Summary
Este protocolo descreve um método de preparação simples para nanopartículas de ouro integrado lipossomas foto-sensível com os materiais disponíveis no mercado. Também mostra como medir o processo de cavitação microbolhas dos lipossomas sintetizados mediante o tratamento de laser pulsado.
Introduction
A possibilidade de desencadear a liberação de drogas usando estímulos externos é uma forma atraente para entregar a droga em modas espaço-, temporal- e controlado-dosagem com especificidade maximizada e os efeitos adversos mínimos. Entre uma vasta gama de sistemas exógenos estímulos responsivos (luz, campo magnético, ultra-som, radiação de microondas), plataformas de luz disparado são atraentes, devido à sua não-invasivo, simplicidade e adaptabilidade nas clínicas. 1 Extensas pesquisas na última década tem proporcionado uma variedade de tecnologias de plataforma, como o ouro responsável near-infrared-luz (AU) nanocages revestido com polímeros inteligentes, 2, nanopartículas poliméricas foto-lábil (PN) conjugados com drogas, 3 e nanovesículas porphysome auto-organizadas. 4 Entretanto , estas tecnologias estão ainda nas fases pré-clínicas de desenvolvimento, e requerem uma compreensão clara e optimização dos parâmetros relativos ao processo de iniciação e controlando a libertação do fármaco.
Um dos métodos mais simples e facilmente acessíveis para a preparação de um tal sistema é integrar Au NPs com lipossomas termicamente sensíveis 5,6, ambas as quais estão amplamente disponíveis no mercado e têm sido amplamente investigados em ensaios pré-clínicos e clínicos mesmo. Apesar da limitação da activação de tecidos profundos de Au NPs no seu comprimento de onda plasmónico, quando comparado com nanoestruturas Au-do infravermelho próximo activado (por exemplo, nanocages), este sistema ainda é muito promissora quando usada em pequenos animais ou para entrega tópica em seres humanos. 7 Há alguns esforços iniciais em combinar Au NPs com lipossomas para a liberação de luz disparado. 8-11 Enquanto a maioria deles concentrar-se na novidade de materiais, questões de acessibilidade e escalabilidade precisam ser abordadas. Além disso, os relatórios sobre mecanismos de liberação usando estes nanocarriers ainda são limitados.
Aqui, a fabricação de foto-sensívellipossomas, simultaneamente carregadas com drogas hidrófilas e Au NPs foi descrito. A calceina é utilizado como um composto modelo para avaliar a eficiência da encapsulação e o perfil de libertação do sistema. Além disso, neste sistema, a luz absorvida por Au NPs dissipa para o microambiente envolvente sob a forma de calor, o que resulta em um aumento na temperatura local. Microbolhas de ar são gerados durante o aquecimento a laser e causar ruptura mecânica de lipossomas (Figura 1). O mecanismo da cavitação microbolhas é confirmado por medições de hidrofones.
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Protocol
1. Preparação
- Limpos redondo de 100 ml, utilizando balões de fundo água régia (1 parte de ácido nítrico concentrado (HNO3) e 3 partes de ácido clorídrico concentrado (HCl)) e lava-se os frascos com água DI. Autoclave os frascos e secá-los num forno de ar quente a 100 ° C durante 15 min. Enrole e armazenar os frascos estéreis até à sua utilização.
- Esterilizar o conjunto de mini-extrusora de mão usando 70% de etanol.
- Ligue o evaporador rotativo e ajustar a temperatura do banho de água quente e a torre de arrefecimento a 37 ° C e 4 ° C, respectivamente.
- Preparar 60 mM de solução mãe de calceína através da dissolução de 374 mg de calceína em 10 ml de 0,1 mM de tampão fosfato salino (PBS) (pH 7,4). Ajustar o pH para 7,4 utilizando hidróxido de sódio M solução de 1 (NaOH).
2. Síntese de Lipossomas
- Remover os lípidos (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1-palmitoil-2-hidroxi- sn-glicero-3-phosphochoA linha (CPMP) e 1, 2-sn-glicero-distearoyl--3-phosphoethanol aminas N - [carboxi (polietileno glicol) -2000] (sal de amónio) (DSPE-PEG2000)) a partir do congelador (-20 ° C) e descongelar-los até à TA.
- Pesar 15,9 mg de DPPC, 1,3 mg MPPC, e 2,8 mg DSPE-PEG2000. Dissolve-los em conjunto em 2 mL de clorofórmio.
- Transferir a solução de clorofórmio para o balão de fundo redondo esterilizadas e evapora-se o solvente, utilizando o evaporador rotativo, sob pressão reduzida, de modo a formar uma camada fina de lípidos, seca.
- Hidratar a camada de lípidos a 45 ° C com solução aquosa de 2 ml durante 30 minutos 1,95 ml contendo 60 mM de calceína preparado no passo 1.4 e 50 ul Au NPs (3,36 x 10 16 partículas / ml).
- Pré-aquecer o bloco de aquecimento a 45 ° C. Colocar um filtro de membrana de policarbonato de 200 nm entre os suportes de filtro e montar o conjunto de mini-extrusora. Verifique a potenciais fugas com água DI.
- Encha uma das seringas com 1 ml de solução de lipossomas a partir do passo 2.4 e EXTRUde a amostra fazendo passar a solução para a seringa na outra extremidade da montagem de mini-extrusor. Repetir 11 vezes.
- Executar os lipossomas sintetizados através de uma coluna de dessalinização PD-10 para remover os livres Au NPs, lípidos e calceína utilizando PBS como eluente, de acordo com o protocolo do fabricante.
- Armazenar as amostras em tubos estéreis a 4 ° C e usar em 2 dias.
3. Calce�a lançamento de lipossomas com Aquecimento
- Calcular a molaridade lipídica da solução somando os molaridades de DPPC, MPPC e DSPE-PEG2000 na etapa 2.2. Dilui-se a solução de estoque de concentração de lípido de lipossoma 5 mM utilizando 0,1 mM de tampão PBS (pH 7,4). Transferir as amostras para um tubo de centrifugação (2 ml).
- Colocar o tubo num banho de água quente, e aumentar a temperatura, gradualmente, de 25 a 70 ° C. Aumentar a temperatura a uma taxa de 1 ° C / min aqui.
- Recolha alíquotas (10 ml) em diferentes pontos de temperatura (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 e 70 ° C).
- Adicionar 10 ul de 2% de Triton X-100 a 2 ml da solução lipossomal aliquota para digerir os lipossomas durante 10 min à RT e para conseguir a libertação completa de calceína.
- Transferir 200 ul da solução lipossomal a cada poço em microplacas de 96 poços e medir a intensidade de fluorescência das amostras recolhidas utilizando um leitor de microplacas de fluorescência. Os comprimentos de onda de excitação e emissão de calceína são 480 e 515 nm, respectivamente.
- Tomando a intensidade de fluorescência das amostras de Triton X-100 tratadas como 100% de libertação, calcular a percentagem de calceína libertada em cada ponto do tempo, utilizando a fórmula:
Ft é a intensidade de fluorescência da solução a um dado ponto de tempo. F F I e X são as intensidades de fluorescência normalizados iniciais e finais da solução respectivamente.
4. Calce�a Relocação de lipossomas com laser pulsado
- Transferir a solução de lipossoma 100 ul para uma cuvete de quartzo e introduzi-los num suporte de cuvete. Usar um laser de Nd pulsadas: YAG com uma duração de pulso de 6 ns a 532 nm de comprimento de onda como a fonte de luz. Utilize os seguintes parâmetros laser - Taxa de repetição: 1 Hz; Densidade de energia do laser: 1 mJ / cm 2; Diâmetro do feixe: 0,5 mm.
- Orientar o feixe laser colimado através da cuvete de tal modo que a luz passa através da solução de lipossomas e recolher alíquotas após vários impulsos.
- Adicionar 10 ul de 2% de Triton X-100 a 2 ml da solução lipossomal aliquota para digerir os lipossomas durante 10 min à RT e para conseguir a libertação completa de calceína.
- Considerando calceína é sensível à luz e pode ser branqueada durante o experimento de laser, pré-medir o efeito de branqueamento de laser pulsado em solução calceína para normalizar os dados de libertação de lipossomas.
- Especificamente, expor solução de calceína (60 mM) para wi laser pulsadoth frequência de 1 Hz por um número variável de pulso (0, 25, 50 e 100). Medir a intensidade de fluorescência da calceina com excitação e emissão de comprimentos de onda de 480 e 515 nm, respectivamente, antes e depois da exposição à radiação laser.
- Calcular a quantidade de branqueamento (intensidade de fluorescência da calceina antes intensidade do laser exposição / fluorescência da calceina depois o número de impulsos específica). Use este factor para normalizar os valores obtidos a partir de amostras de lipossomas, multiplicando a intensidade de fluorescência dos lipossomas com o factor.
- Medir a intensidade de fluorescência da amostra recolhida utilizando um leitor de microplacas de fluorescência a comprimentos de onda de excitação e emissão de 480 e 515 nm, respectivamente.
- Tomando a intensidade de fluorescência das amostras de Triton X-100 tratadas como 100% de libertação, calcular a percentagem de calceína libertada a cada número de pulsos, usando a fórmula:
I e X são as intensidades de fluorescência normalizados iniciais e finais da solução respectivamente.
5. Medição dos impulsos de pressão
- Colocar 100 ml da amostra numa lâmina de microscópio e definir o foco do laser sobre a amostra.
- Imergir um hidrofone agulha (1 mm de diâmetro e 450 a sensibilidade NV / Pa) para dentro da solução.
Cuidado: A hidrofone não deve ser iluminada pela luz do laser para evitar o dano. - Irradiar a amostra com o laser pulsado com números variados de pulso (0-100) e energia de pulso (20-160 μJ / pulso).
- Registam-se os sinais de pressão utilizando um osciloscópio digital.
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Representative Results
Os lipossomas foram preparados usando uma técnica de hidratação de película fina convencionais com DPPC, CPMP e DSPE-PEG2000 numa razão molar de 86: 10: 4 ou 7,95: 0,65:. 1,39 mg / ml 12 O tamanho de Au NPs é crítico para determinar a luz para aquecer a eficiência de conversão durante a experiência seguinte de excitação de laser. Quanto menor o tamanho de Au PN, maior é a eficiência de transdução. Assim 13 5 nm Au NPs, as amostras mais pequenas do fornecedor, foram escolhidos para encapsulamento. Durante a síntese, forma hidratante contendo Au NPs e calceína foi adicionado para gerar vesículas multi-lamelares, que foram depois sujeitos a extrusão de tamanho e cromatografia de filtração em gel para remover a au PN e calceína livre.
A calceina é um corante fluorescente hidrófilo está encapsulado dentro do núcleo aquoso dos lipossomas a uma concentração de 60 mM. Em tais concentrações elevadas, a fluorescência das calcein auto-extingue. No entanto, a calceina é diluída, uma vez que é libertada dos liposomas, levando a fluorescência re-ganho, indicando libertação de fármaco desencadeada. 14 Baseando-se no estabelecimento de lipossomas de calceina foram diluídos para 5 mM e a resposta do sistema lipossomal para a alteração da temperatura foi observado. Tal como indicado na Figura 2A, independentemente da presença de NPs de Au, os lipossomas eram quase intacta à temperatura fisiológica (isto é, 37 ° C) com uma percentagem de passagem inferior a 10%. No entanto, quando a temperatura foi elevada para 42 ° C (ligeiramente acima da temperatura de transição dos lípidos), 60% -80% de calceína encapsulada é libertada a partir de lipossomas dentro de 2 min. Não houve diferença significativa no percentual de liberação é observado dentro dos lipossomas com e sem Au NPs, quando a liberação é acionada usando calor. Isto é devido a que a temperatura de transição de fase do sistema. Além disso, a libertação rápida e eficiente é devido ao PreseNCE de 10% CPMP, o que aumenta a permeabilidade da bicamada do lipossoma à temperatura de transição.
Em seguida, foi examinada a libertação de calceina dos lipossomas após irradiação do laser. A solução de lipossomas foi feita numa cuvete de quartzo que foi colocado num suporte de cuvete. 532 nm laser Nd: YAG de pulso com uma duração de pulso de 6 ns e uma densidade de potência instantânea de 166,67 kW / cm 2 foi focada para a solução lipossomal. Alíquotas de amostras foram coletadas em números variados de pulso (0, 25, 50 e 100) em que a frequência de pulso foi fixada em 1 Hz. As amostras foram imediatamente transferidas para um tubo de microcentrífuga e colocado num banho de gelo. Isso é para evitar qualquer libertação de calceína. O laser foi desligado durante a coleta das amostras. Tal como mostrado na Figura 2B, os lipossomas com Au NPs libertado a calceína encapsulada em consequência da excitação, em que a quantidade de calceína libertada aumentou à medida que o núm pulsomem- aumentada.
O último passo foi estudar o mecanismo de libertação de calceina dos lipossomas com hidrofone. A Figura 3A é o sinal acústico gravado por R PN (vermelho), lipossomas com Au NPs (preto) e lipossomas sem Au NPs (azul). Enquanto Au NPs e lipossomas com Au NPs mostrou sinais de onda de pressão característicos, nenhum sinal foi observada a partir de lipossomas sem Au NPs. O impulso da pressão contém fases positivas e negativas (inserção na Figura 3A). Ele sugere que formam microbolhas (fase positiva) e perturbar (fase negativa) na solução. A os valores mínimos do pico registrado em lipossomas Au NP contendo máximo e foram 0,00093 e -,00074 V, respectivamente. Finalmente, os valores máximos e mínimos média dos impulsos de pressão como uma função do aumento da energia do laser foram calculados. Como esperado, o sinal de amplitude acústica aumentada gradualmente com o aumento do laserenergia (Figura 3B). Isto deve ser devido ao aumento da intensidade da oscilação das partículas atribuindo à expansão termo-contração elástica e subsequente 15,16.
Figura 1. O mecanismo de libertação de fármaco proposto de lipossomas foto-sensível: AU PN (pontos vermelhos) quando está a ser irradiado, gerar microbolhas que rompem a membrana do lipossoma e, assim, desencadeiam a libertação de calceina calceína, auto-quenching dentro de lipossomas (como mostrado), fluoresce. como sendo liberada para o ambiente. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. <forte> Calor e laser pulsado desencadeada libertação de calceína dos lipossomas (A) Percentagem de calceína libertada a partir de lipossomas, com ou sem Au PN, os quais foram colocados em banho de água com várias temperaturas durante 2 min.; (B) Percentagem de calceina libertada a partir de lipossomas com Au NPs, que foram tratados com laser pulsado (duração do pulso = 6 ns; densidade de potência ~ 12 mW / cm 2). As barras de erro representam a média ± desvio padrão (DP) de três experiências independentes realizadas em triplicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. sinais acústicos (A) medido usando um sistema de hidrofones para Au NPs (vermelho), lipossomas com Au NPs (preto) e lipossomas sem umu PN (azul). Enquanto Au NPs e lipossomas com Au NPs mostrou sinais de onda de pressão característicos, nenhum sinal foi observada a partir de lipossomas sem Au NPs. A inserção mostra uma vista ampliada de sinais acústicos de lipossomas foto-sensível. (B) máximo e mínimo valor de pico dos impulsos de pressão como uma função do aumento da potência do laser. O sinal de amplitude acústica aumenta gradualmente com o aumento da energia do laser. As barras de erro representam a média ± DP de três experiências independentes realizadas em dez corridas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
hidratação do filme fino é o método convencional para a preparação de lipossomas. Os solventes orgânicos (clorofórmio neste caso) foram primeiro utilizados para dissolver os lipidos e, em seguida, removido num evaporador rotativo a 37 ° C, para gerar uma película fina de lípidos no frasco. Este filme de lípido foi hidratada com a solução aquosa contendo 60 mM de calceína e 5 nm Au NPs. Durante o processo de hidratação, a temperatura foi mantida a cerca de 50 ° C e o frasco foi constantemente agitada por rotação do balão. A chave para este passo é a escolha de temperaturas em que a evaporação e hidratação foram efectuados respectivamente. A temperatura de transição de fase (Tm) de DPPC, o principal constituinte do lipossoma, é de 41 ° C. Durante a formação do lípido acha filme, a temperatura deve ser inferior a 41 ° C para evitar a formação de aglomerados de agregados de lipidos secos. Durante a hidratação, a uma temperatura superior a T m foi escolhido para conduzir os fosfolípidos deauto-montar em estruturas esféricas multilamelares. Embora o método de hidratação de película fina é de fácil execução, que está limitada pela baixa eficiência de encapsulação (<1%) da calceína e Au NPs na solução aquosa. No futuro, a encapsulação pode ser melhorada por meio de ciclos de congelação-descongelação.
Subsequente tamanho por extrusão foi feito usando uma de mão mini-extrusora, colocado em um bloco de aquecimento. Um máximo de 1 ml de solução pode ser extrudida utilizando esta configuração, o que é ideal para uma preparação em pequena escala no laboratório. A chave nesta etapa ainda é a temperatura, que deve ser superior à temperatura de transição de fase dos lipossomas. Ao entregar a extrusão a 50 ° C, o tamanho dos lipossomas tornou-se uniforme após 10 ciclos de extrusão através da membrana com poros de 200 nm. O movimento, neste passo deve ser lento e suave medida que a pressão no interior da extrusora é grande, enquanto a membrana é frágil.
Um, mas ste importante muitas vezes esquecidop durante a síntese de lipossomas contendo drogas é a purificação ou a remoção dos fármacos encapsulados-un (isto é, calceina e Au NPs aqui). Isto foi feito por cromatograf ia de filtração em gel. É fundamental que o pesquisador se notar que a coluna PD-10 utilizada neste estudo só é adequado para o processamento <2 ml de solução. As amostras com volume maior pode ser processado, utilizando várias colunas.
O estudo da libertação de calceína do lipossoma baseia-se na auto-extinção de calceína em concentrações mais elevadas e re-fluorescência como diluída. Quando as amostras foram expostas ao calor ou luz para o tratamento térmico ou a laser respectivamente, alíquotas de amostras foram constantemente retirada em diferentes pontos de temperatura ou número de impulsos e transferidos para frascos separados. Os frascos devem ser imediatamente colocada num banho de gelo para evitar a continuação da potencial libertação de calceína, para medições precisas. Outra coisa a notar é que a calceina é sensível à luze, portanto, podia ser branqueada durante o experimento de laser. Para ultrapassar isto, o efeito de branqueamento de um laser pulsado na solução calceína devem ser medidos e os dados de libertação de lipossomas normalizados em conformidade.
O protocolo aqui descreve um método de preparação fácil para os lipossomas sensíveis à luz. libertação térmica é demonstrado pela primeira vez através da exploração da temperatura responsiva dos fosfolípidos. O laser configurado é ilustrado e luz desencadeada liberação é alcançada por laser pulsado. O mecanismo de libertação desencadeada a luz também é explorada e verificou-se ser devido a ruptura por cavitação membrana da microbolha.
Diferente de todos os protocolos relatados, este protocolo escolhe materiais (ou seja, lipídios e Au NPs) que têm sido frequentemente utilizados em ensaios clínicos e amplamente disponíveis no mercado. O uso de materiais de fácil acesso permite que qualquer pessoa para preparar sistema tão sensível à luz por si só, sem a need para procurar ajuda técnica. Além disso, este protocolo faz uso de hidratação de película fina para preparar liposomas, que é simultaneamente eficaz e facilmente expansível.
Este protocolo simples, mas poderosa irá beneficiar pesquisadores e clínicos que estão interessados na obtenção de libertação controlada de fármacos aos tecidos superficiais, como a pele. Uma aplicação potencial seria para entregar agentes anti-queimadura, incorporando esse sistema dentro de protetor solar.
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Disclosures
Não há conflito de interesse são declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente financiado pelos Fundos de Pesquisa Acadêmica Tier-1 por Singapura Ministério da Educação (RG 64/12 para CX) e Instituto NTU-Northwestern da nanomedicina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 850355P | Powder, Store at -20 °C |
| 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 855675P | Powder, Store at -20 °C |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 880120P | Powder, Store at -20 °C |
| Gold Nanoparticles | Sigma Aldrich | 752568-100mL | 5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875-10g | 60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH) |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | 0.1 mM, pH 7.4 |
| Double distilled water | Millipore Milli-DI water purification system | ||
| Triton X100 | Sigma, Life Sciences | X-100 | To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation |
| Rotavapor | Buchi (Switzerland) | R 210 | Used for Lipososme preparation |
| Heating bath | Buchi (Switzerland) | B 491 | Used for Lipososme preparation |
| Vacuum Controller | Buchi (Switzerland) | V-850 | Used for Lipososme preparation |
| Vacuum Pump | Buchi (Switzerland) | V-700 | Used for Lipososme preparation |
| Recirculation bath with temperature controller | Polyscience | Used for Lipososme preparation | |
| Mini-extruder assembly with heating block | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610000 | Used for extrusion of liposomes |
| Syringes, 1,000 μl | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610017 | Used for extrusion of liposomes |
| Polycarbonate filter membrane, 200 nm | Whatmann | 800281 | Used for extrusion of liposomes |
| Filter Support | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610014 | Used for extrusion of liposomes |
| PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium | GE Healthcare, Life sciences | 17-0851-01 | Used to purify the liposomes |
| Centrifuge | Sigma Laboratory Centrifuges | 3K30 | Used to concentrate the liposomal solution |
| Rotor | Sigma | 19777-H | Used to concentrate the liposomal solution |
| Zetasizer | Nano ZS Malvern | Used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| UV-Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-2450 | Used to measure the absorbance of the samples |
| Fluorescent Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Used to measure the fluorescence emission of the samples |
| Nd:YAG Laser | NewWave Research | 532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation | |
| HNR Hydrophone | ONDA | HNR-1000 | 1 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals |
| Digital Osciloscope | LECORY - Wave Runner 64Xi-A | Frequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals |
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