Abstract
Birçok çalışma, belirli fizyolojik düzenlemelere yer alan beyin bölgeleri belirlemek ve harita çalışırlar. Proto-onkogen, c-fos, ani erken gen çeşitli uyaranlara yanıt olarak nöronlar olarak ifade edilir. protein ürünü hali hazırda aktiviteleri değişiklikleri göstermek nöron gruplarını harita c-fos algılama kullanımına yol immünohistokimyasal teknikler ile saptanabilir. Bu yazıda, hipoksi veya Hiperkapniye solunum sistemi adaptasyonu dahil beyin sapı nöronal popülasyonlarının belirlenmesi üzerinde duruldu. Iki yaklaşım hayvanlarda in vivo nöral popülasyonlarının belirlenmesi amacı ile tarif edildi ve ex vivo deafferented beyin preparasyonlarda. İn vivo koşullarında, hayvanlar. Hiperkapnik ya da hipoksik gaz karışımlarının maruz ex vivo, deafferented preparasyonlar hipoksik ya hiperkapnik yapay serebrospinal akışkan madde ile süperfuz edildi. Her iki durumda da, ya kontrol in vivo hayvan ya da eX in vivo preparasyonlar normoksik ve normokapnik koşullar altında muhafaza edilmiştir. Bu iki yaklaşımın karşılaştırılması nöronal aktivasyon yani kökeni, belirlenmesini sağlayan periferal ve / veya merkezi. In vivo ve ex vivo, brainstems, toplanan sabit ve bölüme dilimlenmiş bulundu. kesitler hazırlandı kez, c-FOS proteini immünhistokimyasal tespiti hipoksik veya hiperkapnik uyarılarla aktive hücrelerin beyin sapı gruplarını belirlemek amacıyla yapılmıştır. Etiketli hücreler beyin sapı solunum yapılarda sayıldı. kontrol koşulu, hipoksi veya hiperkapni ile kıyaslandığında, böylece santral solunum sürücü adaptasyonu nöral yolların kurucu birkaç spesifik beyin sapı sitelerinde c-FOS işaretli hücrelerin sayısı arttı.
Introduction
C fos geni 1980 1,2 başında ilk kez belirlendi ve ürün gen aktivatör özellikleri 3,4 sahip olan bir çekirdek protein olarak 1984 yılında tanımlanmıştır. Bu nöron uyarılması ile ilişkili uzun vadeli mekanizmalarına katılır. Gerçekten de, nöronal aktivite değişiklikler transkripsiyon faktörü, c-fos üretimini indükleyen erken gen c-fos ekspresyonunu indükler ikinci haberci sinyal iletim yol açar. Ikinci geç genlerinin ekspresyonunu başlatan ve böylece uyarıcı 4 birçok farklı türde sinir sisteminin adaptif karşılıklara katılmaktadır. Böylece, 1980 5,6 yılı sonundan itibaren, c-FOS protein tayini sıklıkla nöronal yolları dışarı haritalama için genel 4'te ve merkezi sinir sistemi (MSS) aktivitesi üzerine gen transkripsiyonu üzerinde dışsal faktörlerin etkilerini incelemek için kullanılır olmuştur farklı fizyolojik yerark koşulları.
Bazal c-fos ekspresyonu fare, sıçan, kedi, maymun ve insan da dahil olmak üzere 4 çeşitli türlerde incelenmiştir. Böylece, kendi ifadesinin kinetiği nispeten iyi bilinmektedir. Transkripsiyon aktivasyon (5-20 dakika) 7,8 hızlıdır, ve mRNA birikimi stimülasyon 9 başlamasından sonra 30 ve 45 dakika arasında bir maksimuma ulaşır ve 12 dakika gibi kısa bir yarı-ömrü azalır. C-fos protein sentezi mRNA izler ve 20 ila 90 dakika sonrası uyarım 6'da imünohistokimya ile tespit edilebilir.
C-fos ekspresyonunun analizi klasik hipoksi ve hiperkapni 10-14 solunum yanıtlarında rol oynayan merkezi solunum ağı tanımlamak için, in vivo çalışmalarda kullanılmıştır. Daha yakın zamanda, bu araç da hipoksi veya h merkezi solunum ağ uyarlamalar keşfetmek için eks vivo beyin preparatlarda kullanılanypercapnia 15-18. Nitekim, bu preparatlar klasik santral solunum sürücüye 19 asimile ritmik bir aktivite oluşturur. Bu nedenle, bu hazırlık tür tamamen deafferented olma avantajına sahiptir ve bu nedenle, c-fos ekspresyonunu ilgili sonuçlar sadece periferal yapıların herhangi bir müdahale olmadan, merkezi bir uyarım sonuçlarını yansıtmaktadır.
c-fos algılama immünohistokimyasal ya da immunohistofluorescence yaklaşımlarla yapılabilir. Dolaylı immunodeteksiyon c-fos karşı birincil antikor ve birinci antikorun üretildiği türlere karşı yönlendirilmiş bir ikincil antikoru kullanılmasını gerektirir. Immünohistokimyasal yöntemle, ikincil antikor, bir alt-tabaka (peroksidaz için H2O 2) üzerinde hareket eden bir enzim (örneğin peroksidaz) birleştirilir. enzimatik reaksiyonun ürünü, bir kromojen (3.3-diaminobenzidin tetrahydrochlorid tarafından geliştirilene), burada leke ve ışık mikroskobu altında gözlemlenebilir. Reaksiyon nikel amonyum sülfat kullanılarak takviye edilebilir. Bu yöntemler, farklı fizyolojik uğraşlarınızda aktif nöronların algılama ve bu nedenle tanımlama ve / veya üst üste fizyolojik yanıtlar dahil periferik ve merkezi yolların eşleme sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: c-fos algılama çeşitli adımlar (Şekil 1) içeren standart bir prosedürdür. Bütün deneyler, sıçan veya fare üzerinde gerçekleştirilmiştir. Deneysel protokoller hayvan bakımı için 22 Eylül 2010 (2010/63 / AB) Avrupa Birliği Konsey Direktifine uygun olarak yapılır, Hayvan Deney Charles Darwin (/ 05/2011 CE5) Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve uygun şekilde yapılmıştır hayvan bakımı için Fransız yasaları.
Çözümler 1. hazırlanması
- 0.2 M sodyum fosfat tamponu hazırlayın: karıştırılarak 6.24 gr NaH 2 PO 4 * 2H 2 O ve 22.56 gr Na 2 HPO 4 * H2O 1 L damıtılmış su ilave edilir.
- % 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın: damıtılmış su, 150 ml PFA 20 g ekleyin. karıştırılırken 80 ° C'ye çözelti ısıtılır. çözüm temizlemek için, ısıyı azaltmak ve paraformaldehid çözülür yardımcı olmak için 1 N NaOH 1 veya 2 damla ekleyin. 250 mL Kompleve damıtılmış su ile 0.2 M fosfat tamponu (pH 7.4) 250 ml ekle. 4 ° C'de saklayın. Bu reaktifler kullanılarak, uygun özen gösterin. Bir kimyasal başlık altında eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük kullanınız.
Not: perfüzyonları önceki gün% 4 PFA hazırlayın. Yaş, sayı ve hayvan türlerinin bir fonksiyonu olarak% 4 PFA hacmini belirler. - soğuk önleyici solüsyon hazırlanması: 0.2 M fosfat tamponlu tuz, 250 ml, polivinil-pirolidon, 5 g, sükroz ve 150 g sodyum klorür 2.5 g karıştırın. Tamamen çözüldükten sonra, etilen glikol, 150 ml ilave edilir ve damıtılmış su ile 500 ml'ye ayarlanır. 4 ° C'de soğuk önleyici solüsyon saklayın.
- 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın: karıştırılırken 1 L damıtılmış suya NaCl, 18 g ekleyin. Tamamen çözüldükten sonra, sodyum fosfat tamponu ile 1 L 0.2 M ekleyin.
- Fosfat Tamponlu Salin% 0.3 ile takviye hazırlayın Triton X100 (PBST): Triton X10 3 ml ekleyinPBS 0 997 ml.
- 0.05 M Tris-tampon maddesi (pH 7.6) hazırlayın: karıştırılırken distile su, 500 ml 3.03 Tris-hidroklorür g ve 0.70 g Tris-bazlı bir ekleyin.
- , Bir plaka için çözelti 30 ml hazırlanması: PBST içinde% 2 keçi serumu hazırlayın. 30 ml PBST için keçi serumu 600 ul ekleyin ve iyice karıştırın. oyuk başına 2.5 ml.
Not: kullanılan serum, ikincil antikor üretimi için kullanılan türden gelmelidir - büyükbaş hayvan serum albümini (% 0.25) ile PBST içinde (4000, SC-52 1), c-fos proteine karşı tavşan poliklonal antikor hazırlayın. bir plaka için, çözelti 30 ml hazırlar. 30 mi PBST, büyükbaş hayvan serum albümini, 75 mg ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, C-fos proteine karşı tavşan poliklonal antikorun 7.5 ul ekle.
- serum albümin, sığır (% 0.25) ile PBST içinde: biyotinlenmiş keçi anti-tavşan antikoru (1: 500) hazırlanması. bir plaka için, çözelti 30 ml hazırlar. 30 mi PBST, büyükbaş hayvan serum albümini, 75 mg ekleyin ve iyice karıştırın. Sonra Eklebiyotinile edilmiş keçi anti-tavşan antikoru 60 ul.
- Hazırlama avidin-biyotin-peroksidaz (1: 250), kompleks PBST (ABC solüsyonu). bir plaka için, çözelti 30 ml hazırlar. Reaktif A 120 ul ve 30 ml PBST reaktif B 120 ul ilave edin ve iyice karıştırın.
Not: ABC çözeltisi kullanımdan önce en az 30 dakika hazırlanmalıdır. - substrat çözeltisi hazırlayın. Kullanımdan hemen önce, (bir levha) aşağıdaki gibi bir çözelti hazırlamak: nikel, amonyum sülfat, 20 mg ve 50 ml Tris-tamponu 3.3-diaminobenzidin tetrahidroklorid 10 mg ekleyin. Filtre ve ışıktan korur. oyuk başına 2.0 ml ilave edilir. Geri kalan çözelti (25 mL) içinde H 17 ul H2O 2 (H2O 2 çözeltisi H2 O içinde% 30) ekleyin. oyuk başına 2.0 ml ilave edilir.
Not: Bu reaktif kullanırken Uygun dikkatli olunmalıdır. eldiven ve laboratuvar kat kullanınız.
2. c-fos lnduIn Vivo ction ve Doku İşleme
Not: Deneyler fareler (Sprague Dawley) ve farelerde (C57BL / 6) gerçekleştirilmiştir.
- 2 saat (Şekil 2A) için hipoksik (O 2% 8 dengeli bir N2) ya da hiperkapnik (CO2% 4, O 2% 21 dengeli bir N2) gaz karışımı ile havalandırılmış hava geçirmez kutuya hayvanlar koyun.
- pentobarbital intraperitonal enjeksiyon (100 mg / kg) ile hayvan anestezi uygulayın. % 4 PFA 20 hayvan transkardiyal serpmek. Bir kimyasal başlık altında bakım ve kullanım eldiven kullanınız.
- Perfüzyondan sonra beyin 20 incelemek ve 4 ° C sıcaklıkta 48 saat boyunca 15 ml'lik bir tüp içinde% 4 PFA 7 ml batırın. Sonra PFA gelen beyin kaldırmak ve soğuk önleyici solüsyon içinde tamamen bırakın. -18 ° C (Şekil 3) saklayın. Uygun atık işleme pa tarafından hayvanın vücudunun geri kalanı imhathway.
Not: donmaya karşı koruma PFA fiksasyon ve donma arasındaki adımdır. Bu olan dondurma amorf formunda olacaktır çözeltisi ile hücrelerde buz kristallerinin oluşmasını azaltır. Sabit numuneler, 4 ° C'de en az 24 saat süre ile (adım 1.3 hazırlandı) kriyokoruyucu çözelti içinde emprenye edilmelidir. kimyasal başlık altında bakım ve eldiven kullanınız.
3. c-fos indüksiyon ve Doku İşleme Ex Vivo
Not: Deneyler, sadece yeni doğmuş sıçan veya farelerde gerçekleştirilmiştir.
- Suzue 19 tarafından açıklandığı gibi MSS izole eder. MgCI2, 26.0 130.0 NaCl, 5.4 KCl, 0.8 CaCl2, 1.0: bir kayıt odası içine yerleştirin ve 26 ° C'de 21 (ACSF 7.5 mL / dk'lık bir oranda suni serebrospinal sıvı ile sürekli olarak superfuse: mM NaHCO 3, 30.0 D-glikoz,% 95 O2 ve 5 gaz verilerek O 2 ile doyuruldu ve pH 7.4'e ayarlanmıştır% CO2) (Şekil 2B).
- % 95 O2 ile fokurdatıldı hipoksi ya da 10.0 mm 'ye düşürüldüğü NaHCOs 3 ile asidifiye aCSF (standart aCSF ile deoksijene CSF (% 95 N2 ve% 5 CO2, pH 7.4 ile kabarcıklar halinde aynı bileşime) ile aCSF yerine hiperkapni% 5 CO2). 30 dakika (Şekil 2B) için stimülasyon uygulayın.
- Ex vivo, indüksiyon süresi sonrasında, daha sonra kullanmak (Şekil 3) için bir kriyokoruyucu çözelti içinde -18 ° C de 48 saat ve mağaza 2.5 ml tüp içinde 2.5 ml% 4 PFA yeni doğmuş fare ve sıçan CNS aktarın.
Not: ex vivo, hayvanlar perfüze edilmesi için gerekli değildir. Bir önceki çalışmada küçük numuneler çapı 10 mm'den basit difüzyon 22 ile tespit edilebilir ölçüm düşündürmektedir. aldehit için (dokuya fiksatif difüzyon için mm cinsinden mesafe,) penetrasyon bir alıntı oranı 2 veya 3 mm / saat olduğunu.4. Beyin Kesit
Not: sona erdirmek için bu aşama kaynaktan, protokol katı, in vivo ve ex vivo indüksiyonu için aynıdır.
- dilimleme önce, bir tek tek iyi bir 12-çukurlu plaka yerleştirin ve her bir PBS 2.5 ml yerleştirin.
- Bir kriyostat ile beyin sapı seri koronal kesitler (40 mikron) yapın ve 12 plaka bunları toplamak. Tüm yetişkin beyin sapı için, yaklaşık 70 dilim (Şekil 3) yapmak.
Not: bir plaka paralel çok sayıda hayvan Kısım doku mümkündür.
5. Immünohistolojik Prosedürler (Tablo 1)
Not: süreci boyunca, bölümler de ekler kalır.
- Gün 1 - Endojen peroksidaz aktivitesi yok edilmesi, spesifik olmayan bağlanma sitesi blokajı ve primer antikor ile inkübasyon (Şekil 4)
- YıkamaOda sıcaklığında, 0.1 M PBS ile 10 dakika boyunca bölümler (oyuk başına 2.5 mi). 3 kez tekrarlayın.
- Hidrojen peroksit H, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca koronal kesitler inkübe edilerek bir endojen peroksidaz etkinliğini bastırır 2 O 2,% 3, 0.1 M PBS (oyuk başına 2.5 mi) içinde.
- Oda sıcaklığında, 0.1 M PBS ile 10 dakika boyunca (oyuk başına 2.5 mi) bölümler yıkayın. 3 kez tekrarlayın.
- PBST içinde keçi serumu (% 2) ile birlikte oda sıcaklığında 1 saat için koronal kesitler inkübe edilerek spesifik olmayan bağlanma sahasını bloke eder.
- büyükbaş hayvan serum albümini (% 0.25) (oyuk başına 2.5 mi) ile PBST içinde (4000, SC-52, 1), c-fos proteine karşı tavşan poliklonal antikoru ile 4 ° C 'de 48 saat süre ile koronal kesitler inkübe edin.
- Gün 3 - sekonder antikor ve renk reaksiyonunun gelişimi ile inkübasyon (Şekil 4)
- Oda sıcaklığında PBS, 0.1 M, 10 dakika (oyuk başına 2.5 mi) bölümler yıkayın. 3 kez tekrarlayın.
- tasarlamakbüyükbaş hayvan serum albümini (% 0.25) (oyuk başına 2.5 mi) ile PBST içinde: biyotinlenmiş keçi anti-tavşan antikoru (1: 500) ile birlikte oda sıcaklığında 1 saat için koronal kesitler.
Not: Araştırmacı, bu aşamada, bir flüoresan probun bağlanmış ikincil antikor kullanılabilir. Bu durumda, bu aşamada protokolü durdurmak ve bir floresan mikroskop kullanılarak doğrudan inceleyin. - Oda sıcaklığında PBST ile 10 dakika (oyuk başına 2.5 mi) bölümler yıkayın. 3 kez tekrarlayın.
- 1 saat boyunca koronal bölümleri inkübe bir avidin-biyotin-peroksidaz (1: 250), kompleks (oyuk başına 2.5 mi) PBST içinde.
- Oda sıcaklığında PBST ile 10 dakika (oyuk başına 2.5 mi) bölümler yıkayın. 2 kez tekrarlayın.
- Oda sıcaklığında, 0.05 M Tris-tamponu, 10 dakika (oyuk başına 2.5 mi) bölümler yıkayın. 2 kez tekrarlayın.
- 0.05 M Tris-tampon maddesi içinde% 0.02 3,3-diaminobenzidin tetrahidroklorid,% 0.04 nikel, amonyum sülfat ve% 0.01 hidrojen peroksit koronal bölümleri inkübe (pH 7.6), birt RT (oyuk başına 2.0 mi). Geri kalan çözelti (25 mi) ilave 17 ul H2O 2 (H2O 2 çözeltisi H2 O içinde% 30) (oyuk başına 2.0 mi) içinde.
Not: Araştırmacı ışık mikroskobu altında geliştirme sürelerini belirlemek gerekir. Bununla birlikte, 5 ila 10 dakika iyi bir boyama yoğunluğu sağlar. - Boyanma yoğunluğu uygun olduğunda, oda sıcaklığında, 0.1 M PBS ile 10 dakika boyunca (oyuk başına 2.5 mi) bölümler yıkanarak reaksiyonu durdurmak, (ışık mikroskobu altında kontrollü, Şekil 5 ve Şekil 6). 4 kez tekrarlayın. Daha sonra, saf su ile bölümleri yıkayın.
- Örnekleme montaj (kimyasal başlık altında bakım ve eldiven ile ele)
- seri slaytlar ve kurumaya üzerine monte bölümleri. Bunun için, dikkatli slaytlarda fırça ile postero-kaudal sırayla bölümleri yayıldı. Açıkça numune göre slaytları etiket.
- Mutlak al ile kurutmakcohol: mutlak alkol banyosunda oda sıcaklığında 30 saniye boyunca slaytlar batırmayın. İki kez tekrarlayın.
- ksilen ile net: oda sıcaklığında 3 dakika boyunca ksilen banyosunda slaytlar batırmayın. İki kez tekrarlayın.
- orta montaj slaytlar lamel. Bunun için, slayt üzerinde montaj orta 5 damla uygulayın ve sonra hava kabarcıkları dışarı sürerek cam kapak uygulanır. Hava, kuru, 48 saat boyunca.
6. Veri ve İstatistiksel Analiz
- ışık mikroskobu altında bölümleri inceleyin. Görme standart işaretlerini 23,24 kullanarak yüksek büyütme (200x) de FLI nöronlar sayılır. c-fos noktasal boyama nöronların çekirdeklerin içinde yer almaktadır.
- Her analiz alanı için bölüm başına c-FOS-pozitif hücrelerin sayısını saymak ve kontrolü ve uyarılan koşulları arasındaki ortalama sayısını karşılaştırın. Verilerin normallik bağlı olarak, eşleşmemiş student t testi veya Mann-Whitney testi kullanın. Farklılıkların, p ise anlamlı kabul edildi0 0.05. Bir çizim tüp mikroskop bağlı ve bir dijital kamera ile fotoğraflandı (Şekil 5) kullanarak bir çizim (büyütme 100x) üzerine FLI nöronların dağılımını çizilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C-fos algılama gibi in vivo (Şekil 2a) hipoksi ve hiperkapni veya bu koşulların ex vivo olarak (Şekil 2B) taklit durumlarda, belirli koşullar altında aktive edilmiş hücrelerin belirlenmesi gruplarını sağlayan bir araçtır. İn vivo koşullarında, yeni doğmuş, genç ya da yetişkinlere kemirgen gaz halindeki bir ortam sürekli tam 30 ila 180 dakika 13,25,26 (Şekil 2A) için tanımlandığı bir bileşim ile bir gaz karışımı ile yenilenir olan hava sızdırmaz bir kutu içine yerleştirilmiştir. Bütün vücuda stimülasyon eylemleri gibi, c-fos, ilgili değişiklik, merkezi ve çevresel aktif yolları hem yansıtıyor olabilir. Ex vivo, medulla oblongata ve omurilik içeren deafferented preparasyonlar sürekli farklı seviyelerde olan bir ACSF superfused bir bölme içine yerleştirilmiştir hipoksik ya hiperkapnik koşulları modellemek amacıyla, O 2 ya da pH (
Merkezi sinir sistemi, in vivo sistemik dolaşım yoluyla perfüzyon yoluyla, PFA ile sabitlenmiş ya da olan bir daldırma ex vivo olarak (Şekil 3) ile incelenmiştir. Bu farklılık nedeniyle, sabitleyici difüzyon daha ex vivo, in vivo olarak daha uzundur. Böylece, c-FOS sinyali özellikle derin yapılarda, etkilenebilir. C-fos analiz her zaman kontrol arasındaki karşılaştırmalı bir yaklaşımla gerçekleştirilmiştir ve in vivo hayvan ya da ex vivo preparasyonlarda uyarılır Ancak, bu fark kontrol sıkı bir karşılaştırma sonuçları müdahale ve veri uyarılmış değildir. Bundan sonra, MSS, cryoprotected kesitli ve im meşgul oldumunohistochemical prosedür (Şekil 3, Şekil 4). Bu şekilde, bazı solunum beyin bölgeleri, CO 'nin başlıca merkezi Alanı 2 kemo-alış 10,13,28,29 olan retrotrapezoid çekirdeği (DÖNÜŞ) de dahil olmak üzere, hipoksik veya hiperkapnik zorlukları altında aktivitesini modifiye in vivo olarak tanımlanmıştır ventrolateral medulla karotis organları giriş 13,25,26,30 (Şekil 5 projeksiyon alanları (/ mnts c) inspiratuar ritim jeneratörü 13, commissural ve nükleus traktus solitarius medyan bölümden oluşmaktadır (VLM), ), ve medüller rafe çekirdekleri 12,13.
Ex vivo, deafferented koşullarda, RTN ve VLM nöronları indirgenmiş O 16-18 Şubat koşulları altında, c-fos immünoreaktivitesi değiştirme tarif edilmiştir. c-fos derunma Ayrıca, aktive edilmiş hücreler 14,31 fenotipinin karakterize etmek için diğer immünohistokimyasal algılamaları ile birleştirilebilir
Hipoksi veya hiperkapni Solunum uyarlamalar ilgilendim Nöronal Yapılar Harita c-FOS Algılama Kullanımı için Şekil 1. Çalışma Dizaynı. MSS c-FOS algılama tekniği Kronolojik adımlar. CNS: Santral Sinir Sistemi; İHK:. İmmünhistokimya bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2, c-fos indüksiyonu (A). In vivo indüksiyonu protokolü. Bir hayvan hermetik C yerleştirilmiştirhamber ve hava (% 21 O2;% 79 N2) ya da maruz kalan, hiperkapnik (% 21 O2;% 4 CO2,% 75 N2) ya da hipoksik (% 10 O2;% 90 N2) gaz 2 saat süre ile bir karışımı. (B) Ex vivo indüksiyon protokolü. CNS 0 ila 4 gün arası yenidoğan kemirgen dışarı disseke edildi. Medulla oblongata ve omurilik hazırlıklarını elde etmek için büyütme altında izole edildi. Bunlar 26 ± 1 ° C 'de aCSF (pH 7.4) ile süperfüze yukarı bakacak şekilde ventral yüzeyi olan bir bölme içine yerleştirilmiştir. In vivo Modelleme hipoksik uyarım% 95 N 2 ve% 5 CO 2 içeren bir anoksik gaz karışımı köpüren tarafından aCSF içinde O 2 kısmını azaltarak gerçekleştirildi. In vivo hiperkapnik uyarımı modelleme NaHCO 3 konsantrasyonunun (azalış) açısından normal aCSF farklılık bir asit aCSF kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Asit aCSF O 2 ve Adju ile doymuş% 95 O2 ve% 5 CO2 ile köpürme pH 7.23 ile sted. Her uyarım durumu 30 dakika boyunca tatbik edilmiştir. aCSF. yapay beyin omurilik sıvısı bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. sinir merkezi sistemi, örnekleme. İn vivo koşullarında, merkezi sinir sistemi vasküler sistem üzerinden perfüze% 4 paraformaldehid ile tespit edici işlemden sonra diseksiyon ile elde edildi. Ex vivo, merkezi sinir sistemi ile doğrudan ayrıldıktan sonra,% 4 paraformaldehid içinde daldırılmıştır. Daha sonra, merkezi sinir sistemi, bir kriyokoruyucu çözeltisine daldırma ile kriyo-korumalı bir kriyostat kullanarak 40 mikron kalınlığındaki taç kesitler halinde kesilmiştir. medulla Rostro-kaudal bölümler befor PBS içeren 12 oyuklu bir plaka içerisinde yerleştirildie immünohistokimyasal işlemler. CNS: Santral Sinir Sistemi; PBS:. Fosfat Tamponlu Tuzu bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. dolaylı immünohistokimyasal yöntemleri. Bölümleri önce, c-fos proteine karşı tavşan poliklonal birincil antikor ile inkübe edilmiştir. Daha sonra, birincil antikor karşı biyotinile edilmiş keçi anti-tavşan ikincil antikoru ile tedavi edildi. Bu inkübasyonun ardından, kesitler sinyali güçlendirme özelliğine sekonder antikor sıkıca bağlanan bir avidin-biyotin-peroksidaz kompleksi ile tedavi edildiler. Gerçekten de, kompleks, yüksek boyama yoğunluğuna gelen birçok peroksidaz moleküller içerir. Son olarak, bölümler 3.3-diamino bir çözeltisi kullanılarak boyandıobenzidine tetrahidroklorür ve peroksidaz enzimi varlığında koyu gri çökelti üreten nikel amonyum sülfat. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5 in vivo hipoksi gönderilen kontrol farelerinde ve farelerde medulla oblongata bölümleri c-fos pozitif nöronlarının. Paxinos ve Franklin 24 (bregmadan -7, 48 mm uyarlanan medulla oblongata bir bölümü (A) Çekme ). Noktalı alan nükleus traktus solitarius c / MNC commissural ve medyan parçaları delimitates. kutusu Mikroskobik (B1 ve B2) ile izah yapıları gösterilmektedir. (B) Photomicrographs c / mnts seviyesi normoxia (B1. kontrolü, siyah çerçeve) veya hipoksi altında (B2. mavi çerçeve) (x100) uygulandı. Siyah oklar, c-fos-pozitif hücrelerin göstermektedir. (C) normoxia (siyah çubuk) veya hipoksi (mavi bar) altında c / mnts düzeyinde Bölüm başına c-FOS-pozitif hücrelerin ortalama sayısını gösteren Histogram. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edilir. * Normoxia ve hipoksi değerleri arasında anlamlı bir fark gösterir - Öğrenci eşleştirilmemiş t testi; *** P <0.001. CC: omuriliğin merkezi kanal; c / mnts. nükleus traktus solitarius ve commissural ve medyan parçalar bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1. Immünohistolojik Prosedürü. CF kronolojik adımlarİşletim prosedürü. AB-I, birincil antikor; Ab-II, ikincil antikor; BSA, sığır serum albümin; DAB, 3.3-diaminobenzidin tetrahidroklorür; Ni, nikel, amonyum sülfat; PBS 0.1 M, 0.1 M fosfat tamponlu tuz (pH 7.4); PBST, 0.1 M fosfat tamponlu tuz ile takviye edilmiş% 0.3 Triton X-100; Serum, ikincil antikor üretimi için kullanılan türlerden alınan serum. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C-fos, bir erken gen, ve bunun, ürünün tespiti, c-fos protein klasik in vivo 11,13,25,28 belirli respiratuvar nöral popülasyonlarının belirlenmesi için kullanılan ve ex vivo 16-18 27,32,33.
Protokolün içinde kritik adımlar
perfüzyon adımı sırasında dikkatli olun. % 4 PFA çözüm iyi hazırlanmış olmalı ve sabitleme ve post-fiksasyon adımlar optimum dilimleme ve boyama elde etmek için yeterince uzun olmalıdır. Ayrıca, vahiy prosedürünün en önemli adımdır; Steyn etmenin yoğunluğu arka plan gürültüsünü önlemek için kontrol edilmelidir.
Mevcut Yöntemlerine Göre Tekniği ve Önemi Avantajları
Bazı nöronlar, beni bu c-fos geni 5 ifade görünmemektedir rağmenmetod ile sinir yolları, kimyasal zorluklar sırasında solunum ritim uyarlamasında, örneğin aktif belirlemek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Diğer hemen erken gen ile karşılaştırıldığında, c-fos, bir test durumu 6 altında, nöronal aktivitenin daha kolay sayılmasına olanak tanıyan, uyarı olmadan düşük bir ifade yer alır.
c-fos algılama çok uyarıcıya yanıt olarak dahil sinir hücresi popülasyonlarını analiz etmek için aktivite genel değişiklikleri gösteren bir hücresel bir tekniktir. Aktif tanımlamak için, bu nedenle hücre sayıda aktivite değişiklikleri takdir belirlenmiş bir beyin bölgesindeki hücrelerin sadece küçük bir zaman endişeleri en, c-fos tespiti bir izin veren bir elektrofizyolojik yaklaşımı kullanarak nöronal aktivite analizi ile karşılaştırıldığında bütün MSS alanları. C-FOS algılama elektrikli tarafından nöronal aktivitenin kayıt sırasında durum böyle değil, pervasız ve uyanık hayvanlar ile kolayca uyumluophysiology. stresi ve elde edilen sonuçlar ile anestezik girişimi önler, çünkü bu bir avantajdır.
Ex vivo biz stimülasyon 30 dakikalık bir süre kullanılmıştır. Daha önce, bu uyarım nöronal seviyede 34-36 si c-fos ekspresyonu değişiklikleri oluşturmak için yeterli olduğu gösterilmiştir. Stimülasyon beş dakika 15-20 dakika 37 bir latent dönem sonra gözlenir c-fos ekspresyonu değişiklikleri uyarılması için yeterli olmaktadır. C-fos ekspresyonu benzer artışlar uyarımın ilk 10 dakika boyunca aktivitesi yer alarak değişiklikler ile ilişkilidir.
Tekniğin Sınırlamalar
Uyarmayı müteakip, bir gecikme çekirdeğinde, c-fos birikmesi gerekli olacaktır. yaklaşık 30 dakika bu gecikme, mRNA ve protein sentezi karşılık gelir. Bu öğe obta olabilir sonuçların yakınlık karşı çıkıyorelektrofizyoloji ile nöronların aktivitesini kaydederek çağırın. Bu özel ve geçici uyaran sonrası nöronal aktivitenin hızlı değişimler hakkında bilgi kaybına neden olabilir.
C-fos proteini 100 dakika 4 90 bir yarı-ömre sahip gibi, ekspresyonu çevresi hayvan manipülasyonu olarak, sınırlama veya değişikliklerle ilişkili cerrahi prosedürler veya stres etkilenebilir. Bu nedenle, incelenen uyarıcı ile ilgili olmayan nöronal aktivitenin değişikliklere neden olabilir ve fizyolojik uyarıcı sonunda hemen sonra, doku örnekleme yapmak manipülasyonlar en aza indirmek için gereklidir.
Tekniğin Değişiklikler ve Sorun Giderme
Bu protokolde, vahiy adım 3.3-diaminobenzidin tetrahidroklorür, nikel amonyum sülfat ve hidrojen peroksit içeren bir çözüm kullanılan, ancak peroksidaz ticari kitler al olabilirbu nedenle bu aşama için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture plate 12-well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
References
- Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
- Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells. Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).
- Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell. 36, 259-268 (1984).
- Herdegen, T., Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).
- Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).
- Greenberg, M. E., Ziff, E. B. Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature. 311, 433-438 (1984).
- Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells. J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).
- Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc. Nature. 312, 716-720 (1984).
- Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats. Brain Res. 635, 353-356 (1994).
- Teppema, L. J., et al. Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia. J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).
- Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. c-fos-like immunoreactivity in the cat's neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia. J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).
- Bodineau, L., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neuroscience. 108, 643-653 (2001).
- Erickson, J. T., Millhorn, D. E. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem. J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).
- Bodineau, L., et al. Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
- Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro. J Physiol. 577, 55-68 (2006).
- Voituron, N., et al. The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group. Neuroscience. 194, 95-111 (2011).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , e3564 (2012).
- Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording. J Vis Exp. , e53071 (2015).
- Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4th ed, Academic Press. CA. (1998).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd ed, Academic Press. CA. (2001).
- Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats. Brain Res. 857, 30-40 (2000).
- Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus. Brain Res. 877, 149-159 (2000).
- Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).
- Takakura, A. C., et al. Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol. 572, 503-523 (2006).
- Mulkey, D. K., et al. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats. Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).
- Finley, J. C., Katz, D. M. The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res. 572, 108-116 (1992).
- Bodineau, L., et al. Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats. Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).
- Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats. J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).
- Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Neuroscience. 127, 505-518 (2004).
- Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science. 237, 192-197 (1987).
- Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science. 240, 1328-1331 (1988).
- Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).
- Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments. Brain Res. 954, 100-114 (2002).
