Summary
Este protocolo describe un método de preparación sencilla para nanopartículas de oro liposomas fotosensible integrado con los materiales disponibles en el mercado. También muestra cómo medir el proceso de cavitación de las microburbujas de los liposomas sintetizados en el tratamiento de láser pulsado.
Introduction
La posibilidad de desencadenar la liberación del fármaco mediante estímulos externos es una forma atractiva para entregar los medicamentos en las modas espacialidad, temporalidad y dosificación controlada con especificidad maximizada y efectos adversos mínimos. Entre una amplia gama de sistemas exógenos estímulos que responden (la luz, el campo magnético, ultrasonido, radiación de microondas), plataformas de luz provocada son atractivos, debido a su carácter no invasivo, la sencillez y la adaptabilidad en las clínicas. 1 Una amplia investigación en la última década ha proporcionado una variedad de tecnologías de plataforma, como el oro responsables del infrarrojo cercano luz (Au) nano-cajas recubiertas con polímeros inteligentes, 2, nanopartículas poliméricas foto-lábil (NPS) conjugados con fármacos, 3 y nanovesículas porphysome autoensambladas. 4 Sin embargo , estas tecnologías están aún en las etapas preclínicas de desarrollo, y requieren una comprensión clara y optimización de los parámetros que intervienen en el proceso de iniciar y controdar la liberación del fármaco.
Uno de los métodos más simples y de fácil acceso para la preparación de un sistema de este tipo es la integración de Au NPs con liposomas térmicamente sensibles 5,6, ambos de los cuales están ampliamente disponibles en el mercado y han sido ampliamente investigados en ensayos preclínicos y clínicos aún. A pesar de la limitación de la activación de tejido profundo de Au NPs en su longitud de onda plasmónica, en comparación con Au nanoestructuras del infrarrojo cercano activado (por ejemplo, nano-cajas), este sistema todavía una gran promesa cuando se utiliza en animales pequeños o para la administración tópica en los seres humanos. 7 Hay algunos esfuerzos tempranos en la combinación de Au PN con liposomas para la liberación luz disparado. 8-11 Si bien la mayoría de ellos se centran en la novedad de los materiales, los problemas de accesibilidad y escalabilidad deben ser abordados. Por otra parte, los informes sobre los mecanismos de liberación que utilizan estos nanoportadores son todavía limitados.
En este documento, la fabricación de foto-sensibleliposomas, cargados simultáneamente con las drogas y el hidrófilos Au NPs se ha descrito. Calceína se utiliza como un compuesto modelo para evaluar la eficacia de encapsulación y el perfil de liberación del sistema. Además, en este sistema, la luz absorbida por Au NPs disipa al microambiente que rodea en forma de calor, lo que resulta en un aumento de la temperatura local. Microburbujas de aire se generan durante el calentamiento por láser y causan la rotura mecánica de liposomas (Figura 1). El mecanismo de la cavitación de las microburbujas se confirmó por mediciones de hidrófonos.
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Protocol
1. Preparación
- Limpias redondo de 100 ml matraces de fondo utilizando agua regia (1 parte de ácido nítrico concentrado (HNO 3) y 3 partes de ácido clorhídrico concentrado (HCl)) y lavar los frascos con agua DI. Autoclave los frascos y se secan en un horno de aire caliente a 100 ° C durante 15 minutos. Envolver y almacenar los frascos estériles hasta su uso.
- Esterilizar el conjunto de mini-extrusora de mano utilizando etanol al 70%.
- Encienda el evaporador rotatorio y ajustar la temperatura del baño de agua caliente y la torre de refrigeración a 37 ° C y 4 ° C, respectivamente.
- Preparar 60 mM de calceína solución madre disolviendo 374 mg de calceína en 10 ml de 0,1 mM solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4). Ajustar el pH a 7,4 utilizando solución 1 M de hidróxido sódico (NaOH).
2. Síntesis de liposomas
- Retire los lípidos (1,2-sn Dipalmitoyl- glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3 phosphocholínea (MPPC) y 1, 2-distearoyl- sn -glicero-3-phosphoethanol-amina N - [carboxi (polietilenglicol) -2.000] (sal de amonio) (DSPE-PEG2000)) del congelador (-20 ° C) y descongelar a temperatura ambiente.
- Pesar 15,9 mg de DPPC, 1,3 mg MPPC, y 2,8 mg de DSPE-PEG2000. Disolverlos juntos en 2 ml de cloroformo.
- Transferir la solución de cloroformo al matraz de fondo redondo estériles y se evapora el disolvente usando un evaporador rotatorio a presión reducida, para formar una capa fina de lípido seco.
- Hidratar la capa de lípidos a 45 ° C con una solución acuosa 2 ml de 30 min que contiene 1,95 ml 60 mM de calceína preparado en la etapa 1.4 y 50 l de Au NPs (3,36 × 10 16 partículas / ml).
- Pre-calentar el bloque de calentamiento a 45 ° C. Colocar un filtro de membrana de policarbonato de 200 nm entre los soportes de filtro y montar el conjunto de mini-extrusora. Compruebe la posibilidad de fugas de agua DI.
- Llenar una de las jeringas con 1 ml de solución de liposomas de la etapa 2.4 y Extrude la muestra por paso de la solución a la jeringa en el otro extremo de la montar mini-extrusora. Repetir 11 veces.
- Ejecutar los liposomas sintetizados a través de una columna de desalación PD-10 para eliminar las gratuito Au NPs, lípidos y calceína utilizando PBS como eluyente según el protocolo del fabricante.
- Almacenar las muestras en tubos estériles a 4 ° C y el uso en 2 días.
3. calceína lanzamiento de liposomas con calefacción
- Calcular la moralidad de los lípidos de la solución madre mediante la suma de los molaridad de DPPC, MPPC, y DSPE-PEG2000 en el paso 2.2. Se diluye la solución de liposomas de valores para la concentración de lípidos 5 mM utilizando tampón PBS 0,1 mM (pH 7,4). Transferir las muestras a un tubo de centrífuga (2 ml).
- Se coloca el tubo en un baño de agua caliente, y aumentar gradualmente la temperatura de 25 a 70 ° C. Aumentar la temperatura a una velocidad de 1 ° C / min aquí.
- Recoger alícuotas (10 l) a diferentes puntos de temperatura (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 y 70 ° C).
- Añadir 10 l de 2% de Triton X-100 alícuota de 2 ml de la solución liposomal de digerir los liposomas durante 10 min a RT y para conseguir la liberación completa de calceína.
- Transferir 200 l de la solución liposomal a cada pocillo en la microplaca de 96 pocillos y se mide la intensidad de fluorescencia de las muestras recogidas utilizando un lector de microplacas de fluorescencia. Las longitudes de onda de excitación y emisión de calceína son 480 y 515 nm, respectivamente.
- Tomando la intensidad de fluorescencia de las muestras tratadas Triton X-100 como 100% de liberación, calcular el porcentaje de la calceína liberada en cada punto de tiempo, utilizando la fórmula:
Ft es la intensidad de fluorescencia de la solución en un punto de tiempo dado. F I y F x son las intensidades de fluorescencia inicial y final normalizadas de la solución, respectivamente.
4. Re calceínaarrendamiento de liposomas con láser pulsado
- Transferir la solución de liposoma 100 l a una cubeta de cuarzo y colocarlo en un soporte de cubetas. Utilice un láser pulsado de Nd: YAG con una duración de pulso de 6 ns a 532 nm de longitud de onda como fuente de luz. Utilice los siguientes parámetros láser - Frecuencia de repetición: 1 Hz; Densidad de energía del láser: 1 mJ / cm 2; diámetro del haz: 0,5 mm.
- Guía del rayo láser colimado a través de la cubeta de tal manera que la luz pasa a través de la solución de liposomas y recoger alícuotas después de varios impulsos.
- Añadir 10 l de 2% de Triton X-100 alícuota de 2 ml de la solución liposomal de digerir los liposomas durante 10 min a RT y para conseguir la liberación completa de calceína.
- Teniendo en cuenta calceína es sensible a la luz y puede ser blanqueada durante el experimento láser, pre-medir el efecto de blanqueo de láser de impulsos en solución de calceína para normalizar los datos de liberación de liposomas.
- En concreto, exponer solución de calceína (60 mM) para wi láser pulsadoTH frecuencia de 1 Hz para un número variable de impulsos (0, 25, 50 y 100). Medir la intensidad de fluorescencia de calceína con excitación y emisión de longitudes de onda 480 y 515 nm, respectivamente, antes y después de la exposición de láser.
- Calcular la cantidad de blanqueo (intensidad de la fluorescencia de calceína antes de la intensidad del láser de exposición / fluorescencia de calceína después de que el número de impulsos específico). Usar este factor para normalizar los valores obtenidos de muestras de liposomas multiplicando la intensidad de fluorescencia de los liposomas con el factor.
- Medir la intensidad de fluorescencia de la muestra recogida usando un lector de microplacas de fluorescencia a longitudes de onda de excitación y emisión a 480 y 515 nm, respectivamente.
- Tomando la intensidad de fluorescencia de las muestras tratadas Triton X-100 como 100% de liberación, calcular el porcentaje de la calceína liberada en cada número de impulsos, mediante la fórmula:
I y F x son las intensidades de fluorescencia inicial y final normalizadas de la solución, respectivamente.
5. Medición de los impulsos de presión
- Coloque 100 l de la muestra en un portaobjetos microscópico y ajustar el enfoque del láser sobre la muestra.
- Sumergir un hidrófono aguja (diámetro de 1 mm y 450 sensibilidad nV / Pa) en la solución.
Precaución: El hidrófono no debe estar iluminada por la luz láser para evitar el daño. - Irradiar la muestra con el láser de impulsos con un número variable de impulsos (0-100) y la energía de impulsos (20 a 160 mu J / pulso).
- Grabar las señales de presión utilizando un osciloscopio digital.
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Representative Results
Los liposomas se prepararon usando una técnica de hidratación de película delgada convencional con DPPC, MPPC y DSPE-PEG2000 en una relación molar de 86: 10: 4 o 7,95: 0,65:. 1,39 mg / ml 12 El tamaño de Au NPs es crítica para determinar la luz para calentar la eficiencia de conversión durante el siguiente experimento de excitación láser. Más pequeño es el tamaño de Au PN, mayor es la eficiencia de transducción. 13 Por lo tanto 5 nm Au PN, las muestras más pequeñas del proveedor, fueron escogidos para la encapsulación. Durante la síntesis, se añadió medio hidratante que contiene Au PN y calceína para generar vesículas multilamelares, que fueron luego sometidos a extrusión tamaño y cromatografía de filtración en gel para eliminar los libres Au PN y calceína.
La calceína es un colorante fluorescente hidrófilo está encapsulado dentro del núcleo acuoso de los liposomas a una concentración de 60 mM. En tales concentraciones elevadas, la fluorescencia de calcein auto-enfriamiento con agua. Sin embargo, la calceína se diluye ya que se libera de los liposomas, lo que lleva a la fluorescencia re-ganancia, lo que indica la liberación del fármaco activado. 14 Basándose en esta propiedad de los liposomas calceína se diluye a 5 mM y la respuesta del sistema liposomal para el cambio de temperatura fue observado. Como se indica en la Figura 2A, independientemente de la presencia de Au NPs, los liposomas eran casi intacto a la temperatura fisiológica (es decir, 37 ° C) con un porcentaje de fuga de menos de 10%. Sin embargo, cuando la temperatura se elevó a 42 ° C (ligeramente por encima de la temperatura de transición de los lípidos), 60% -80% de la calceína encapsulado se libera de los liposomas dentro de 2 min. No hubo diferencias significativas en el porcentaje de liberación se observa dentro de los liposomas con y sin PN Au, cuando la liberación se activa el uso de calor. Esto es debido a la temperatura de transición de fase del sistema. Por otra parte, la liberación rápida y eficiente se debe a la presena vez de 10% de MPPC, lo que mejora la permeabilidad de la bicapa de liposomas en la temperatura de transición.
A continuación, se examinó la liberación de calceína de los liposomas tras la irradiación con láser. La solución liposomal fue tomada en una cubeta de cuarzo que se colocó en un soporte de cubetas. 532 nm Nd: YAG láser de pulso con una duración de pulso de 6 ns y una densidad de potencia instantánea de 166,67 kW / cm 2 se centró en la solución liposomal. Las alícuotas de las muestras se recogieron en un número variable de impulsos (0, 25, 50 y 100) en el que la frecuencia de impulsos se fijó en 1 Hz. Las muestras se transfirieron inmediatamente a un tubo de microcentrífuga y se colocaron en un baño de hielo. Esto es para evitar cualquier nueva liberación de calceína. El láser se apaga mientras que la recogida de las muestras. Como se muestra en la Figura 2B, los liposomas con el Au NPs liberan la calceína encapsulado tras la excitación, en el que la cantidad de calceína liberada se incrementó como el num pulsofibras aumentó.
El último paso fue estudiar el mecanismo de liberación de calceína de los liposomas con hidrófonos. La figura 3A es la señal acústica grabada para Au NP (rojo), liposomas con Au NP (negros) y liposomas sin Au NP (Azules). Mientras Au NPs y liposomas con Au NPs mostraron señales de onda de presión característica, no se observó señal de liposomas sin Au NPs. El impulso de presión contiene fases tanto positivos como negativos (inserción en la Figura 3A). Sugiere que forman microburbujas (fase positiva) y perturban (fase negativa) en la solución. El los valores mínimos del máximo registrado en los liposomas que contienen Au NP-máximo y eran 0,00093 -0,00074 y V, respectivamente. Por último, se calcularon los máximos y mínimos promedio de los impulsos de presión como una función del aumento de la energía láser. Como era de esperar, la amplitud de la señal acústica aumenta gradualmente con el aumento del laserenergía (Figura 3B). Esto debe ser debido a la mayor intensidad de la oscilación de las partículas que atribuyen a la expansión termo-elástico posterior y contracción. 15,16
Figura 1. El mecanismo de liberación del fármaco propuesta de liposomas foto-sensibles: Au NP (puntos rojos) cuando se irradia, generan microburbujas que perturban la membrana del liposoma y así provocar la liberación de calceína calceína, auto-enfriamiento rápido dentro de liposomas (como se muestra), emite fluorescencia. como ser liberado a la rodea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. <strong> El calor y el láser de impulsos desencadenan la liberación de calceína de los liposomas (A) Porcentaje de calceína liberada de los liposomas con o sin Au PN, que se colocaron en un baño de agua con diferentes temperaturas durante 2 min.; (B) Porcentaje de calceína liberada de los liposomas con Au PN, que fueron tratados con láser pulsado (duración del pulso = 6 ns; densidad de potencia ~ 12 mW / cm2). Las barras de error representan la media ± desviación estándar (DE) de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Las señales acústicas (A) medidos usando un sistema de hidrófonos para Au NP (rojo), liposomas con Au NP (negros) y liposomas sin unau PN (azul). Mientras Au NPs y liposomas con Au NPs mostraron señales de onda de presión característica, no se observó señal de liposomas sin Au NPs. El recuadro muestra una vista ampliada de las señales acústicas de liposomas foto-sensible. (B) máxima y valor pico mínimo de los impulsos de presión como una función del aumento de la potencia del láser. La amplitud de la señal acústica aumenta gradualmente con el aumento de la energía del láser. Las barras de error representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes realizados en diez carreras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
hidratación de película delgada es el método convencional para la preparación de liposomas. disolventes orgánicos (cloroformo en este caso) se utilizó por primera vez para disolver los lípidos y luego se retiraron en un evaporador rotatorio a 37 ° C para generar una fina película lipídica en el matraz. Esta película de lípido se hidrató con la solución acuosa que contiene 60 mM de calceína y 5 nm Au NPs. Durante el proceso de hidratación, la temperatura se mantuvo alrededor de 50 ° C y el matraz se agita constantemente girando el matraz. La clave en este paso es la elección de temperaturas a las que la evaporación y la hidratación se llevaron a cabo respectivamente. La temperatura de transición de fase (T m) de DPPC, el principal constituyente del liposoma, es 41 ° C. Durante la formación de la película de lípidos pensar, la temperatura debe estar por debajo de 41 ° C para evitar la formación de grumos agregados de lípidos secos. Durante la hidratación, se eligió una temperatura superior a T m para conducir a los fosfolípidos dese auto-ensamblan en estructuras esféricas multilamelares. Aunque el método de hidratación de película delgada es fácil de realizar, que está limitado por la baja eficiencia de encapsulación (<1%) de la calceína y Au PN en la solución acuosa. En el futuro, la encapsulación puede ser mejorada a través de ciclos de congelación-descongelación.
Con posterioridad tamaño-extrusión se realizó utilizando un mini extrusora de mano, colocado en un bloque de calentamiento. Un máximo de 1 ml de solución se puede extruir usando esta configuración, que es ideal para una preparación a pequeña escala en el laboratorio. La clave en este paso es todavía la temperatura, que debe ser superior a la temperatura de transición de fase de los liposomas. Mediante la entrega de la extrusión a 50 ° C, el tamaño de los liposomas se hizo uniforme después de 10 ciclos de extrusión a través de la membrana con 200 nm poros. El movimiento en este paso debe ser lento y suave como la presión dentro del extrusor es grande, mientras que la membrana es frágil.
A menudo se pasa por alto, pero ste importantep durante la síntesis de liposomas que contienen el fármaco es la purificación o la eliminación de los fármacos de la ONU encapsulado (es decir, calceína y Au NPs aquí). Esto se hizo por cromatografía de filtración en gel. Es fundamental que el investigador observe que la columna PD-10 utilizado en este estudio sólo es adecuado para el procesamiento de <2 ml de solución. Las muestras con mayor volumen podrían ser procesados mediante el uso de varias columnas.
El estudio de la liberación de calceína de los liposomas se basa en la auto-extinción de la calceína a concentraciones más altas y re-fluorescencia como diluida. Cuando las muestras se expusieron a calor o luz para el tratamiento térmico o láser, respectivamente, partes alícuotas de las muestras fueron retiradas constantemente a diferentes puntos de temperatura o números de impulsos y se transfirieron a viales separados. Los viales se colocaron inmediatamente en un baño de hielo para evitar la potencial liberación adicional de calceína, para mediciones precisas. Otra cosa a notar es que calceína es sensible a la luzy por lo tanto podría ser blanqueado durante el experimento láser. Para superar esto, el efecto blanqueador de un láser de impulsos en la solución de calceína debe ser medido y los datos de liberación de liposomas normalizó en consecuencia.
El protocolo en la presente memoria describe un método de preparación fácil para los liposomas sensibles a la luz. balance térmico se demostró por primera vez, utilizando la temperatura de respuesta de los fosfolípidos. El láser establecido se ilustra y la luz desencadena la liberación se logra mediante láser pulsado. El mecanismo de la luz desencadena la liberación también se explora y se encuentra que es debido a la interrupción de la membrana por la cavitación de las microburbujas.
Diferente de todos los protocolos reportados, este protocolo elige materiales (es decir, lípidos y Au PN) que se han utilizado con frecuencia en los ensayos clínicos y ampliamente disponibles en el mercado. El uso de materiales de fácil acceso permite que cualquiera pueda preparar dicho sistema sensible a la luz por sí mismos, sin la need para buscar ayuda técnica. Además, este protocolo hace uso de hidratación de película delgada para preparar liposomas, que es a la vez rentable y fácilmente escalable.
Este protocolo simple pero potente beneficiará a los investigadores y médicos que están interesados en el logro de liberación controlada de fármacos a los tejidos superficiales como la piel. Una aplicación potencial sería para suministrar agentes anti-quemaduras solares mediante la incorporación de este sistema dentro de protector solar.
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Disclosures
No hay conflicto de intereses se declaran.
Acknowledgments
Este trabajo fue parcialmente apoyado por los Fondos de Investigación Académica de nivel 1 por Singapur Ministerio de Educación (RG 64/12 al CX) y el Instituto NTU-Noroeste de Nanomedicina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 850355P | Powder, Store at -20 °C |
| 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 855675P | Powder, Store at -20 °C |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 880120P | Powder, Store at -20 °C |
| Gold Nanoparticles | Sigma Aldrich | 752568-100mL | 5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875-10g | 60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH) |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | 0.1 mM, pH 7.4 |
| Double distilled water | Millipore Milli-DI water purification system | ||
| Triton X100 | Sigma, Life Sciences | X-100 | To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation |
| Rotavapor | Buchi (Switzerland) | R 210 | Used for Lipososme preparation |
| Heating bath | Buchi (Switzerland) | B 491 | Used for Lipososme preparation |
| Vacuum Controller | Buchi (Switzerland) | V-850 | Used for Lipososme preparation |
| Vacuum Pump | Buchi (Switzerland) | V-700 | Used for Lipososme preparation |
| Recirculation bath with temperature controller | Polyscience | Used for Lipososme preparation | |
| Mini-extruder assembly with heating block | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610000 | Used for extrusion of liposomes |
| Syringes, 1,000 μl | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610017 | Used for extrusion of liposomes |
| Polycarbonate filter membrane, 200 nm | Whatmann | 800281 | Used for extrusion of liposomes |
| Filter Support | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610014 | Used for extrusion of liposomes |
| PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium | GE Healthcare, Life sciences | 17-0851-01 | Used to purify the liposomes |
| Centrifuge | Sigma Laboratory Centrifuges | 3K30 | Used to concentrate the liposomal solution |
| Rotor | Sigma | 19777-H | Used to concentrate the liposomal solution |
| Zetasizer | Nano ZS Malvern | Used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| UV-Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-2450 | Used to measure the absorbance of the samples |
| Fluorescent Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Used to measure the fluorescence emission of the samples |
| Nd:YAG Laser | NewWave Research | 532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation | |
| HNR Hydrophone | ONDA | HNR-1000 | 1 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals |
| Digital Osciloscope | LECORY - Wave Runner 64Xi-A | Frequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals |
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