Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

DamID وما يليها: رسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات البروتين DNA بواسطة إنتاجية عالية تسلسل شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين

Published: January 27, 2016 doi: 10.3791/53620
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

Summary

وصفنا هنا مقايسة وذلك بربط تحديد الأدينين DNA ناقلة الميثيل (DamID) الى ارتفاع التسلسل الإنتاجية (DamID وما يليها). يوفر هذا الأسلوب تحسين دقة أعلى وأوسع نطاق الدينامية، ويسمح تحليل البيانات DamID وما يليها بالاشتراك مع غيرها من البيانات التسلسل إنتاجية عالية مثل رقاقة وما يليها، RNA وما يليها، الخ

Introduction

DNA تحديد الأدينين ناقلة الميثيل (DamID) 1،2 هو وسيلة للكشف عن التفاعلات DNA البروتين في الجسم الحي وغير نهج بديل للمناعي لونين (رقاقة) 3. ويستخدم كمية قليلة نسبيا من الخلايا و لا يتطلب الكيميائية عبر ربط البروتين مع الحمض النووي أو الأجسام المضادة محددة للغاية. هذا الأخير هو مفيدة بشكل خاص عندما فضفاضة أو غير مباشر ويرتبط البروتين الهدف مع DNA. وقد استخدم DamID بنجاح لرسم خريطة للمواقع الربط من مجموعة متنوعة من البروتينات بما في ذلك البروتينات المغلف النووي 10/04، لونين المرتبطة البروتينات 11-13، لونين تعديل الانزيمات 14، عوامل النسخ وشارك في العوامل 15-18 والأجهزة رني 19. طريقة قابلة للتطبيق في الكائنات متعددة بما في ذلك S. الخباز 13، S. pombe 7، C. ايليجانس 9،17، D. البطن 5،11،18،20، A. thaliana 21،22 فضلا عن الماوس والخلايا البشرية خطوط 6،8،10،23،24.

واستند تطوير فحص DamID على كشف محدد من شظايا الحمض النووي ميثليته الأدنين في الخلايا حقيقية النواة التي تفتقر الأدينين الذاتية مثيلة 2. بروتين الانصهار أعرب، التي تتكون من بروتين ملزمة DNA من الفائدة وE. القولونية DNA الأدينين ناقلة الميثيل (السد)، ويمكن ميثيل قاعدة الأدينين في تسلسل GATC التي هي في القرب المكاني (الأهم في حدود 1 كيلو بايت وتصل إلى ما يقرب من 5 كيلو بايت) إلى مواقع الربط من البروتين في الجينوم 2. شظايا الحمض النووي تعديل يمكن أن تتضخم على وجه التحديد وتهجين لالمجهرية للكشف عن مواقع الربط الجينومية من البروتين من الفائدة 1،25،26. وهذه الطريقة DamID الأصلي محدودة بسبب توافر المجهرية وكثافة تحقيقات محددة سلفا. لذا قمنا متكاملة إنتاجية عالية التسلسل فيلDamID 10 وعينت الأسلوب كما DamID وما يليها. عدد كبير من باختصار يقرأ ولدت من DamID وما يليها تمكن التعريب الدقيق للتفاعلات-DNA البروتين على نطاق الجينوم. وجدنا أن DamID وما يليها توفير دقة أعلى ومجموعة ديناميكية أوسع من DamID من قبل ميكروأري لدراسة الجينوم النووي الصفيحة (NL) جمعيات (10). وتسمح هذه الطريقة تحسن التحقيق الجمعيات NL داخل هياكل الجين 10 ويسهل مقارنات مع غيرها من البيانات التسلسل إنتاجية عالية، مثل رقاقة وما يليها وRNA وما يليها.

بروتوكول DamID تسلسل وصفها هنا وضعت في البداية لرسم خرائط الجينوم NL الجمعيات 10. ولدت لنا بروتين الانصهار بواسطة تشغيل ربط الماوس أو لامين البشري B1 إلى E. القولونية DNA الأدينين ناقلة الميثيل واختبار البروتوكول في 3T3 الخلايا الليفية الماوس الجنينية، C2C12 الماوس myoblasts 10 و IMR90 الليفية رئة الجنين الإنسان (بيانات غير منشورة). في هذا البروتوكول، ونحن نبدأ مع جonstructing النواقل والتعبير عن البروتينات الانصهار سد-المربوطة عن طريق العدوى lentiviral في خلايا الثدييات 24. المقبل، وصفنا بروتوكولات مفصلة لتضخيم شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين وإعداد مكتبات التسلسل الذي ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق في الكائنات الحية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. جيل والتعبير عن البروتينات الانصهار والسد الحرة البروتينات

  1. البروتين استنساخ المصالح في ناقلات DamID.
    1. تضخيم [كدنا من البروتين ذات الاهتمام (POI) باستخدام عالية الدقة DNA بوليميريز المطلوب والاشعال المناسبة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تجريبيا تحديد شروط التضخيم المثلى لضمان التضخيم السليم للتدرج.
    2. تشغيل agarose هلام وتنقية تضخيم [كدنا من POI من قبل مجموعة استخراج الهلام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    3. استنساخ [كدنا من POI في ناقلات pDONR201 باستخدام BP Clonase الثاني وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    4. استنساخ [كدنا من POI من ناقلات المانحة في ناقلات جهة pLGW-RFC1-V5-EcoDam أو pLGW-EcoDam-V5-RFC1 جهة ناقلات 27 باستخدام LR Clonase الثاني وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، اعتمادا على الاتجاه المطلوب من الصمامات POI إلى N-محطة أو عشرالبريد C-محطة من E. القولونية DNA الأدينين ناقلة الميثيل (EcoDam) 27.
    5. التحقق من قبل تسلسل أن كدنا] المستنسخة لديها التسلسل الصحيح والنماذج في إطار الاندماج في EcoDam.
  2. توليد الأسهم lentiviral.
    1. توليد الأسهم lentiviral معربا عن سد-V5-POI وV5-السد (من ناقلات pLGW-V5-EcoDam 27) باستخدام نظم التعبير lentiviral. استخدم الإجراء ترنسفكأيشن إلى الأمام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      1. استخدام الخلايا 293T وlipofection لتوليد الأسهم lentiviral وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لترنسفكأيشن.
      2. تتضمن الخطوة مرشح 0.45 ميكرومتر PVDF.
  3. تصيب الخلايا مع الفيروسة البطيئة.
    1. قبل يوم واحد العدوى (يوم 0)، تمر الخلايا الملتصقة مثقف في وسائل الإعلام نمو مناسب لهذا النوع من الخلايا إلى 6 جيدا نسيج لوحة الثقافة باستخدام وسائط النمو نفسه من دون مضادات حيوية لتحقيق 50٪ التقاء في اليوم من العدوى. خلايا مكان في الحاضنة 37 درجة مئوية.
    2. في يوم من العدوى (يوم 1)، وإزالة 2 cryovials كل من سد-V5-POI وV5-سد supernatants lentiviral من -80 ° C الفريزر والمكان في 37 ° C حمام الماء لذوبان الجليد.
      1. إزالة وسائط النمو من خلايا واستبدالها مع 0.5 مل من وسائط النمو الطازجة بدون المضادات الحيوية.
      2. إضافة 1 مل من الفيروسة البطيئة إذابة إلى كل بئر (2 الآبار مع V5 السدود والآبار 2 مع سد-V5-POI). إضافة 1 مل من وسائط النمو دون المضادات الحيوية إلى 2 المتبقية آبار هذا سيكون بمثابة سيطرة سلبية. يهز بلطف لوحة 6 جيدا لخلط ووضع مرة أخرى في 37 ° C حاضنة O / N.
    3. بعد يوم من العدوى (يوم 2)، وإزالة تعليق الفيروسية من الخلايا واستبدالها مع 2 مل وسائط النمو دون المضادات الحيوية. خلايا المكان مرة أخرى في C الحاضنة 37 درجة لمدة 48 ساعة.
  4. عزل gDNA.
    1. وسائل الإعلام نضح من كل بئر وديخلايا تاش باستخدام 250 ميكرولتر 0.05٪ التربسين-EDTA. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    2. غسل الخلايا قبالة اللوحة مع 1 مل وسائط النمو والخلايا ماصة من كل بئر في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    3. غسل الخلايا مكعبات مع 500 ميكرولتر PBS وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 2 دقيقة في RT.
    4. الخلايا resuspend مكعبات في 200 ميكرولتر PBS.
    5. عزل gDNA من قبل مجموعة الدم والأنسجة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل gDNA في 200 العازلة ميكرولتر AE وتحديد تركيز من خلال قياس OD 260 باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
      ملاحظة: gDNA من الخلايا المصابة غير المصابة أو وهمية يمكن أن تكون معزولة عن ضوابط السلبية. يعجل gDNA لتركيزات أعلى للتخزين على المدى الطويل.
      1. إضافة 3 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪ و 0.1 حجم 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.5)، وتخلط بواسطة قلب أنابيب 4-6 مرات.
      2. مخزن في -20 درجة CO / N.
      3. الطرد المركزي في 16000 سز لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      4. إزالة طاف بعناية. غسل الكريات مع 70٪ (حجم / حجم) الإيثانول وأجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      5. إزالة بعناية الايثانول والسماح للهواء الجاف الكريات لمدة 3 دقائق على RT.
      6. حل gDNA في T 10 E 0.1 (7.5 درجة الحموضة) إلى ما يقرب من 1 ميكروغرام / ميكرولتر. تجمع gDNA من كل عينة تجريبية أو سيطرة سلبية وقياس تركيز. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

2. أسهب الأدينين ميثليته-شظايا الحمض النووي

  1. ملخص gDNA مع DpnI الذي يمر فقط GATCs-ميثليته الأدينين.
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع 2.5 ميكروغرام gDNA، 1 ميكرولتر 10X العازلة، 0.5 ميكرولتر DpnI (20 U / ميكرولتر) وملء مع H 2 O إلى وحدة تخزين ما مجموعه 10 ميكرولتر. لكل عينة gDNA، وإعداد ثلاثة ردود الفعل - واحدة من دون DpnI ("لا DpnI"، استبدل DpnI مع 0.5 ميكرولتر H 2 O) واثنين ثإيث DpnI ("مع DpnI").
    2. ملخص O / N عند 37 درجة مئوية وتعطيل DpnI في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  2. Ligate محولات DamID.
    1. إعداد محولات DamID.
      1. resuspend كل من الاثنين DamID محول oligos 24 في H 2 O إلى تركيز النهائي من 100 ميكرومتر.
      2. الجمع بين كميات متساوية من اثنين DamID محول oligos، ومزيج وضع في أنبوب مغلق بإحكام. ختم أنبوب مع parafilm، والجلوس في رفوف وضعها في كوب مملوء بالماء عند 90 ° C. الحفاظ على مستوى الماء أقل من الحد الأقصى للأنبوب (لتجنب الحصول على الماء في أنبوب) ولكن فوق سطح مزيج بنسبة ضئيلة.
      3. دع الماء البارد لRT حتى يصلب محولات ببطء.
      4. قسامة محولات صلب (50 ميكرومتر) وتخزينها في -20 ° C.
    2. إعداد رد فعل على الجليد. في كل أنبوب من 2.1.2، إضافة 6.2 ميكرولتر H 2 O، 2 ميكرولتر 10X العازلة ربط، 0.8 ميكرولتر 50 ميكرومتر DamID الإعلانaptors (إذابة على الجليد) و 1 ميكرولتر T4 DNA يغاز (5 U / ميكرولتر). الحجم الكلي هو 20 ميكرولتر. في واحد من اثنين "مع DpnI" الأنابيب، استبدال يغاز مع 1 ميكرولتر H 2 O ("لا يغاز") لاحظ أن كل عينة gDNA اثنين ضوابط السلبية - "لا DpnI" و "لا يغاز".
    3. Ligate O / N في 16 ° C ووقف نشاط يغاز عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. ملخص DNA مع DpnII لتدمير شظايا التي تحتوي على GATCs unmethylated.
    1. إعداد رد فعل على الجليد. في كل أنبوب من 2.2.3، إضافة 24 ميكرولتر H 2 O و 5 ميكرولتر 10X DpnII العازلة و1 ميكرولتر DpnII (10 U / ميكرولتر). الحجم الكلي هو 50 ميكرولتر.
    2. ملخص عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة وتعطيل DpnII عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  4. تضخيم شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين.
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع 5 ميكرولتر DpnII الهضم من 2.3.2، 5 μل 10X العازلة PCR، 12.5 ميكرولتر 5 ميكرومتر DamID PCR التمهيدي 24، 4 ميكرولتر 10 ملي dNTP المزيج، 1 ميكرولتر 50X مزيج البلمرة و 22.5 ميكرولتر H 2 O. الحجم الكلي هو 50 ميكرولتر.
    2. تشغيل PCR على النحو التالي: 68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 65 ° C لمدة 5 دقائق، 68 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. 4 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 65 ° C لمدة 1 دقيقة، 68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. 17 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 65 ° C لمدة 1 دقيقة، 68 ° C لمدة 2 دقيقة.
    3. تحليل 5 منتجات ميكرولتر PCR من كل رد فعل على هلام الاغاروز 1٪. يجب أن تظهر منتجات PCR كما مسحة يتراوح بين 0.2 و 2 كيلو بايت (الشكل 2). يجب أن يكون التحكم "لا DpnI" و "لا يغاز" لا أو بوضوح أقل التضخيم.
    4. إذا كانت النتيجة من الخطوة 2.4.3 مرضية، كرر الخطوات 2.4.1-2.4.3 مع اثنين أو ثلاثة ردود الفعل للعينة التجريبية ورد فعل واحد لكل اثنين من الضوابط السلبية.
    5. تجمع وتنقية المنتجات PCR من نفسالعينة التجريبية باستخدام أدوات تنقية PCR أو المرحلة الصلبة عكسية الشلل (سبري) الخرز وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. لا تنقي "لا DpnI" أو ضوابط "لا يغاز". أزل الحمض النووي مع العازلة EB.
    6. قياس تركيز الحمض النووي تنقيته عن طريق قياس OD 260 باستخدام مقياس الطيف الضوئي، التي ينبغي أن تكون نحو 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر أو أعلى. جمع ما لا يقل عن 10 ميكروغرام DNA لكل عينة. إذا باستخدام أدوات تنقية PCR، وتنقية كل 50 ميكرولتر المنتجات PCR مع عمود واحد، أزل في 30 العازلة ميكرولتر EB وتجميع eluates.
  5. ملخص DNA مع DpnII لمنع الاشعال DamID PCR من أن التسلسل.
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع DNA النقي 5 ميكروغرام من 2.4.6، 5 ميكرولتر 10X DpnII العازلة، 1 ميكرولتر DpnII (10 U / ميكرولتر) وملء مع H 2 O إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 ميكرولتر. إعداد اثنين أو ثلاثة من ردود الفعل لكل عينة.
    2. الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعةوتعطيل DpnII عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    3. تجمع وتنقية هضم من نفس العينة مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل الحمض النووي مع العازلة EB.
    4. قياس تركيز الحمض النووي المنقى الذي ينبغي أن يكون حول 0.06 ميكروغرام / ميكرولتر أو أعلى. جمع ما لا يقل عن 6 ميكروغرام DNA لكل عينة. إذا باستخدام أدوات تنقية PCR، وتنقية كل 50 ميكرولتر الهضم مع عمود واحد، أزل في 30 العازلة ميكرولتر EB وتجميع eluates.

3. إعداد مكتبة للإنتاجية عالية التسلسل

  1. جزء DNA
    1. تجريبيا تحديد الوقت الهضم المناسب لكل دفعة جديدة من dsDNA Fragmentase. كما قد يقلل من نشاط انزيم مع مرور الوقت، كرر الاختبار قبل تنفيذ تجربة جديدة. لحفظ الحمض النووي من 2.5.4 لتفتيت الفعلي، استخدم تنقية المنتجات PCR الميثيل من 2.4.6 أو DNA اضافية من experime السابقاليلة في هذه الخطوة.
      1. إعداد مزيج الرئيسي مع DNA 6 ميكروغرام، 12 ميكرولتر 10X Fragmentase العازلة وملء مع H 2 O إلى الحجم الإجمالي من 114 ميكرولتر.
      2. دوامة القارورة الأسهم Fragmentase لمدة 3 ثانية، إضافة إلى 6 ميكرولتر مزيج الرئيسي ودوامة مزيج الرئيسي لمدة 3 ثانية. الحجم الكلي هو 120 ميكرولتر.
      3. قسامة 20 ميكرولتر من مزيج الرئيسي لكل من 5 أنابيب جديدة. احتضان جميع أنابيب 6 إلى 37 درجة مئوية لمدة 5-55 دقائق على زيادة قدرها 10 دقيقة. إضافة 5 ميكرولتر 0.5 M EDTA لوقف التفاعل.
      4. تحليل 12.5 الهضم ميكرولتر (0.5 ميكروغرام DNA) من كل رد فعل وكذلك 0.5 ميكروغرام DNA عسر الهضم على هلام الاغاروز (الشكل 3). تحديد الحد الأدنى من الوقت (T 0.2kb) اللازمة لهضم معظم مسحة إلى حوالي 0.2 كيلو بايت. 6 حدد فترات زمنية بين 5 دقائق و T 0.2kb (بما في ذلك 5 دقائق وT 0.2kb) مع زيادات متساوية للتجزئة الفعلي.
    2. إعداد fragmen الفعليةالكساء كما هو موضح في 3.1.1.1-3.1.1.3. احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية لفترات زمنية تحددها في 3.1.1.4.
    3. تجمع 6 ردود الفعل وتنقية هضم مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 51 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 50 ميكرولتر.
  2. إصلاح ينتهي من الحمض النووي مجزأة
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع شطافة من 3.1.3، 25 ميكرولتر H 2 O، 10 ميكرولتر 10X T4 DNA يغاز العازلة مع 10 ملي ATP، 4 ميكرولتر 10 ملي مزيج dNTP، 5 ميكرولتر DNA T4 البلمرة (3 U / ميكرولتر) ، 1 ميكرولتر Klenow DNA البلمرة (5 U / ميكرولتر)، و 5 ميكرولتر T4 كيناز عديد النوكليوتيد. الحجم الكلي هو 100 ميكرولتر. تخلط جيدا مع ماصة. تجنب رغوة وفقاعات.
    2. احتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. تنقية الحمض النووي مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 33 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 32 & #181؛ ل.
  3. إضافة "A" يتدلى
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع شطافة من 3.2.3، 5 ميكرولتر 10X Klenow العازلة، 10 ميكرولتر 1 ملي dNTP، و 3 ميكرولتر Klenow (3 '→ 5' exo-) (5 U / ميكرولتر). الحجم الكلي هو 50 ميكرولتر. تخلط جيدا مع ماصة. تجنب رغوة وفقاعات.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. تنقية الحمض النووي مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 22 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 21 ميكرولتر.
  4. محولات التسلسل Ligate
    1. إعداد محولات تسلسل 28.
      1. resuspend كل محول بنسبة ضئيلة إلى تركيز 100 ميكرومتر في 10 ملي تريس، الكلور (درجة الحموضة 7.8)، 0.1 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة) و 50 ملي كلوريد الصوديوم.
      2. خلط كميات متساوية من محول عالمي 28 ومحول مفهرسة 28.
      3. يصلب محولات في cycler الحرارية بما يليالبرنامج: 95 ° C لمدة 2 دقيقة. 140 دورات لمدة 30 ثانية ابتداء من 95 درجة مئوية، وتنخفض بنسبة 0.5 ° C كل دورة. عقد في 4 درجات مئوية.
      4. محولات قسامة وتخزينها في -20 ° C.
    2. إعداد رد فعل على الجليد مع شطافة من 3.3.3، 25 ميكرولتر 2X العازلة ربط، 1.5 ميكرولتر 50 ميكرومتر صلب محولات التسلسل (إذابة على الجليد) من 3.4.1.4 و 2.5 ميكرولتر DNA T4 يغاز. تخلط جيدا مع ماصة. تجنب رغوة وفقاعات. إذا كان المطلوب تسلسل متعددة، استخدام محول مفهرسة مختلفة لكل عينة.
    3. في احتضان RT لمدة 1 ساعة.
    4. تنقية الحمض النووي مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 24 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 23 ميكرولتر.
  5. تحويل محولات على شكل Y لdsDNA لتمكين بدقة تحديد جزء DNA أحجام 28
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع شطافة من 3.4.4، 12.5 ميكرولتر H 2 O، 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 1 28، 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 2 28، 1.5 ميكرولتر dNTP 10MM، 10 ميكرولتر 5X PCR العازلة و 1 ميكرولتر البلمرة DNA (1 U / ميكرولتر).
    2. تشغيل PCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 5 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 72 ° C لمدة 1 دقيقة. 4 درجات مئوية على الانتظار.
    3. تنقية الحمض النووي مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 11 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 10 ميكرولتر.
  6. حجم اختيار المكتبة
    1. إعداد 2٪ agarose هلام مع العازلة 1X TAE. إضافة إيثيديوم بروميد (تنبيه!) لتركيز النهائي من 500 نانوغرام / مل عندما يبرد ذاب حل تاي-الاغاروز لتجنب استنشاق بروميد إيثيديوم. تأكد من أن لديك ما يكفي الممرات لجميع العينات، سلم DNA وممرات فارغة.
    2. إضافة 8 ميكرولتر صبغ 6X تحميل لشطافة من 3.5.3.
      3. <لى> إعداد سلم DNA عن طريق خلط 1 كيلوبايت زائد سلم DNA (1.0 ميكروغرام / ميكرولتر)، 6X صبغ التحميل وH 2 O في نسبة 1: 1: 4.
    3. تحميل 6 ميكرولتر سلم DNA، وعينات من الحمض النووي 3.6.2 وسلم 6 ميكرولتر آخر، كل في ممر منفصل ومع واحد على الأقل ممر فارغ من عينات المجاورة / سلالم.
    4. تشغيل هلام في 120 V لمدة 60 دقيقة.
    5. عرض الجل على نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية (تقليل زمن التعرض للأشعة فوق البنفسجية). ارتداء النظارات الواقية ودرع الوجه. تأكد من واحد على الأقل من سلالم DNA تعمل بشكل جيد مع تباعد المناسب (ما يكفي لاستئصال 3 شرائح هلام) بين 300 و 400 نقطة أساس العصابات مضت. تباعد ضيق يزيد من صعوبات في استئصال شرائح هلام متعددة، بينما تباعد واسعة يزيد من حجم شرائح هلام رفعه.
    6. استخدام مشرط جديد أو شفرة حلاقة لكل حارة. المكوس ثلاث شرائح رقيقة جل ما بين 300 و 400 نقطة أساس من كل حارة (الشكل 4) ووضعها في كل أنبوب microcentrifuge. الحفاظ على حجم كل الصورة هلامالقمل عند أدنى مستوى ممكن (<100 ميكرولتر).
    7. قياس حجم كل شريحة هلام (1 ميكرولتر هلام يزن حوالي 1 ملغ)، إضافة وحدات 6X العازلة QG واحتضان عند 50 ° C.
    8. دوامة الخليط QG جل كل 2-3 دقائق حتى يذوب شريحة هلام تماما. إضافة وحدات جل 2X من الأيزوبروبانول وتخلط.
    9. من هذه الخطوة، اتبع البروتوكول من مجموعات استخراج الهلام. أزل DNA العازلة في 51 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 50 ميكرولتر.
  7. إثراء محول تعديل تسلسل الحمض النووي شظايا
    1. تحسين عدد من دورات PCR 29.
      1. إعداد رد فعل على الجليد مع 1 ميكرولتر شطافة من 3.6.10، 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 1 28، 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 2 28، 7 ميكرولتر H 2 O و 10 ميكرولتر SYBR الخضراء Supermix. الحجم الكلي هو 20 ميكرولتر.
      2. تشغيل QPCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 20 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وقراءة اللوحة.
      3. تحليل البيانات باستخدام برامج التحليل QPCR وتحديد دورة الكمي (CQ) أو دورة عتبة (CT) لكل عينة باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة. تواصل مع العينات التي لديها CQ / ط م ≤ 14. استخدام الأقصى CQ (CQ 0) ناقص 1 (مقربا إلى العدد الصحيح الأعلى الذي يليه) بصيغتها النهائية PCR عدد دورة (N PCR).
      4. ضبط كميات من قوالب DNA بحيث يتم تضخيم عينات مختلفة لكميات متساوية تقريبا بعد تشغيل نفس عدد دورات PCR. استخدام 8 قالب ميكرولتر لعينة وفقا لأعلى CQ (CQ 0)، وحساب حجم القالب من عينات أخرى مع الصيغة التالية:
        المجلد الأول = 8 × 1.8 CQ ط -Cq 0
    2. إعداد ردود الفعل PCR على الجليد مع وحدات التخزين قالب تحسب من 3.7.1.4: 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 1 28، 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 2 28، 1.5ميكرولتر 10 ملي dNTP، 10 ميكرولتر 5X العازلة، 1 ميكرولتر البلمرة DNA (1 U / ميكرولتر) وملء مع H 2 O إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 ميكرولتر.
    3. تشغيل PCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية؛ دورات N PCR (تحديد في 3.7.1.3) من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 72 ° C لمدة 1 دقيقة. 4 درجات مئوية على الانتظار.
    4. تحليل 5 منتجات ميكرولتر PCR في هلام الاغاروز 2٪ (الشكل 5A). وتشير واضحة الفرقة "واحدة" أن شظايا تضخيم الحمض النووي هي ضمن نطاق ضيق طول وأن مكتبة DNA يمكن أن تخضع لمزيد من التحليل.
    5. تكرار رد فعل واحد للحصول على عينات مختارة وتجمع المكتبات تضخيم الحمض النووي من نفس العينة.
    6. تنقية المكتبات DNA تم اختيارها لالتسلسل.
      1. إذا dimers التمهيدي / محول غير مرئية في 3.7.4، تنقية مكتبات الحمض النووي مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 21 ميكرولتر EB. الشطافة النهائي ~ 20 ميكرولتر. إذا منشأة التسلسل المستخدم لديه تعليمات محددة على شطف العازلة، والحجم النهائي، وما إلى ذلك، وإعداد العينات وفقا لذلك.
      2. إذا dimers التمهيدي / محول واضحة للعيان في 3.7.4، تنقية المكتبات على النحو التالي.
        1. DNA تحميل من 3.7.5 وسلم DNA في 2٪ هلام الاغاروز الجاهزة. يمكن تنقية عينات كما هو موضح في 3.7.6.1 للحد من حجم أو يمكن تحميلها في الآبار متعددة. وضع الجل الاغاروز في نظام الطاقة المناسب. السماح للهلام لتشغيل لمدة 15 دقيقة.
        2. باستخدام نقل transilluminator المناسب، قطع الفرقة المطلوب مع نظيفة مشرط / الحلاقة لكل عينة ووضع شريحة جل في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
        3. عزل DNA باستخدام أدوات استخراج الهلام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة مع تعديلين: احتضان العازلة خليط QG-جل في خلاط الحرارية عند 37 درجة مئوية و 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة، وإضافة وحدات جل 2X من الأيزوبروبانول.
  8. إرسال المكتبات DNA النقاء إلى مرفق التسلسل. اتبع جميع المبادئ التوجيهية المرفق.
    ملاحظة: تحليل نوعية من قبل Bioanalyzer (الشكل 5B) يجب أن يتم تنفيذ قبل التسلسل من أجل تحديد مدى حجم الدقيق وتركيز مكتبة DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم التحقق من انصهار بروتين سد-V5-LMNB1 يشترك المترجمة مع البروتين الذاتية لامين B المناعي تلطيخ (الشكل 1).

التضخيم PCR الناجح لشظايا الحمض النووي ميثليته الأدنين هو خطوة رئيسية لDamID وما يليها. يجب أن العينات التجريبية تضخيم مسحة من 0،2-2 كيلو بايت في حين أن ضوابط السلبية (بدون DpnI، دون يغاز أو بدون قالب PCR) ينبغي أن يؤدي إلى عدم أو أقل بشكل واضح التضخيم (الشكل 2).

شظايا الحمض النووي للمثيلة هي في حدود 0،2-2 كيلوبايت، في حين أن حجم إدراج المطلوبة للمكتبة NGS هو 200-300 نقطة أساس. لذلك، لا بد من تفتيت المنتجات PCR الميثيل في نطاق حجم مناسب. ومع ذلك، فقد وجدت أن يكون غير عملي لكسر في وقت واحد شظايا الحمض النووي أكبر وصولا الى حجم مناسبالصورة والحفاظ على الغالبية العظمى من شظايا الحمض النووي أصغر سليمة في مدة تجزئة واحدة. لذلك، وقد أجريت تجارب الوقت بالطبع لتحديد الحد الأدنى من الوقت (T 0.2kb) اللازمة لجزء 1 DNA ميكروغرام إلى تشويه تركزت في 200 سنة مضت (الشكل 3). ثم تم اختيار 6 فترات الوقت، بمقادير متساوية بين 5 دقائق و T 0.2kb للتجزئة الفعلي. النشاط الأنزيمي من حبلا مزدوج DNA Fragmentase قد تختلف من دفعة لدفعة وقد ينخفض ​​مع مرور الوقت، لذلك فمن المستحسن أن كرر هذه الخطوة دفعة جديدة من Fragmentase أو بعد التخزين لفترة من الزمن.

حجم إدراج المطلوب ما بين 200 و 300 نقطة أساس المقابلة لشظايا الحمض النووي بين 300 و 400 سنة مضت (بما في ذلك 121 محولات بي بي التسلسل) على agarose هلام. تم رفعه ثلاث شرائح رقيقة ضمن هذا النطاق من كل عينة تجريبية لتضييق نطاق حجم المكتبة وزيادة إمكانيةالحصول على مكتبة التسلسل المؤهلة واحد على الأقل (الشكل 4).

تم تحليل قسامة من 5 ميكرولتر من كل مكتبة تضخيم الحمض النووي على هلام الاغاروز لتحديد أي مكتبة قد تأهل للالتسلسل. كما هو مبين في الشكل 5A، ينبغي أن تكون فرقة واحدة واضحة بنفس حجم شريحة هلام رفعه مرئية على هلام الاغاروز (الخطوة 3.7.4). بعد ذلك، تم فحص المكتبات اختيارهم من قبل لBioanalyzer (الشكل 5B) لتحديد مدى حجم الدقيق وتركيزات قبل التسلسل. إذا رغبت في ذلك، والمكتبات تضخيم الحمض النووي يمكن فحصها مباشرة من دون تحليل Bioanalyzer هلام. عندما مكتبات متعددة ذات نوعية جيدة، فمن المستحسن أن تسلسل مكتبات مشابهة من حيث الحجم وتتراوح لزوج من التجريبية (الخلايا معربا عن سد-V5-POI) والتحكم (الخلايا معربا عن V5-السد) العينات.

يقرأ ولدت القصير من قبلتم تعيين أنظمة تسلسل أولا إلى الجينوم المقابلة. محاذاة فريد يقرأ ثم تم تمريرها إلى تحليلات لاحقة. خط أنابيب لمعالجة باختصار يقرأ، بناء الجينوم NL خريطة التفاعل وتحليل وصفت جمعيات الجينات NL بالتفصيل في عملنا السابق 10. وتظهر نتائج ممثل في الشكل 6.

الشكل 1
الشكل 1. التحقق من صحة تعريب النووية الدقيقة من البروتينات الانصهار المناعي تلطيخ. و transfected الخلايا الليفية IMR90 رئة الإنسان عابر مع البلازميد معربا عن سد-V5-LMNB1 وكانت ملطخة التي كتبها المضادة للامين B (A، أحمر) ومكافحة V5 (B، أخضر). (C) دمج الصور في ألف وباء الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من رشخصية له.

الرقم 2
تم تحليل الشكل 2. PCR تضخيم شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين. قسامة من 5 ميكرولتر من كل تفاعل PCR على agarose هلام 1٪. تم تضخيمه وتشويه يتراوح بين 0.2 و 2 كيلو بايت من كل عينة تجريبية، ولكن لم يلاحظ أي التضخيم في الضوابط السلبية (لا DpnI في الخطوة 2.1، لا يغاز في الخطوة 2.2، أو أي قالب PCR). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تحديد فترات تجزئة الأمثل. وتنقيته المنتجات PCR الميثيل الخاضعة للتجزئة لفترات الوقت 5-55 دقائق على زيادة قدرها 10 دقيقة (DNA عسر الهضم ، وصفت بأنها "0 دقيقة"). وقد تم تحليل 1 ميكروغرام من سلم DNA و 0.5 ميكروغرام لكل عينة من الحمض النووي مجزأة على هلام الاغاروز. تم تحديد الحد الأدنى من الوقت لهضم معظم مسحة DNA إلى حوالي 200 سنة مضت أن يكون حوالي 35 دقيقة، لذلك تم اختيار ستة فترات الوقت متباعدة بشكل متساو بين 5 و 35 دقيقة (شملت 5 و 35 دقيقة) لأداء تجزئة الفعلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. حجم اختيار المكتبات DNA. عينات من الحمض النووي من سد-V5-LMNB1 وV5-السد من تم تشغيل الخطوة 3.6 على هلام الاغاروز 2٪، وثلاث شرائح هلام متساوية الحجم (L، M و H الموافق المنخفضة والمتوسطة وارتفاع في حجم) تم رفعه بين 300 و 400 نقطة أساس كما يتضح من الخطوط الصفراء. OM / ملفات / ftp_upload / 53620 / 53620fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. المكتبات أسهب DNA لارتفاع الإنتاجية التسلسل. (A) تضخيم المكتبات DNA تحليلها على هلام الاغاروز. تم تنقيته قوالب PCR من شرائح هلام هو مبين في الشكل (4). (ب) النتائج Bioanalyzer من V5-السد (L) عينة وسد-V5-LMNB1 (L) عينة التي تم أكدت في (A). وكان لهذه المكتبات اثنين من نطاقات مشابهة حجم الضيق وبالتالي تأهل لارتفاع الإنتاجية التسلسل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

JPG "/>
ويظهر الشكل 6. بيانات NGS عرضها في UCSC متصفح الجينوم. ماوس كروموسوم 1 كمثال على ذلك. تم إنتاج البيانات تسلسل من myoblasts الماوس C2C12 10. مسارات "MB.LmnB1.w2k" و "MB.Dam.w2k"، المقابلة للبيانات الصادرة عن الخلايا معربا عن سد-V5-LMNB1 وV5-سد على التوالي، مؤامرة تطبيع الكثافة قراءة (يقرأ في كيلو قاعدة لكل مليون تعيين فريد يقرأ، أو RPKM ) في غير متداخلة متتالية النوافذ 2 كيلو على طول الكروموسوم. تتبع "MB.log2FC.w2k" المؤامرات الجمعيات الجينوم NL، أي log2 RPKM نسب LMNB1 على السد، في (2) قرار كيلوبايت. تتبع "MB.sLADs" يرسم الصفيحة أسوشيتد المجالات القائم على التسلسل (sLADs، أي مناطق الجينوم التي لديها كثافة قراءة أعلى من LMNB1 على سد ذات دلالة إحصائية) باللون الأسود، غير sLADs في المناطق الرمادية وغير محددة باللون الأبيض. يرجى النقر هنا ل انزالد هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ViraPower Lentiviral Expression Systems Life Technologies K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20
Gateway BP Clonase II Enzyme Mix Life Technologies 11789-020
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Life Technologies 11791-020
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) QIAGEN 69506 or 69504  
Gateway pDONR 201 Life Technologies 11798-014
293T cells American Type Culture Collection CRL-11268
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Life Technologies 25300-054
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995-065
Fetal Bovine Serum Sigma F4135
Tris brand not critical
EDTA brand not critical
200 Proof EtOH brand not critical
Isopropanol brand not critical
Sodium Acetate brand not critical
DpnI New England Biolabs R0176 supplied with buffer
DamID adaptors "AdRt" and "AdRb" Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation.
T4 DNA Ligase Roche Life Science 10481220001 supplied with buffer
DpnII New England Biolabs R0543 supplied with buffer
DamID PCR primer "AdR_PCR" Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 24
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set New England Biolabs N0446 100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP
Advantage 2  Polymerase Mix Clontech 639201 supplied with buffer
1Kb Plus DNA Ladder Life Technologies 10787018 1.0 µg/µl
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104 or 28106
MinElute PCR Purification Kit QIAGEN 28004 or 28006 for an elution volume of less than 30 µl
SPRI beads / Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63880 apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used
Buffer EB QIAGEN 19086
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348 supplied with buffer
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England Biolabs B0202
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment New England Biolabs M0210
T4 Polynuleotide Kinase New England Biolabs M0201
Klenow Fragment (3’ → 5’ exo-) New England Biolabs M0212 supplied with buffer
sequencing adaptors Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 28
Quick Ligation Kit New England Biolabs M2200 used in 3.4.3; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase
sequencing primer 1 and 2 Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 28
KAPA HiFi PCR Kit Kapa Biosystems KK2101 or KK2102 supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10 mM dNTP mix
agarose Sigma Aldrich A4679
ethidium bromide Sigma Aldrich E1510-10ML 10 mg/ml
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704 or 28706
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad Laboratories 1725121 or 1725122
Spectrophotometer brand not critical
0.45 μm PVDF Filter brand not critical
25 ml Seringe brand not critical
10 cm Tissue Culture Plates brand not critical
6-well Tissue Culture Plates brand not critical
S1000 Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories for qPCR
Vortex Mixer brand not critical
Dry Block Heater or Thermomixer brand not critical
Microcentrifuge brand not critical
Gel electrophoresis system with power supply brand not critical
Magnet stand for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical
UV transilluminator brand not critical
E-gel electrophoresis system Life Technologies G6400, G6500, G6512ST

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase. Nat Genet. 27, 304-308 (2001).
  2. van Steensel, B., Henikoff, S. Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase. Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).
  3. Fu, A. Q., Adryan, B. Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays. Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).
  4. Guelen, L. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions. Nature. 453, 948-951 (2008).
  5. Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm. Cell. 140, 360-371 (2010).
  6. Kubben, N. Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions. Chromosoma. 121, 447-464 (2012).
  7. Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe. Nucleus. 3, 77-87 (2012).
  8. Harr, J. C. Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins. J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).
  9. Gonzalez-Aguilera, C. Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 15, R21 (2014).
  10. Wu, F., Yao, J. Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping. BMC Genomics. 14, 591 (2013).
  11. Filion, G. J. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
  12. Vogel, M. J. Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes. Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).
  13. Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).
  14. Shimbo, T. MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes. PLoS Genet. 9, e1004028 (2013).
  15. Orian, A. Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network. Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).
  16. Artegiani, B. Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis. EMBO J. , (2014).
  17. Schuster, E. DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO. Mol Syst Biol. 6, 399 (2010).
  18. Bianchi-Frias, D. Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila. PLoS Biol. 2, e178 (2004).
  19. Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe. Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).
  20. Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development. Development. 138, 2761-2771 (2011).
  21. Germann, S., Gaudin, V. Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method. Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).
  22. Zhang, X. The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation. Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).
  23. Orian, A. Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression. Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).
  24. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).
  25. Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase. Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).
  26. de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals. Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).
  27. DamID mammalian vectors. , Available from: http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm (2015).
  28. Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/ (2015).
  29. Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/ (2015).
  30. Bernstein, B. E. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).
  31. Encode Project Consortium. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS Biol. 9, e1001046 (2011).
  32. Asp, P. Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).
  33. Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).
  34. Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics. Genome Biol. 15, 110 (2014).
  35. Navin, N. E. Cancer genomics: one cell at a time. Genome Biol. 15, 452 (2014).
  36. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).
  37. Nagano, T. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  38. Kind, J. Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions. Cell. 153, 178-192 (2013).
  39. Southall, T. D. Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells. Dev Cell. 26, 101-112 (2013).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 107، وتحديد الحمض النووي الأدينين ناقلة الميثيل (DamID)، DamID وما يليها، الجيل القادم التسلسل، وارتفاع الإنتاجية التسلسل، والتفاعلات-DNA البروتين، الصفيحة النووية
DamID وما يليها: رسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات البروتين DNA بواسطة إنتاجية عالية تسلسل شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, F., Olson, B. G., Yao, J.… More

Wu, F., Olson, B. G., Yao, J. DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments. J. Vis. Exp. (107), e53620, doi:10.3791/53620 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter