Abstract
knockdowns mediada por RNA são amplamente utilizados para controlar a expressão do gene. Esta família de técnicas versátil faz uso de ARN curto (sRNA) que pode ser sintetizado com qualquer sequência e concebido para complementar a qualquer gene alvo para silenciamento. Porque sRNA construções podem ser introduzidas para muitos tipos de células, directa ou usando uma variedade de vectores, a expressão do gene pode ser reprimida nas células vivas sem modificação genética trabalhoso. O ARN mais comum tecnologia knockdown, a interferência de ARN (ARNi), faz uso da sequência de reconhecimento complexo de silenciamento (RISC) induzido por ARN para mediar endógena e a clivagem do ARNm alvo. Aplicações desta técnica são, por conseguinte, limitadas a organismos que expressam RISC, principalmente eucariotas. Recentemente, uma nova geração de ARN biotechnologists desenvolveram mecanismos alternativos para controlar a expressão do gene através de ARN, e assim tornada possível knockdowns de genes mediada por RNA de bactérias. Aqui nós descrevemos um método para silenciar genes expresSion em E. coli que funcionalmente se assemelha RNAi. Neste sistema, um fagomídeo sintético é desenhado para expressar sRNA, que podem concebidos para ter como alvo qualquer sequência. A construção de expressão é entregue a uma população de E. células de E. coli com o fago M13 não lítico, após o que é capaz de se replicar de forma estável como um plasmídeo. Reconhecimento de anti-sentido e silenciamento do ARNm alvo é mediada pela proteína HFQ, endógena para E. coli. Este protocolo inclui métodos para a concepção da sRNA anti-sentido, a construção do vector fagemídeo, o empacotamento do fagemídeo em bacteriófago M13, a preparação de uma população de células vivas para a infecção, e realizando a infecção em si. A proteína fluorescente mKate2 eo cloranfenicol acetiltransferase gene de resistência a antibiótico (CAT) são direcionados para gerar dados representativos e quantificar a eficácia knockdown.
Introduction
knockdowns de genes mediada por ARN de proceder em duas fases. Em primeiro lugar, uma molécula de RNA é introduzido a uma linha de célula ou organismo de estudo. Em segundo lugar, as proteínas de ligação a ARN endógenos facilitar o reconhecimento de ARN-alvo e produzir o efeito de silenciamento. Todas as tecnologias de ARN knockdown beneficiar da natureza personalizada de sRNAs sintéticas, que podem ser facilmente produzidos a corresponder a um alvo específico de interesse. No entanto, os detalhes moleculares de captação de ARN e silenciamento variam amplamente entre sistema modelo, restringindo onde e como knockdowns ARN pode ser aplicada.
Em nemátodos, ARN de cadeia dupla moléculas (dsRNA) pode ser introduzido directamente nos meios de alimentação ou por os vermes com uma população de ARNcd-expressando E. células de E. coli 1,2. Em Drosophila, RNAi pode ser conseguida por microinjecção de embriões com três ARNcd, ou aplicada em linhas de células por simples adição de ARNdc para o meio de cultura quatro. Em linhas celulares de mamífero,sintéticos pequenos ARN interferentes (siRNAs) podem ser entregues a células vivas por electroporação 1,2,5, empacotado em lipossomas 3,6, ou expressas a partir de vectores de DNA do plasmídeo 4,7. Uma vez que as espécies de ARN atinge o citossol, a via de RNAi baseia-se no complexo RISC para processar ARNcd, anti-sentido de facilitar o reconhecimento do alvo, e catalisar a repressão de translação, a degradação de ARNm, ou a formação de heterocromatina, dependendo do hospedeiro.
Devido a esses requisitos, clássica RNAi pode ser realizada apenas em organismos que ocupam RNA exógeno de forma eficiente e expressam RISC ou uma atividade RISC-like. Notavelmente, isto exclui o modelo bactéria E. coli, que não possui a via de RNAi. No entanto, os recentes avanços na biologia sintética fornecer as ferramentas para resolver tanto o problema da entrega eo problema silenciamento.
Neste protocolo, as construções Srna estão expressos em E. coli a partir de um vector de ADN entregue a Living células utilizando o sistema de fagemídeo / ajudante M13. Um fagemideo é qualquer plasmídeo com uma origem F1 derivadas de fagos de replicação. Um plasmídeo auxiliar, neste caso M13KO, carrega toda a maquinaria necessária para a produção de partículas virais, mas não em si é competente para replicação e empacotamento. Quando um fagemídeo e o plasmídeo ajudante são co-transformada, o fagemídeo sozinho é replicada na origem f1, embalados e segregada. O fagemídeo vectorizado é então competente para infectar E. vivo coli através do pilus F.
Neste sistema, o efeito silenciador é produzido por cassetes srna costume combinando uma sequência de suporte com uma sequência de ligação ao alvo. A sequência de ligação ao alvo é de 24 pares de bases anti-sentido a um ARNm alvo, normalmente no local de ligação ao ribossoma (RBS). A sequência de suporte, desenvolvido pela Na e colegas 8, contém um motivo de ligação HFQ extraído de MICC, um pequeno ARN de regulação endógeno para E. coli. A proteína HFQ estimula ARN-ARN binding e degradação do mRNA, que serve um papel neste sistema semelhante ao RISC em RNAi. A Figura 1 representa um esquema completo para knockdowns srna mediada por fago, incluindo a estrutura sRNA cassete, vectorização fagemídeo, e um mecanismo de silenciamento.
Como um método para modular a expressão do gene em E. coli, sRNA silenciamento é simples, rápida e versátil. A E. alvo coli não é sobrecarregado além de propagar o fagemídeo e expressando a sRNA. Isto pode ser relevante no contexto da biologia sintética ou pesquisa básica em que a expressão de construções heterólogas maiores podem forçar os recursos celulares 9. Os fagemídeos com novos alvos pode ser produzido com uma única PCR e colhido um dia depois da transformação fagemídeo. Finalmente, quase todo o mRNA podem ser alvo. A cassete de regulação sRNA (num plasmídeo padrão) foi mostrado para trabalhar sobre uma variedade de alvos no metabolismo com níveis de repressão típicos> 90% 8.
10. Em primeiro lugar, um fagomídeo empacotado é introduzido a uma cultura em lotes de E. células de E. coli e utilizada para silenciar a expressão da proteína fluorescente mKate2. alterações de fluorescência subsequentes são monitorados em tempo real. Em segundo lugar, derrubar o gene CAT é mostrado para reduzir a resistência ao cloranfenicol fenotípica em placas de agar. Em ambos os casos, o próprio fagemídeo transporta um marcador GFP, permitindo que a taxa de infecção a ser medida independentemente da eficiência knockdown.
Protocol
1. Projeto e Construção de fagemídeo vetores Tendo sRNA silenciamento Cassetes
- De Novo Projeto de Srna silenciadas Cassetes 8
- Identificar a sequência completa do mRNA a ser silenciado utilizando uma base de dados de sequência de ADN. Para gerar a sequência alvo, observar as primeiras 24 pb da sequência de codificação, a partir da posição 1-24 começando com o codão de início (por exemplo, ATG).
Nota: O silenciamento é menos eficiente quando outros sites ou segmentos do mRNA são direcionados 8. - Leve o complemento inverso da sequência alvo para produzir a sequência de guia para a cassete sRNA. Ver Tabela 1 para exemplos de sequências alvo e guia para cloranfenicol acetiltransferase (CAT).
- Para projetar a cassete completa expressão sRNA 292 bp, organizar o promotor PR, sequência GUIA, domínio HFQ proteína de ligação e sequências de terminação da transcrição T1 / TE em série (Tabela 2).
- Adicionar sítios de clonagem adicionais de escolha para facilitar a clonagem da cassete de sRNA no vector alvo.
- Obter a cassete completa sRNA através de síntese de genes comercial ou um método semelhante e cloná-lo em qualquer vector fagemídeo com uma origem de replicação f1 funcional 11. Consulte Informações de Apoio para a sequência completa do vector fagemídeo final.
- Identificar a sequência completa do mRNA a ser silenciado utilizando uma base de dados de sequência de ADN. Para gerar a sequência alvo, observar as primeiras 24 pb da sequência de codificação, a partir da posição 1-24 começando com o codão de início (por exemplo, ATG).
- Alterando a sequência alvo de uma cassete sRNA expressão existente usando o Site baseado em PCR Directed Mutagênese 12
- Identificar a sequência GUIA 24 pb em uma cassete de expressão sRNA existente. Nota: O plasmídeo pAB.001 anotada, utilizada neste trabalho, está disponível como um arquivo sequência suplementar.
- Projeto iniciadores com regiões curtas de homologia com a cassete sRNA existente ladeando a nova sequência GUIA 24 pb para a frente e para trás. Obter os iniciadores através de síntese de oligonucleótidos comercial.
Nota: o desenho de primers para a mutagénese dirigida é depicted na Figura 2. sequências molde de primers Exact são fornecidos na Tabela 3. - Prepara-se uma cultura de 5 ml de E. coli transportando o molde fagemídeo sRNA expressão. Deixar crescer as células durante a noite a 37 ° C com agitação, em meio LB com antibióticos apropriados.
- Extrair e purificar o modelo de expressão fagemídico do sRNA 5 ml de cultura bacteriana utilizando um kit de miniprep de ADN ou método semelhante 12.
- Prepare a duas reacções de PCR utilizando o modelo de fagemídeo sRNA expressão e de alta fidelidade da polimerase, um a frente e com um iniciador inverso com a (Tabela 4). Use As condições de PCR, tal como recomendado pelo fornecedor da polimerase (Tabela 5). Aumentar a concentração de molde de 10-50x maior do que um padrão de reacção para dar conta do facto de a reacção com uma única escorva não produz a amplificação exponencial.
- Combinam-se as duas reacções de PCR acima num tubo de microcentrífuga. AnneaL os produtos por aquecimento até 98 ° C num banho de água a ferver. Imediatamente após a colocação do tubo de microcentrífuga no banho de água, remove a fonte de calor e permitir que o banho de voltar lentamente para a temperatura ambiente ao longo de 1-2 h.
- Para eliminar a expressão fagemídeo modelo sRNA não mutada, adicionar 1 ul. enzima de restrição Dpnl para a mistura e incubar a 37 ° C durante 1 hora, ou o tempo recomendado pelo fabricante para a digestão completa.
Nota: DpnI digere locais-alvo única metilados, que estão presentes em fagem�eos replicados por host, mas não produtos de PCR. - Transformada adquiridos ou preparados 13 quimicamente competente E. coli com 1-5 ul do produto de PCR recozido. Isolar colónias individuais da estirpe transformada por plaqueamento selectivo em placas de agar LB contendo antibióticos apropriados.
- Para verificar a incorporação da sequência de orientação correcta, o ecrã de colónias resultantes por PCR de colónias. Utilizando uma ponta de pipeta de 200 uL, collect uma pequena quantidade de células de uma única colónia transformada. Mark e preservar a colônia original para uso a jusante após a verificação.
- Adicionar as células recolhidas a 50 ul de água isenta de nuclease num tubo de microcentrífuga. Misturar por pipetagem cima e para baixo.
- Usando um termociclador de bancada ou num banho de água a ferver, a lise das células por meio de aquecimento a 95 ° C durante 2 min.
- Amplificar por PCR a região fagemídeo usando 1 ml de células lisadas termicamente, tal como um molde de ADN. As condições de PCR e protocolos termociclador são fornecidos nas Tabelas 6 e 7. Consulte o arquivo sequência pAB.001 suplementar para sequências de verificação de primers.
- Sequenciar o produto de PCR para verificar a incorporação da sequência GUIA correta.
- Inocular uma cultura de 5 ml da E. clone coli carregando o fagemídeo expressão sRNA verificou-sequência. Deixar crescer as células durante a noite a 37 ° C com agitação, em meios selectivos LB.
- Prepare um estoque de gliceroldo clone verificou-sequência. Adicionar 750 ul da cultura durante a noite a 250 ul de 60% de glicerol num tubo de crio com tampa de rosca.
- Armazenar o estoque de glicerol a -80 ° C por tempo indeterminado. O restante da cultura durante a noite pode ser utilizada como uma fonte para a expressão fagemídeo sRNA no passo 2.
2. Produção e Colheita de Stocks fagemídeo M13-embalados
- Prepara-se uma cultura de 5 ml de E. coli transportando a expressão fagemídeo sRNA. Deixar crescer as células durante a noite a 37 ° C com agitação, em meio LB com antibióticos apropriados. Nota: A expressão fagemídeo sRNA podem ser obtidas por meio da clonagem de novo, conforme descrito no passo 1.1.5, ou modificada a partir de um fagomídeo existente e colhido no passo 1.2.16.
- Do mesmo modo preparar uma cultura de 5 ml de E. coli portadora do plasmídeo ajudante M13KO7. Deixar crescer as células durante a noite a 37 ° C com agitação, em meios selectivos LB.
- Extrair e purificar a expressio sRNAN fagemídeo e plasmídeo auxiliar utilizando um estojo de extracção de ADN ou método semelhante 12.
- Cotransformar adquiridos ou preparados 13 de E. coli quimicamente competentes, com 1 ml de cada um dos sRNA fagemídeo expressão e plasmídeo ajudante. Selecionar para cotransformants por plaqueamento em agar LB com antibióticos seletivos para ambas as construções.
- Prepara-se uma cultura de 10 ml de uma única colónia da estirpe de co-transformado em LB com os antibióticos selectivos. Incubar a 37 ° C com agitação durante 8-12 horas ou durante a noite.
- Centrifugar a cultura a 3300 xg durante 10 min. Recolhe-se o sobrenadante e filtra-se através de um filtro de 0,2 um. Cuidado: Em caso de derramamento de mídia, limpar a área com água sanitária diluída (0,5%) para destruir as partículas de fagos infecciosos.
- Manter o filtrado fagemídeo embalados a 4 ° C. Nota: As amostras podem ser mantidas durante dias a semanas sem perda de actividade.
3. Preparação de células F + alvo para Silenciando
- Determinar se as células a serem direcionados para silenciar expressar a pilus F 14. Se o pilus F já está presente, vá para a etapa 4.
Nota: cepas comuns laboratoriais de E. coli são anotados como F + ou M 'para indicar a presença do pilus F no seu genoma ou num plasmídeo. - Obter uma estirpe F + de E. coli, tais como TOP10F '.
Nota: Assegurar que a estirpe alvo transporta um marcador de resistência única, a fim de ser separado do doador de F-plasmídeo após conjugação. - Para introduzir F pilus por conjugação com uma estirpe F +, preparar 5 ml culturas de ambos a tensão alvo e doadores F-plasmídeo 14. Deixar crescer as células durante a noite a 37 ° C com agitação, em meio LB com antibióticos apropriados.
- No dia seguinte, dilui-se ambas as estirpes 1: 100 em 5 ml de LB selectiva e continuar a cultura a 37 ° C com agitação.
- Determinar a fase de crescimento das células medindo a optical densidade da cultura a 600 nm (OD600) usando um espectrofotómetro de bancada. Cultura das células durante cerca de 2 horas até um OD 600 de 0,3 é atingido, o que indica um crescimento de fase log 15.
- Prepare reacções 3 Conjugação em tubos de microcentrífuga de: 0,5 ml de F-plasmídeo estirpe dadora + 0,5 ml de destino, 0,5 ml de F-plasmídeo dador + 0,5 ml de meio LB (controlo negativo) e 0,5 ml de estirpe alvo + 0,5 ml de meio LB (controlo negativo). Permitir que a conjugação prosseguir durante 2 horas a 37 ° C com agitação.
- Placa de 100 ul de cada reacção de conjugação em agar selectivo LB com antibióticos específicos para o F-plasmídico (tipicamente tetraciclina) e estirpe alvo. Placa das reacções de controlo negativo para confirmar que nenhum doador ou estirpe receptora expressar ambas as resistências a antibióticos.
4. A infecção com fagemídeos embalado para Silenciando
- Inocular uma colónia única de células alvo F + em uma cultura de 5 ml de LB Medium com os antibióticos apropriados. Incubar durante a noite a 37 ° C com agitação.
- No dia seguinte, diluir as células alvo M + 1: 100 em 5 ml de meio selectivo LB e continuar a cultura a 37 ° C com agitação.
- Determinar a fase de crescimento das células medindo a densidade óptica da cultura a 600 nm (OD600) usando um espectrofotómetro de bancada. Cultura das células durante cerca de 2 horas até um OD 600 de 0,3 é atingido, o que indica um crescimento de fase log 15. Nota: Expressão do pilus e infecção F eficiência é mais elevada na fase log.
- Adicionar os fagemídeos M13-embalados (do passo 2.6) para as células alvo numa proporção em volume de 1: 100 para alcançar infecção quase 99% da população alvo. Permitir que a infecção prosseguir a 37 ° C com agitação durante 30-60 min.
- Ensaio, o fenótipo sRNA silenciador de acordo com o método de escolha.
Nota: Para uma proteína alvo fluorescente, o efeito de silenciamento pode ser quantificadadirectamente por fluorometria 10. Como alternativa, ensaios fenotípicos pode ser usado para observar as consequências fenotípicas de gene knockdown 8. - Prepare um estoque de glicerol para a sRNA expressando acolhimento fagemídeo seguindo os passos 1.2.14-1.2.16. Nota: o fagemídeo irá propagar na estirpe hospedeira indefinidamente e pode ser mantida com antibiótico semelhante a um plasmídeo convencional.
Representative Results
Silenciamento de mKate2 fluorescência em meio líquido
A Figura 1 representa o esquema para knockdowns sRNA mediadas descritos neste trabalho, incluindo a concepção sRNA cassete, vectorização fagemídeo, e um mecanismo de silenciamento. Seguindo o protocolo 1.2, a cassete de silenciamento sRNA do plasmídeo pAB.001 foi alterada para segmentar mKate. A cassete sRNA foi sintetizado e clonado em fagemídeo Litmus28i_J23115-B0032-GFP, um presente de Monica Ortiz e Drew Endy 11. Este fagemídeo transporta marcadores de expressão GFP e resistência à canamicina, permitindo que infecções de sucesso para ser rastreado. stocks fagem�eos embalados foram preparados seguindo o protocolo 2.
Um derivado de E. coli K12 MG1655 carregando uma constitutivamente expresso, marcador mKate2 cromossomicamente integrado foi preparado para a infecção do fago por conjugação com uma estirpe de plasmídeo dador F seguinte protocolo de 3. As células foram cultivadas até à fase logarítmica média e o fagemídeo introduzida seguindo o protocolo 4. Após a infecção fagemídeo, 200 ul culturas foram transferidas para um leitor de fluorescência de placas e a fluorescência foi monitorizada continuamente durante 24 h.
A Figura 3 mostra o efeito de silenciamento sRNA mediada por expressão em mKate2. A estirpe infectada com um fagemídeo anti-mKate2 não mostrou fluorescência mKate2 detectável sobre o fundo. Em contraste, esta estirpe expressaram o marcador GFP, indicando a absorção bem sucedida de fagemídeo. As células de controlo não infectadas produziu mKate2 fluorescência mas não GFP. Um controlo adicional, em que o domínio de direccionamento anti-mKate2 foi substituído com uma sequência de direccionamento CAT, não teve efeito sobre mKate2 fluorescência.
Silenciamento de resistência ao cloranfenicol em placas de agar
conteúdo "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Seguindo o protocolo 1.1, uma cassete silenciar sRNA foi produzido para atingir CAT Um derivado de E. coli K12 MG1655 carregando uma constitutivamente expresso, cromossomicamente marcador CAT integrada estava preparado. infecção fágica por conjugação com uma estirpe dadora F-plasmídeo seguinte protocolo de 3. as células foram cultivadas até à fase logarítmica média e o fagemídeo introduzida seguindo o protocolo 4. Depois de 1 hora de incubação a 37 ° C, as células infectadas foram diluídas em série e plaqueadas a uma gama de concentrações de cloranfenicol. as placas foram incubadas durante a noite, e a proporção de células resistentes a cloranfenicol cada concentração foi determinada através da contagem de unidades formadoras de colónias (CFUs) no dia seguinte.A Figura 4 mostra o efeito de silenciamento mediado sRNA no fenótipo de resistência a cloranfenicol. As células não infectadas ou células infectadas com o fagemídeo de segmentação mKate2, eram resistentes acloranfenicol em todas as concentrações testadas. Em contraste, as células infectadas com o fagemídeo de segmentação CAT mostraram redução da sobrevivência em baixas concentrações de cloranfenicol, e cerca de 99% de morte em concentrações mais elevadas. A adição de ampicilina, para selecionar apenas as bactérias que levam o fagemídeo, reduziu a sobrevivência cloranfenicol a níveis indetectáveis. Isto é consistente com trabalhos anteriores mostrando que a fuga de infecção fágica é uma via comum para escapar silenciamento 10.
Figura 1: silenciamento de genes em E. coli com sRNA cassetes de expressão entregue por fago M13 A cassete sRNA é composto por 4 módulos:. o promotor Pr (um promotor constitutivo obtido a partir do bacteriófago lambda), um domínio de direccionamento 24 pb, um domínio de ligação HFQ extraído de MICC e um terminador da transcrição de 8 E. coli que expressam o pilus F, onde a expressão começa sRNA. O sRNA recruta então a proteína HFQ (representado em vermelho) e liga-se um alvo mRNA antisense perto do local de ligação ao ribossoma, resultando em repressão translacional e degradação do mRNA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Desenho de primers e Site-Directed Mutagenesis da Site de destino sRNA Dois iniciadores foram concebidos com homologia parcial para uma cassete de sRNA existente. O iniciador directo contém 20 pb homólogo ao promotor do fotorreceptor na extremidade 5 ', seguido pela24 pb representando a nova sequência de orientação, em seguida 18 pb homólogo ao domínio de ligação HFQ na extremidade 3 '. O iniciador reverso é o complemento reverso exacto do iniciador de sentido directo, com as regiões de homologia com a cassete sRNA existente que flanqueia o complemento inverso da sequência de orientação novo. Sequências iniciadoras exactos são dadas na Tabela 3. Reacções separadas de PCR em uma única escorva com a frente e os iniciadores reversos produzir linear, ADN de cadeia simples com a sequência modificada desejada. Recozimento da frente e verso, produtos de reacção, após clean-up, conforme descrito no protocolo, resulta em DNA de cadeia dupla plasmídeo tendo a cassete sRNA modificado desejado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Knockdown de um repórter integrado no cromossoma mKate2 fluorescente. E. coli MG1655 K12 expressar mKate2 foram ou não tratados (linhas vermelhas e bares) de esquerda, infectado com um fagemídeo anti-mKate2 (linhas verdes e bares), ou infectadas com um controle fagemídeo segmentação CAT (linhas azul e bares). (A) não tratada E. coli cresceu para densidades de saturação mais alta, indicando um custo metabólico à infecção fago. As linhas pontilhadas indicam os desvios-padrão de 3 repetições. (B) O sinal mKate2 foi reduzida para níveis próximos dos de fundo no anti-mKate2 tratada tensão, mas não em cepas de controle. Fluorescência (C) GFP, também transportado pelo fagemídeo, foi detectada apenas em controles de fagemídeo-tratada. (D, E) leituras de fluorescência final após 24 h de crescimento foram normalizados para OD. sinal de GFP, indicando infecção fagemídeo, estava ausente em controles não tratados, mas também substancialmente reduzida na sequência anti-CAT ptratamento hagemid. Isso pode indicar efeitos fora do alvo do fagemídeo. O sinal mKate2 foi reduzido por tratamento fagemídeo anti-mKate2 em comparação com controlos não tratados. O fagemídeo controle alvejado-CAT não mostrou nenhum efeito sobre mKate2 fluorescência. As barras de erro representam o desvio padrão de 3 repetições. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Knockdown do CAT restaura a sensibilidade cloranfenicol a uma população geneticamente resistente E.. coli K12 MG1655 que expressa um gene de CAT integrado cromossomicamente foram deixados sem tratamento (barras vermelhas), tratou-se com um fagemídeo controlo segmentação mKate2 (barras verdes), ou tratados com um fagemídeo que expressa um anticorpo anti-CAT sRNA (barras azuis). Depois de 1 hr de infecção, a viabilidade na formiga indicadoibiotics foi avaliada por diluições em série e plaqueamento. Estirpes tratados com anti-CAT fagemídeo foram mortos de forma significativa (> 90%) por cloranfenicol em concentrações mais elevadas, enquanto que os tratamentos de controlo não foram afectadas. A adição de ampicilina para as placas de cultura selecciona positivamente pela infecção fagemídeo e elimina as células não infectadas. Sob estas condições, não há colónias resistentes ao cloranfenicol foram observadas após o tratamento anti-CAT. Isto indica que a maioria dos sobreviventes representar uma falha de infecção, em vez de uma falha de silenciamento. As barras de erro representam o desvio padrão de 3 repetições. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| sequência alvo CAT | 5 '- ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3' |
| sequência GUIA DE CAT | 5 '- ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3' |
Tabela 1:. Um exemplo TARGET e GUIA Sequence para o CAT Gene Nota a relação complemento reverso.
| promotor pR | TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC | ||||
| GUIA sequência | ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT | ||||
| domínio de ligação HFQ | TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG | ||||
| T1 / terminador TE | CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA | ||||
Tabela 2:. componentes de seqüência da cassete sRNA Cada sequência é escrito 5'-3 '. A cassete completa é a concatenação destes 4 elementos em ordem e compreende 292 pb.
| Adiante Primer | 5 '- CTGGCGGTGATAATGGTTGC [GUIDE] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3' |
| Primer reverso | 5 '- GCAATGGCCCAACAGAAA [TARGET] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3' |
Tabela 3: Iniciador desenho nos elementos de guia existentes Alter O iniciador de sentido directo inclui as últimas 20 pb do promotor PR, a nova sequência de orientação, e os primeiros 18 pb do domínio de ligação ao HFQ.. A sequência alvo é o complemento inverso da sequência exacta do GUIA. O iniciador reverso é o complemento reverso exacto do iniciador de sentido directo.
Tabela 4: Sugestão Condições de Single-Primer mutagênicos PCR.
| Passo | Temp | Tempo |
| A desnaturação inicial | 98 ° C | 30 seg |
| 30 ciclos | 98 ° C | 10 seg |
| 55 ° C | 30 seg | |
| 72 ° C | 120 seg | |
| extensão final | 72 ° C | 300 seg |
| Armazenamento | 10 ° C |
Tabela 5: Sugestão de Termociclador Protocolo para a Single-Primer mutagênicos PCR.
| Componente | Volume |
| ADN molde | 1 ul |
| 10 uM para a frente Primer | 0,5 ul |
| 10 uM Iniciador inverso | 0,5 ul |
| Taq Master Mix 2X | 25 ul |
| wate livre de nucleaser | 23 ul |
| O volume total | 50 ul |
Tabela 6: Sugestão de condições para a sequência de Verificação PCR.
| Passo | Temp | Tempo |
| A desnaturação inicial | 95 ° C | 30 seg |
| 30 ciclos | 95 ° C | 30 seg |
| 55 ° C | 30 seg | |
| 68 ° C | 30 seg | |
| extensão final | 68 ° C | 300 seg |
| Armazenamento | 10 ° C |
Tabela 7: Sugestão de Termociclador Proprotocolo para a Sequência de Verificação PCR.
Discussion
O presente método conseguido redução de 80% nos níveis de fluorescência mKate comparação com controles não direcionados. Isto está de acordo com outros métodos de knockdown de ARN, onde silencioso completo não é observada e eficiência 50-90% é típico 16,17. Ao nível fenotípica, knockdowns alvo-CAT foram capazes de atenuar significativamente a resistência ao cloranfenicol, e eliminá-lo sob algumas condições.
O fenótipo knockdown foi detectável ao nível da população depois de apenas algumas horas após a infecção (Figura 3B). Isto ilustra uma característica importante de entrega à base de fagos: uma frequência alta knockdown pode ser obtida directamente na cultura em lotes, sem modificação genética antes. Ao contrário as modificações genéticas convencionais utilizando transformação ou plasmídeo de integração genómico, infecção fágica não exige que uma população ser re-cultivadas a partir de uma única colónia isolada. Isto permite que os efeitos da infecção por fagos para ser Explored em populações com dinâmicas espaciais complexos 11, com estruturas espaciais pré-existentes, como biofilmes 18, ou em populações naturais geneticamente mistos 19.
Um passo crítico neste método é a produção de fagemídeo embalados em título elevado. A carga metabólica associada com a produção de partículas de fago pode conduzir a altas taxas de mutação ou perda do plasmídeo na estirpe de produção fagemídeo. Recomenda-se que a estirpe de produção fagemídeo ser cultivado directamente a partir de uma única colónia co-transformadas e não refrigerados, congelados ou sub-cultivadas antes da colheita de fagos. A baixa eficiência de co-transformação também pode ser observada quando se introduz o plasmídeo fagemídeo e ajudante para E. coli simultaneamente. Neste caso, as eficiências mais elevadas podem ser obtidos por transformação do plasmídeo auxiliar em primeiro lugar, em seguida, a preparação de células competentes que ostentam o plasmídeo ajudante para a subsequente transformação com o fagemídeo.
Phainfecção gemid ou expressão sRNA também impõe uma carga metabólica detectável nas células alvo, e pode resultar em alguma perturbação fenotípica. Por exemplo, foi observada uma redução na fluorescência mKate2 mesmo quando as células foram infectadas com um fagemídeo segmentação CAT (Figura 3). A infecção com o M13 não é pensado para desencadear respostas de estresse sistêmico em E. coli 20, mas pode alterar os padrões de transcrição indiretamente. Alternativamente, os marcadores de resistência à ampicilina ou GFP incluídos no fagemídeo pode concorrer para recursos celulares, reduzindo a expressão e crescimento mKate2 9. Finalmente, a cassete de sRNA si pode alterar globalmente perfis de expressão de gene por titulação da proteína HFQ, ou por meio de silenciamento de ARNm para fora do alvo. Efeitos alvo Off são comuns em in vivo RNAi visando 21-23, mas eles ainda têm de ser sistematicamente investigada para este sistema.
Uma limitação deste método é que a efi infecçãoeficiência é inferior a 100%, permitindo que algumas bactérias não infectadas para persistir na população. Os resultados deste trabalho e trabalho anterior 10 sugerem que as células não infectadas representam 1-10% da população final, e são responsáveis pela maioria dos fenótipos nonsilenced observados. Uma variedade de rotas para a M13-resistência são conhecidos, com a perda mutacional sendo mais comum da expressão de pelos 24. À luz destas limitações, os controles devem ser utilizadas para confirmar a altas taxas de infecção e eficiência knockdown.
Outra limitação potencial para algumas aplicações é a transferência ocasional de contaminação do fago auxiliar. Embora M13K07 contém um sinal de empacotamento mutado, pode ser empacotado em cápside do fago em baixa frequência e transferido para populações infectadas, o que resulta em células competentes para a produção de fagos e a propagação continuada de fago além do evento infecção inicial 25. Modificações para o fago auxiliar têm se mostrado eficazesa redução de embalagens não específica, embora às vezes com o custo de produção de fagos reduzida 26.
Bacteriófago engenharia tornaram-se uma ferramenta indispensável para E. biologia sintética coli, permitindo a entrega rápida de novos genes de uma população crescente. Um trabalho recente produziu circuitos de comunicação intercelular 11 ou expressa fatores de transcrição para reprimir a resistência aos antibióticos vias 27. O protocolo aqui apresentado acrescenta a uma crescente coleção de ferramentas que permitem o controle da fisiologia bacteriana através de RNAs programados. Nucleases CRISPR-cas, quando sofre mutação para eliminar a actividade nuclease, foram mostrados para reprimir a transcrição de genes alvos guiados por RNA 17,28. Em contraste, sRNA silenciamento funciona ao nível da tradução e não requer a expressão de proteína exógena. biotecnologias da próxima geração podem se unir controle da transcrição e tradução, com entrega mediada por fago para programar pheno complexotipos em tempo real.
Acknowledgments
O financiamento para este trabalho foi fornecida pela Fondation Bettencourt Schueller em apoio da equipe de Paris Bettencourt iGEM. Agradecemos a unidade INSERM pesquisa U1001 e Chantal Lotton para a assistência técnica e aconselhamento. Fagemídeo Litmus28i_J23115-B0032-GFP foi fornecida por Monica Ortiz e Drew Endy de Stanford.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| DpnI Enzyme | NEB | R0176S | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq 2x Master Mix | NEB | M0270L | |
| M13KO7 Helper Phage | NEB | N0315S | |
| DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| TOP10F' Cells | Life Technologies | C3030-03 | |
| LB Broth | Sigma | L3022-250G | |
| Ampicillin | Sigma | A9393-5G | |
| Kanamycin | Sigma | 60615-5G | |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G |
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