartlegge grupper av neuroner som viser forandringer i deres aktivitet. I denne artikkelen har vi fokusert på identifisering av hjernestammen nevronale populasjoner som er involvert i ventilasjons tilpasning til hypoksi eller hyperkapni. To tilnærminger ble beskrevet til å identifisere involverte neuronpopulasjoner in vivo hos dyr og ex vivo i deafferented hjernestammen forberedelser. In vivo, dyrene ble utsatt for gassblandinger Hyperkapni eller hypoksiske. Ex vivo, deafferented forberedelser ble superfuseres med hypoksisk eller Hyperkapni kunstig spinalvæske. I begge tilfeller, enten kontroll in vivo dyr eller ex vivo forberedelser ble opprettholdt under normoksisk og normocapnic forhold. Sammenligningen av disse to fremgangsmåter gjør det mulig å bestemme opprinnelsen til den neuronale aktiverings ie, perifere og / eller sentral. In vivo og ex vivo, brainstems ble oppsamlet, fiksert, og skåret i seksjoner. Når seksjoner ble fremstilt, ble immunhistokjemisk deteksjon av c-Fos-proteinet laget for å identifisere de hjernestammen grupper av celler aktivert av hypoksiske eller Hyperkapni stimuleringer. Merkede celler ble tellet i hjernestammen respiratoriske strukturer. I forhold til kontroll tilstand, hypoksi eller hyperkapni økt antall c-fos merkede celler i flere spesifikke hjernestammen områder som er således konstitutiv av nervebaner som er involvert i tilpasning av den sentrale respirasjonen.

Introduction

Den c- fos genet ble identifisert for første gang i begynnelsen av 1980 1,2 og dens produktet ble preget i 1984 som en kjernefysisk protein som har genet-aktivator egenskaper 3,4. Det deltar i langsiktige mekanismer forbundet med nervecelle stimulering. Faktisk, endringer i neuronal aktivitet føre til sekundære budbringersystemer signaleringskaskader som induserer ekspresjon av det umiddelbare tidlige gen c-fos, som induserer produksjonen av transkripsjonsfaktoren c-FOS. Sistnevnte starter uttrykk for sene gener og deltar dermed i tilpasninger i nervesystemet til mange forskjellige typer stimuli 4. Således, siden slutten av 1980 5,6, c-Fos-proteinet detektering har blitt hyppig brukt for å studere virkningene av eksogene faktorer på gentranskripsjon generelt 4 og på aktivitet i sentralnervesystemet (CNS) for kartlegging av nervebaner involvert i forskjellige fysiologiskeal forhold.

Basal c-fos uttrykk har blitt undersøkt i ulike arter, inkludert mus, rotte, katt, ape og menneske fire. Derved kinetikken av dets ekspresjon er relativt godt kjent. Den transkripsjonsaktivering er hurtig (5 til 20 min), 7,8, og mRNA akkumuleringen når et maksimum mellom 30 og 45 min etter starten av stimuleringen 9 og avtar med en kort halveringstid på 12 min. C-Fos proteinsyntese følger mRNA-akkumulering og kan bli detektert ved immunohistokjemi på 20 til 90 minutter etter stimulering 6.

Analyse av c-fos ekspresjonen er klassisk anvendes i in vivo studier for å identifisere den sentrale luftnettet involvert i ventilasjons reaksjoner på hypoksi eller hyperkapni 10-14. Flere nylig, dette verktøyet ble også brukt i ex vivo hjernestammen forberedelser for å utforske sentrale luftveisnettverks tilpasninger til hypoksi eller hypercapnia 15-18. Faktisk disse preparatene generere en rytmisk aktivitet klassisk assimilert til den sentrale respirasjonen 19. Således denne type preparat har fordelen av å være fullstendig deafferented, og resulterer derfor av c-fos ekspresjonen bare reflektere konsekvensene av en sentral stimulering uten innblanding av perifere strukturer.

C-Fos deteksjon kan bli tatt opp av immunohistokjemiske eller immunohistofluorescence tilnærminger. Indirekte immundeteksjon nødvendiggjør bruk av et primært antistoff mot c-fos og et sekundært antistoff rettet mot de artene i hvilke det primære antistoff ble produsert. For immunhistokjemisk fremgangsmåte blir det sekundære antistoff konjugert med et enzym (peroksydase, for eksempel) som virker på et substrat (H 2 O 2 for peroksidase). Produktet fra den enzymatiske reaksjon blir utviklet av et kromogen (3,3-diaminobenzidin tetrahydrochloride), som farger det, og kan iakttas i henhold til lysmikroskopi. Reaksjonen kan bli forsterket ved bruk av nikkel ammoniumsulfat. Disse fremgangsmåter tillater påvisning av aktive bestanddeler neuroner i løpet av forskjellige fysiologiske utfordringer og derfor identifikasjon og / eller kartlegging av perifere og sentrale trasé som er involvert i de på hverandre følgende fysiologiske responser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: c-FOS påvisning er en standardisert prosedyre som involverer flere trinn (figur 1). Alle forsøkene ble utført på rotter eller mus. Eksperimentelle protokoller ble godkjent av etikkomiteen i dyreforsøk Charles Darwin (Ce5 / 2011/05), gjort i samsvar med europeiske fellesskap Rådsdirektiv av 22 september 2010 (2010/63 / EU) for dyr omsorg, og gjennomføres i samsvar med franske lover for dyr omsorg.

1. Utarbeidelse av Solutions

  1. Fremstille 0,2 M natriumfosfatbuffer: legge til 6,24 g NaH 2PO 4 * 2 H 2 O og 22,56 g Na HPO 2 4 * H2O til 1 liter destillert vann under omrøring.
  2. Forbered 4% Paraformaldehyde (PFA): legge 20 g PFA 150 ml destillert vann. Oppvarm løsningen til 80 ° C under omrøring. Hvis du vil tømme løsning, reduser varmen og tilsett 1 eller 2 dråper 1 N NaOH for å hjelpe Paraformaldehyde oppløses. Komplett til 250 mlmed destillert vann og tilsett 250 ml 0,2 M fosfatbuffer (pH 7,4). Oppbevar ved 4 ° C. Ta riktig behandling når du bruker disse reagenser. Håndteres med hansker, frakk og vernebriller i henhold til en kjemisk hette.
    Merk: Forbered 4% PFA på dagen før perfusjoner. Bestemme volumet av 4% PFA som en funksjon av alder, antallet og art av dyr.
  3. Forbered kryobeskyttende løsning: I 250 ml 0,2 M fosfat-bufret saltløsning, blandes 5 g polyvinylpyrrolidon, 150 g sukrose og 2,5 g natriumklorid. Etter fullstendig oppløsning, tilsett 150 ml etylenglykol og justeres til 500 ml med destillert vann. Oppbevar kryobeskyttende oppløsning ved 4 ° C.
  4. Fremstille 0,1 M fosfat-bufret saltløsning (PBS): Tilsett 18 g NaCl til en l destillert vann under omrøring. Etter fullstendig oppløsning, tilsett 1 liter 0,2 M natriumfosfatbuffer.
  5. Forbered Fosfatbufret saltløsning supplert med 0,3% Triton X100 (PBST): Tilsett 3 ml Triton X100 til 997 ml PBS.
  6. Forbered 0,05 M Tris-buffer (pH 7,6): Tilsett 3,03 g Tris-hydroklorid og 0,70 g tris-base-til 500 ml destillert vann under omrøring.
  7. Forbered 2% geit serum i PBST: for en plate, forberede 30 ml oppløsning. Legg 600 mL av geit serum til 30 ml PBST og bland godt. Legg 2,5 ml per brønn.
    Merk: Serum som brukes må komme fra arter som brukes til sekundær antistoffproduksjon
  8. Forbered kanin polyklonalt antistoff mot c-Fos-proteinet (1: 4000, sc-52) i PBST med bovint serumalbumin (0,25%). For en plate, fremstille 30 ml løsning. Legg 75 mg bovint serumalbumin i 30 ml PBST og bland godt. Deretter legger 7,5 mL av kanin polyklonale antistoff mot c-FOS protein.
  9. Forbered biotinylert geit-anti-kanin-antistoff (1: 500) i PBST med bovint serumalbumin (0,25%). For en plate, fremstille 30 ml løsning. Legg 75 mg bovint serumalbumin i 30 ml PBST og bland godt. Deretter legger60 ul biotinylert geite-anti-kanin-antistoff.
  10. Forbered avidin-biotin-peroksidase kompleks (1: 250) i PBST (ABC løsning). For en plate, fremstille 30 ml løsning. Legg 120 mL av reagens A og 120 pl av reagens B til 30 ml PBST og bland godt.
    Merk: ABC løsning må være forberedt på minst 30 minutter før bruk.
  11. Forbered substrat løsning. Umiddelbart før bruk, fremstille løsningen som følger (for en plate): Tilsett 20 mg av nikkel ammoniumsulfat og 10 mg av 3,3-diaminobenzidin tetrahydroklorid til 50 ml Tris-buffer. Filter og beskytte mot lys. Legg 2,0 ml per brønn. I den gjenværende oppløsning (25 ml) tilsett 17 pl av H2O 2 (H 2 O 2 løsning 30% i H2O). Legg 2,0 ml per brønn.
    Merk: Forsiktighet bør utvises ved bruk av disse reagenser. Håndteres med vernehansker og lab strøk.

2. c-fos InduDette skjer og Tissue Processing In Vivo

Merk: Forsøk ble utført på rotter (Sprague Dawley) eller mus (C57BL / 6).

  1. Plassere dyrene i en lufttett boks ventilert med en hypoksisk (O 2 8% balanse N2) eller Hyperkapni (CO 2% 4, O 2 21% balansert N 2) gassblandingen i 2 timer (figur 2A).
  2. Bedøver dyret med intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (100 mg / kg). Perfuse dyret transcardially med 4% PFA 20. Handle with care og bruk hansker i henhold til en kjemisk hette.
  3. Etter perfusjon, dissekere hjernen 20 og dyppe det i 7 ml 4% PFA i et 15 ml rør i 48 timer ved 4 ° C. Deretter fjerner hjernen fra PFA og fordype det helt i kryobeskyttende løsning. Oppbevares ved -18 ° C (figur 3). Kast resten av dyrets kropp ved riktig beholder behandlingen pathway.
    Merk: kryobeskyttelse er et skritt mellom PFA fiksering og frysing. Det reduserer dannelsen av iskrystaller i celler med en oppløsning som fryse vil være i amorf form. De faste prøver må være impregnert på det kryobeskyttende oppløsning (fremstilt i trinn 1,3) i minst 24 timer ved 4 ° C. Håndteres med forsiktighet og hansker etter kjemisk hette.

3. c-fos induksjon og Tissue Processing Ex Vivo

Note: Forsøk ble utført på nyfødte rotter eller mus bare.

  1. Isoler CNS som beskrevet av Suzue 19. Plasser den i et registreringskammer og superfuse den kontinuerlig med kunstig cerebrospinalvæske med en hastighet på 7,5 ml / min ved 26 ° C 21 (aCSF: i mM: 130,0 NaCl, 5,4 KCl, 0,8 CaCl2, 1,0 MgCl2, 26,0 NaHCO3, 30,0 D-glukose, mettet med O 2 og innstilt til pH 7,4 ved gassing med 95% O2 og 5% CO 2) (figur 2B).
  2. Erstatte den aCSF med en desoksydert aCSF (samme sammensetning gjennomboblet med 95% N2 og 5% CO2, pH 7,4) for hypoksi eller av en surgjort aCSF (standard aCSF med NaHCO3 redusert til 10,0 mM, gjennomboblet med 95% O2 og 5% CO 2) for hyperkapni. Påfør stimulering for 30 min (figur 2B).
  3. Ex vivo, etter induksjonsperioden, overføre CNS av nyfødte mus eller rotter i 2,5 ml 4% PFA i et 2,5 ml rør i 48 timer og oppbevares ved -18 ° C i en kryobeskyttende løsning for senere bruk (figur 3).
    Merk: Ex vivo, er det ikke nødvendig å perfuse dyr. En tidligere studie tyder på at små prøvene måler mindre enn 10 mm i diameter kan fikses ved enkel diffusjon 22. En angitte borsynk (avstand, i mm, for fikser diffusjon inn i vevet) for aldehydet er 2 eller 3 mm / time.

    4. hjernestammen Seksjonering

    Merk: Fra dette trinnet til slutten, er protokollen strengt samme for in vivo og ex vivo induksjoner.

    1. Før du skjærer, plassere en enkelt brønn sette inn i en 12-brønns plate og tilsett 2,5 ml PBS i hver brønn.
    2. Lage serielle koronale seksjoner (40 um) av hjernestammen med en cryostat og samle dem i 12-brønns plate. For hele voksen hjernestammen, lage ca 70 skiver (figur 3).
      Merk: Det er mulig å seksjonen vev fra flere dyr i parallell i en plate.

    5. immunhistokjemi Prosedyrer (tabell 1)

    Merk: Gjennom hele prosedyren, seksjonene forblir i brønn innsatsene.

    1. Dag 1 - Endogen peroksidaseaktivitet ødeleggelse, ikke-spesifikk bindingssete blokade, og inkubasjon med det primære antistoff (figur 4)
      1. vaskseksjonene i 10 minutter med 0,1 M PBS ved romtemperatur (2,5 ml per brønn). Dette gjentas 3 ganger.
      2. Undertrykker endogen peroksydase-aktivitet ved inkubering av koronale seksjoner for 30 minutter ved romtemperatur med hydrogenperoksyd H 2 O 2, 3% i 0,1 M PBS (2,5 ml per brønn).
      3. Vask seksjonene i 10 minutter med 0,1 M PBS ved romtemperatur (2,5 ml per brønn). Dette gjentas 3 ganger.
      4. Blokkere den ikke-spesifikke bindingssetet ved inkubering av koronale seksjoner for 1 time ved RT med geiteserum (2%) i PBST.
      5. Inkuber koronale seksjoner for 48 timer ved 4 ° C med et kanin polyklonalt antistoff mot c-Fos-proteinet (1: 4000, SC-52,) i PBST med bovint serumalbumin (0,25%) (2,5 ml per brønn).
    2. Dag 3 - Inkubasjon med sekundært antistoff og utvikling av en fargereaksjon (figur 4)
      1. Vask seksjonene i 10 minutter med PBS 0,1 M ved romtemperatur (2,5 ml per brønn). Dette gjentas 3 ganger.
      2. Inkuberkoronale seksjoner for 1 time ved RT med et biotinylert geit-anti-kanin-antistoff (1: 500) i PBST med bovint serumalbumin (0,25%) (2,5 ml pr brønn).
        Merk: Undersøkeren kan også benytte et sekundært antistoff koblet til en fluorescerende probe på dette stadiet. I dette tilfellet stoppe protokollen på dette stadiet og undersøke direkte ved hjelp av et fluorescens mikroskop.
      3. Vask delene for 10 min med PBST ved romtemperatur (2,5 ml per brønn). Dette gjentas 3 ganger.
      4. Inkuber koronale seksjoner for en time med et avidin-biotin-peroksidasekompleks (1: 250) i PBST (2,5 ml per brønn).
      5. Vask delene for 10 min med PBST ved romtemperatur (2,5 ml per brønn). Gjenta 2 ganger.
      6. Vask seksjonene i 10 minutter med 0,05 M Tris-buffer ved romtemperatur (2,5 ml per brønn). Gjenta 2 ganger.
      7. Inkuber koronale seksjoner med 0,02% 3,3-diaminobenzidin tetrahydroklorid, 0,04% nikkel ammoniumsulfat og 0,01% hydrogenperoksyd i 0,05 M Tris-buffer (pH 7,6) ett RT (2,0 ml per brønn). I den gjenværende oppløsning (25 ml) tilsett 17 pl H to O 2 (H 2 O 2-løsning 30% i H2O) (2,0 ml pr brønn).
        Merk: Etterforskeren skal bestemme utviklings ganger under lett mikroskop. Imidlertid 5 til 10 minutter gir god fargeintensitet.
      8. Når fargingen intensitet er optimal (kontrollert under lysmikroskop, se figur 5 og figur 6), stopp reaksjonen ved å vaske seksjonene i 10 minutter med 0,1 M PBS ved romtemperatur (2,5 ml per brønn). Gjenta 4 ganger. Deretter vaskes seksjonene med destillert vann.
    3. Prøvetaking montering (vær forsiktig og hansker etter kjemisk hette)
      1. Mount seksjoner serielt på lysbilder og lufttørke. For dette forsiktig fra seksjonene i rostro-hale orden med børster på lysbildene. Tydelig merke lysbildene i henhold til prøvene.
      2. Dehydrere med absolutt alalkoholdispergeringsmiddel: fordype lysbildene i 30 sek ved RT i absolutt alkohol bad. Gjenta to ganger.
      3. Klar med xylen: fordype lysbildene i xylen bath for 3 min ved RT. Gjenta to ganger.
      4. Dekkglassene med monteringsmedium. For dette, gjelder 5 dråper montering medium på lysbildet, og deretter bruker dekkglasset ved å kjøre ut luftbobler. Lufttørke i 48 timer.

    6. data og statistisk analyse

    1. Undersøke kapitlene under et lysmikroskop. Visuelt telle FLI nevroner ved høy forstørrelse (200x) ved hjelp av standard landemerker 23,24. C-Fos konsentrert farging er lokalisert i kjerner av nerveceller.
    2. For hver analyserte området, telle antallet c-Fos-positive celler per seksjon og sammenligne det midlere antall mellom kontroll- og stimulerte betingelser. Avhengig av normaliteten av dataene bruker uparede Students t test eller Mann-Whitney-testen. Forskjeller ble betraktet som signifikant dersom P0; 0,05. Plott fordelingen av FLI neuroner på en tegning (forstørrelse 100x) ved hjelp av en tegning rør festet til mikroskop og fotografert med et digitalt kamera (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C-FOS gjenkjenning er et nyttig verktøy som gjør det mulig å identifisere grupper av aktiverte celler under spesielle forhold som hypoksi og hyperkapni in vivo (figur 2A) eller i situasjoner som etterligner disse forholdene ex vivo (figur 2B). In vivo, nyfødt, unge eller voksen gnagere ble plassert i en lufttett boks i hvilken det gassformige omgivelsene blir kontinuerlig fornyes ved en gassblanding med en sammensetning nøyaktig definert i 30 til 180 min 13,25,26 (figur 2A). Som stimulering virker på hele kroppen, kan den tilhørende endringen i c-FOS reflektere både sentrale og perifere aktivert trasé. Ex vivo, ble deafferented preparater som inneholder den forlengede marg og ryggmarg plassert i et kammer kontinuerlig superfuseres med en aCSF med ulike nivåer O 2 eller pH for å modellere hypoksiske eller Hyperkapni betingelser ( 16-18,27. Som stimulering opptrer bare i disse deafferented preparater, er det mulig å konkludere med at kun sentrale mekanismer involvert i aktivering av celler i c-FOS identifiserte strukturer.

CNS ble løst med PFA, enten ved en perfusjon via den systemiske sirkulasjon in vivo, eller ved en nedsenking ex vivo (figur 3). På grunn av denne forskjell, er det fikser diffusjonen lengre ex vivo enn in vivo. Således kan det hende at c-fos-signalet bli påvirket, spesielt i dype strukturer. Imidlertid, fordi den c-Fos-analyse utføres alltid i en komparativ tilnærming mellom kontroll og stimulert in vivo dyr eller ex vivo preparater, denne forskjellen vil ikke påvirke resultatene fra en streng sammenligning mellom kontroll og stimulert data. Etter det ble CNS cryoprotected, seksjonert, og engasjert i immunohistochemical prosedyre (figur 3, figur 4). På denne måten har pustehjerneområder er identifisert in vivo som endrer sin virksomhet etter hypoksisk eller Hyperkapni utfordringer, inkludert retrotrapezoid kjernen (RTN), som er den viktigste sentrale området av CO 2 chemoreception 10,13,28,29, den ventrolateral marg (VLM), som inneholder den inspiratoriske rytme generatoren 13, den kommissurale og median deler av kjernen Tractus solitarius (c / fjel), som er projeksjons områdene av carotis legemer inngangs 13,25,26,30 (Figur 5 ), og marg rafe kjerner 12,13.

Ex vivo, i deafferented forhold, nerveceller i RTN og VLM har blitt beskrevet til å endre sin c-Fos immunoreaktivitet under betingelser med redusert O 16 til 18 februar. C-FOS debeskyttelse kan også kombineres med andre immunhistokjemiske deteksjoner for å karakterisere fenotypen av aktiverte celler 14,31

Figur 1
Figur 1. Studer Design for bruk av c-FOS gjenkjenning til å kartlegge nervestrukturer involvert i luft Tilpasninger til Hypoksi eller hyperkapni. Kronologisk trinn på c-FOS påvisning teknikk i CNS. CNS: sentralnervesystemet; IHC. Immunohistochemistry Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. C-FOS-induksjon. (A) In vivo induksjon protokollen. Et dyr ble plassert i en hermetisk cHamber og utsatt for enten luft (21% O 2; 79% N 2), Hyperkapni (21% O 2; 4% CO2, 75% N 2), eller hypoksisk (10% O 2; 90% N 2) gass blanding i 2 timer. (B)   Ex vivo induksjon protokollen. CNS ble dissekert ut fra nyfødt gnager i alderen 0 til 4 dager. Forlengede marg og ryggmargen ble isolert under forstørrelse for å få forberedelsene. De ble plassert i et kammer med den ventrale overflate som vender oppover, superfuseres med aCSF (pH 7,4) ved 26 ± 1 ° C. Modellering hypoksisk stimulering in vivo ble utført ved å redusere fraksjonen av O 2 i aCSF ved å boble en ikke-oksyderende gassblanding inneholdende 95% N 2 og 5% CO2. Modellering Hyperkapni stimulering in vivo ble utført ved hjelp av en syre aCSF som avvek fra normal aCSF i form av NaHCO3 konsentrasjon (reduksjon). Syren aCSF er mettet med O 2 og juSTED til pH 7,23 ved å boble med 95% O2 og 5% CO2. Hver stimulering tilstand ble søkt om 30 min. aCSF. kunstig spinalvæske Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Central Nervous System Sampling. In vivo CNS ble oppnådd ved disseksjon etter fiksativ prosedyre under anvendelse av 4% paraformaldehyd perfusert gjennom det vaskulære systemet. Ex vivo, ble CNS direkte nedsenket i 4% paraformaldehyd etter disseksjon. Deretter ble CNS cryoprotected ved nedsenking i en kryobeskyttende oppløsning og oppskåret i 40 um tykke koronalsnitt ved hjelp av en kryostat. De rostro-kaudale deler av medulla ble plassert i en 12-brønners plate inneholdende PBS Saudafe immunhistokjemiske prosedyrer. CNS: sentralnervesystemet; PBS. Phosphate-Buffered Saline Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Indirekte Immunohistokjemiske prosedyrene. Snittene ble først inkubert med et kanin polyklonalt primært antistoff mot c-Fos-proteinet. Etterpå ble de behandlet med en biotinylert geite-anti-kanin-sekundært antistoff mot det primære antistoff. Etter denne inkubering ble delene behandlet med et avidin-biotin-peroksidase-komplekset, som binder seg tett til det sekundære antistoff for å forsterke signalet. Faktisk inneholder den komplekse flere peroksidase-molekyler som fører til en høy fargeintensitet. Til slutt seksjonene ble farget ved anvendelse av en oppløsning av 3,3-diaminobenzidine -tetrahydroklorid og nikkel ammonium sulfat, som produserer en mørk grå bunnfall i nærvær av peroksidase enzymet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. c-Fos-positive neuroner i seksjoner av medulla oblongata i kontrollmus og mus som sendes til hypoksi in vivo. (A) Tegning av en seksjon av medulla oblongata tilpasset fra Paxinos og Franklin 24 (Bregma -7, 48 mm ). Den stiplede området delimitates de kommissurale og median deler av kjernen Tractus solitarius c / Mnts. Boksen illustrerer strukturene illustrert ved photomicrographs (B1 og B2). (B) Photomicrographs utført (x100) på c / Mnts nivå i normoxia (B1. kontroll, sort ramme) eller under hypoksi (B2. blå ramme). De svarte pilene viser c-FOS-positive celler. (C) Histogram som viser gjennomsnittlig antall c-FOS-positive celler per seksjon på c / Mnts nivå i normoxia (sort strek) eller under hypoksi (blå linje). Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. * Viser en signifikant forskjell mellom normoxia og hypoksi verdier - Student uparet t-test; *** P <0,001. CC: sentralkanalen ryggmargen; c / Mnts:. kommissurale og median deler av kjernen Tractus solitarius Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1. Immunohistologisk prosedyre. Kronologisk trinn av CFOS prosedyre. Ab-I, primære antistoff; Ab-II, sekundært antistoff; BSA, bovint serumalbumin; DAB, 3,3-diaminobenzidintetrahydroklorid; Ni, nikkel ammoniumsulfat; PBS 0,1 M, 0,1 M fosfat-bufret saltløsning (pH 7,4); PBST, 0,1 M fosfat-bufret saltløsning supplert med 0,3% Triton X-100; Serum, serum fra arter som brukes til sekundær antistoffproduksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C-fos er en umiddelbar tidlig genet, og påvisningen av dets produkt, c-Fos-proteinet, er klassisk brukes til å identifisere neuronale populasjoner som er involvert i bestemte luftveisresponser in vivo 11,13,25,28 og ex vivo 16-18, 27,32,33.

Kritiske trinnene i protokollen

Vær forsiktig under perfusjon trinn. 4% PFA løsning må være godt forberedt og feste og post-fiksering skritt må være lang nok til å oppnå optimal kutting og farging. Videre er åpenbaringen det viktigste steget i prosedyren; intensiteten av fargingen bør kontrolleres for å unngå bakgrunnsstøy.

Fordeler med teknikken og betydning i forhold til eksisterende metoder

Selv om noen nevroner ikke synes å uttrykke c-fos genet 5, dette er megthod har vist seg å være nyttig for å bestemme nervebaner aktivert, for eksempel i luftveiene rytme tilpasning i løpet av kjemiske utfordringer. Sammenlignet med andre umiddelbare tidlige gener, har c-fos en lav ekspresjon i fravær av stimulering, slik at lettere kvantifisering av neuronal aktivitet under en testsituasjon 6.

C-FOS påvisning er en cellulær teknikk som indikerer globale endringer i aktivitet for å analysere neuronale populasjoner som er involvert i respons på en rekke stimuli. Sammenlignet med neuronal aktivitet analyse ved hjelp av en elektrofysiologisk tilnærming, som mesteparten av tiden gjelder bare et lite antall celler i et definert hjerneområde, muliggjør c-Fos deteksjon en for å verdsette endringer i aktivitet i et stort antall celler, og derfor for å definere aktive områder i hele CNS. C-FOS påvisning er lett forenlig med hemningsløs og våken dyr, som ikke er tilfelle i løpet av neuronal aktivitet opptak av strømophysiology. Dette er en fordel fordi den unngår stress og innblanding av bedøvelse med de oppnådde resultater.

Ex vivo, anvendte vi en 30 min periode av stimulering. Det ble tidligere vist at denne stimulering er tilstrekkelig til å indusere endringer i c-fos ekspresjonen på den neuronale nivå 34-36. Fem minutter av stimulering er tilstrekkelig til å indusere endringer i c-fos ekspresjonen, som er observert etter en latent periode på 15 til 20 min 37. De tilhørende økning i c-fos uttrykk er knyttet til endringer i aktivitet som finner sted i løpet av de første 10 min av stimulering.

Begrensninger av teknikken

Etter stimulering, er en forsinkelse som kreves før akkumuleringen av c-FOS i kjernen. Denne forsinkelse på ca. 30 min korresponderer til mRNA og proteinsyntese. Dette elementet er imot immediacy av resultatene kan være obtastilt ved å registrere aktiviteten til nerveceller med elektrofysiologi. Dette kan føre til tap av informasjon om raske endringer i neuronal aktivitet etter en konkret og forbigående stimulus.

Som c-Fos-proteinet kan ha en halveringstid på 90 til 100 min 4, kan dets ekspresjon bli påvirket av de kirurgiske prosedyrer eller stress forbundet med manipulering av dyret, dens begrensning, eller forandringer i omgivelsene. Således er det nødvendig å minimalisere manipulasjoner som kan indusere endringer i neuronal aktivitet som ikke er relatert til de studerte stimulus og for å utføre vevsprøver umiddelbart etter slutten av den fysiologiske stimuli.

Modifikasjoner og feilsøking av teknikken

I denne protokollen, som brukes åpenbaringen trinnet en løsning som inneholdt 3,3-diaminobenzidin tetrahydroklorid, nikkel ammoniumsulfat, og hydrogenperoksyd, men de kommersielle kits for peroxydase kunne alså bli brukt for dette trinnet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture plate 12-well Costa 35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane Corning 3477 The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) Santa Cruz Biotechnology sc-52
Vectastain Elite ABC KIT  Vector laboratories PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O Sigma 71505
Na2HPO4 Sigma S7907
Paraformaldehyde Sigma P6148
NaOH 0.1N Sigma 43617
Polyvinyl-Pyrrolidone Sigma PVP-360
Sucrose Sigma S7903
NaCl Sigma S7653
Ethylene-glycol Sigma 33068
Triton X100 Sigma T8787
Trisma HCl Sigma T5941
Trisma Base Sigma T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride  Rockland DAB50
Nickel ammonium sulphate Alfa Aesar 12519
H2O2 Sigma H1009
Xylene Sigma 33817
Entellan Neo Merck Millipore 107961
Slide  Thermo-scientific 1014356190 Superfrost ultraplus
Cover glass Thermo-scientific Q10143263NR1 24 x 60mm
BSA Sigma A2153

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
  2. Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells. Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).
  3. Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell. 36, 259-268 (1984).
  4. Herdegen, T., Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).
  5. Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).
  6. Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).
  7. Greenberg, M. E., Ziff, E. B. Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature. 311, 433-438 (1984).
  8. Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells. J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).
  9. Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc. Nature. 312, 716-720 (1984).
  10. Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats. Brain Res. 635, 353-356 (1994).
  11. Teppema, L. J., et al. Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia. J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).
  12. Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. c-fos-like immunoreactivity in the cat's neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia. J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).
  13. Bodineau, L., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neuroscience. 108, 643-653 (2001).
  14. Erickson, J. T., Millhorn, D. E. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem. J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).
  15. Bodineau, L., et al. Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).
  16. Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
  17. Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro. J Physiol. 577, 55-68 (2006).
  18. Voituron, N., et al. The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group. Neuroscience. 194, 95-111 (2011).
  19. Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , e3564 (2012).
  21. Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording. J Vis Exp. , e53071 (2015).
  22. Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).
  23. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4th ed, Academic Press. CA. (1998).
  24. Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd ed, Academic Press. CA. (2001).
  25. Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats. Brain Res. 857, 30-40 (2000).
  26. Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus. Brain Res. 877, 149-159 (2000).
  27. Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).
  28. Takakura, A. C., et al. Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol. 572, 503-523 (2006).
  29. Mulkey, D. K., et al. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats. Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).
  30. Finley, J. C., Katz, D. M. The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res. 572, 108-116 (1992).
  31. Bodineau, L., et al. Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats. Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).
  32. Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats. J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).
  33. Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Neuroscience. 127, 505-518 (2004).
  34. Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science. 237, 192-197 (1987).
  35. Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science. 240, 1328-1331 (1988).
  36. Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).
  37. Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments. Brain Res. 954, 100-114 (2002).

Tags

Molecular Biology sentralnervesystemet c-FOS protein umiddelbar tidlig genet Immunohistochemistry neuronal markør transkripsjonsfaktor
C-FOS Protein Immunohistologisk Detection: Et nyttig verktøy som en markør av Central Pathways involvere seg i det fysiologiske responser<em&gt; I Vivo</em&gt; og<em&gt; Ex Vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perrin-Terrin, A. S., Jeton, F.,More

Perrin-Terrin, A. S., Jeton, F., Pichon, A., Frugière, A., Richalet, J. P., Bodineau, L., Voituron, N. The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo. J. Vis. Exp. (110), e53613, doi:10.3791/53613 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter