Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

DamID-seq: Genome-wide Kortlægning af protein-DNA interaktioner af High Throughput sekventering af adenin-methylerede DNA fragmenter

Published: January 27, 2016 doi: 10.3791/53620
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

Summary

Vi beskriver heri et assay ved kobling DNA methyltransferase adenin identifikation (DamID) til high throughput sekventering (DamID-seq). Denne forbedrede fremgangsmåde giver en højere opløsning og en større dynamikområde og muliggør analyse DamID-seq data i forbindelse med andre højt gennemløb sekventering data såsom chip-seq, RNA-seq, etc.

Introduction

DNA methyltransferase adenin identifikation (DamID) 1,2 er en metode til påvisning af protein-DNA-interaktioner in vivo og er en alternativ tilgang til kromatin immunofældning (chip) 3. Den benytter en relativt lav mængde af celler og kræver ikke kemisk tværbinding af protein med DNA eller et meget specifikt antistof. Sidstnævnte er særligt nyttigt, når målproteinet er løst eller indirekte er forbundet med DNA. DamID held har været anvendt til kortlægning af bindingssteder i en række proteiner, herunder nuklear kappeproteiner 4-10, chromatin-associerede proteiner 11-13, kromatin-modificerende enzymer 14, transkriptionsfaktorer og cofaktorer 15-18 og RNAi machineries 19. Metoden er anvendelig i flere organismer, herunder S. cerevisiae 13, S. pombe 7, C. elegans 9,17, D. melanogaster 5,11,18,20, A. thaliana 21,22 samt muse- og humane cellelinjer 6,8,10,23,24.

Udviklingen af DamID assay var baseret på den specifikke påvisning af adenin-methylerede DNA-fragmenter i eukaryote celler, som mangler endogene adenin methylering 2. Et udtrykt fusionsprotein, der består af DNA-bindende protein af interesse og E. coli-DNA adenin methyltransferase (Dam), kan methylere adeninbasen i GATC-sekvenser, som er i fysisk nærhed (mest markant inden for 1 kb og op til ca. 5 kb) til bindingsstederne af proteinet i genomet 2. De modificerede DNA-fragmenter kan amplificeres specifikt og hybridiseret til microarrays at detektere genomiske bindingssteder af proteinet af interesse 1,25,26. Denne originale DamID metode blev begrænset af tilgængeligheden af ​​mikroarrays og tætheden af ​​forudbestemte sonder. Vi har derfor integreret high throughput sekventeringtil DamID 10 og betegnes metoden som DamID-seq. Det store antal kort læser genereret fra DamID-seq muliggør nøjagtig lokalisering af protein-DNA-interaktioner genom-dækkende. Vi fandt, at DamID-seq forudsat en højere opløsning og et større dynamikområde end DamID af microarray til at studere genom-nukleare lamina (NL) foreninger 10. Denne forbedrede metode gør det muligt sondering NL foreninger inden for gen-strukturer 10 og letter sammenligninger med andre højt gennemløb sekventering data, såsom chip-seq og RNA-seq.

Den DamID-seq protokol beskrevet her blev oprindeligt udviklet til kortlægning genom-NL foreninger 10. Vi genererede et fusionsprotein ved tethering mus eller human Lamin B1 til E. coli DNA-adenin methyltransferase og testet protokollen i 3T3 muse embryonale fibroblaster, C2C12 musen myoblaster 10 og IMR90 humane føtale lungefibroblaster (data ikke offentliggjort). I denne protokol, starter vi med constructing vektorer og ekspression Dam-bundne fusionsproteiner ved lentiviral infektion i pattedyrceller 24. Dernæst beskriver vi de detaljerede protokoller fra forstærke adenin-methylerede DNA-fragmenter og forberede sekventering biblioteker, der skal være gældende i andre organismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generation og ekspression af fusionsproteiner og Gratis Dam Proteiner

  1. Klon protein af interesse i DamID vektoren.
    1. Amplificere cDNA af proteinet af interesse (POI) under anvendelse af det ønskede high fidelity DNA-polymerase og passende primere ifølge fabrikantens protokol. Eksperimentelt bestemme optimale amplificeringsbetingelser at sikre korrekt amplifikation af indsatse.
    2. Kør en agarosegel og oprense amplificeret cDNA IP ved gelekstraktionskittet ifølge fabrikantens protokol.
    3. Klon cDNA IP i pDONR201 vektor under anvendelse af BP Clonase II ifølge fabrikantens protokol.
    4. Klone cDNA'et af POI fra donoren vektoren i pLGW-RFC1-V5-EcoDam destinationsvektor eller pLGW-EcoDam-V5-RFC1 destinationsvektor 27 ved hjælp af LR Clonase II ifølge fabrikantens protokol, afhængigt af den ønskede retning fusionere POI til N-terminalen eller the C-terminalen af E. coli-DNA adenin methyltransferase (EcoDam) 27.
    5. Kontroller ved sekventering, at det klonede cDNA har en korrekt sekvens og former i ramme fusion til EcoDam.
  2. Generer lentivirale bestande.
    1. Generer lentivirale bestande udtrykker Dam-V5-POI og V5-Dam (fra pLGW-V5-EcoDam vektor 27) ved hjælp af lentivirale ekspressionssystemer. Brug den forreste transfektion Fremgangsmåde ifølge fabrikantens protokol.
      1. Brug 293T-celler og lipofektion til at generere lentivirale lagre ifølge fabrikantens protokol til transfektion.
      2. Medtag 0,45 um PVDF filter trin.
  3. Inficere celler med lentivirus.
    1. Dagen før infektion (dag 0), passerer adhærente celler dyrket i passende vækstmedium for denne celletype til en 6-brønds vævskulturplade anvendelse af den samme vækstmedium uden antibiotika tilopnå 50% konfluens på dagen for infektion. Place celler i en 37 ° C inkubator.
    2. På dagen for infektion (dag 1), fjern 2 kryohætteglas både Dam-V5-POI og V5-Dam lentivirale supernatanter fra en -80 ° C fryser og plads i et 37 ° C vandbad til at tø.
      1. Fjern vækstmedier fra celler og erstat med 0,5 ml frisk vækstmedium uden antibiotika.
      2. Tilsæt 1 ml af den optøede lentivirus til hver brønd (2 brønde med V5-Dam og 2 brønde med Dam-V5-POI). Der tilsættes 1 ml vækstmedium uden antibiotika til de resterende 2 brønde-dette vil tjene som en negativ kontrol. Ryst forsigtigt 6-brønds plade til at blande og sted tilbage i en 37 ° C inkubator O / N.
    3. Dagen efter infektion (dag 2), fjern virale suspensioner fra celler og erstatte med 2 ml vækstmedium uden antibiotika. Placer celler tilbage i en 37 ° C inkubator i 48 timer.
  4. Isoler gDNA.
    1. Aspirer medier fra hver brønd, og deTach celler under anvendelse af 250 pi 0,05% trypsin-EDTA. Der inkuberes ved 37 ° C i 2 minutter.
    2. Vask cellerne fra pladen med 1 ml vækstmedier og pipette celler fra hver brønd i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Pelletere cellerne ved centrifugering ved 200 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
    3. Vask pelleterede celler med 500 pi PBS og centrifugeres ved 200 xg i 2 min ved stuetemperatur.
    4. Resuspender pelleterede celler i 200 pi PBS.
    5. Isoler gDNA af blod og væv kit ifølge producentens protokol. Elute gDNA i 200 pi buffer AE og bestemme koncentrationen ved at måle OD 260 ved hjælp af et spektrofotometer.
      Bemærk: gDNA fra ikke-inficerede eller mock-inficerede celler kan isoleres som negative kontroller. Udfældes gDNA til højere koncentrationer for langtidsopbevaring.
      1. Tilsæt 3 volumener 100% ethanol og 0,1 volumen 3 M natriumacetat (pH 5,5), og bland ved at vende rørene 4-6 gange.
      2. Opbevares ved -20 ° CO / N.
      3. Centrifuge ved 16.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
      4. Fjern forsigtigt supernatanten. Vask pellets med 70% (volumen / volumen) ethanol og centrifugeres ved 16.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
      5. Fjern forsigtigt ethanol og tillade pellets at lufttørre i 3 minutter ved stuetemperatur.
      6. Opløs gDNA i T 10 E 0,1 (pH 7,5) til ca. 1 pg / pl. Pool gDNA fra hver eksperimentel prøve eller den negative kontrol og måle koncentrationen. Opbevar ved -20 ° C.

2. Forstærk Adenin-methylerede DNA fragmenter

  1. Digest gDNA med Dpnl, som kun skærer adenin-methylerede GATCs.
    1. Opsætning af en reaktion på is med 2,5 ug gDNA, 1 pi 10x buffer, 0,5 pi Dpnl (20 U / pl) og fyld med H2O til et samlet volumen på 10 pi. For hver prøve gDNA, forberede tre reaktioner - en uden Dpnl ("no Dpnl", erstatter Dpnl med 0,5 pi H2O) og to wed Dpnl ("med Dpnl").
    2. Digest O / N ved 37 ° C og inaktivering Dpnl ved 80 ° C i 20 minutter.
  2. Ligere DamID adaptere.
    1. Forbered DamID adaptere.
      1. Resuspender hver af de to DamID adapter oligoer 24 i H2O til en slutkoncentration på 100 uM.
      2. Kombiner lige store volumener af de to DamID adapter oligoer, mix og placere i en tæt lukket rør. Forsegl rør med Parafilm, sidde i et rack og sted i et bæger fyldt med vand ved 90 ° C. Holde vandet niveau under hætten af ​​røret (for at undgå at der trænger vand ind i røret), men over overfladen af ​​oligo mix.
      3. Lad vandet afkøle til stuetemperatur, så adapterne annealer langsomt.
      4. Alikvot de annealede adaptere (50 um) og opbevares ved -20 ° C.
    2. Opsæt en reaktion på is. I hvert rør fra 2.1.2, tilsættes 6,2 pi H2O, 2 pi 10x ligeringsbuffer, 0,8 pi 50 pM DamID adaptors (optøede på is) og 1 pi T4 DNA-ligase (5 U / pl). Det samlede volumen er 20 pi. I en af de to "med Dpnl" rør, erstatte ligase med 1 pi H2O ("ingen ligase") Bemærk, at hver gDNA prøve har to negative kontroller -. "Ingen Dpnl" og "ingen ligase".
    3. Ligere O / N ved 16 ° C og inaktivere ligase ved 65 ° C i 10 minutter.
  3. Digest DNA med DpnII at ødelægge fragmenter, der indeholder ikke-methylerede GATCs.
    1. Opsæt en reaktion på is. I hvert rør fra 2.2.3, tilsættes 24 pi H2O, 5 pi 10x DpnII puffer og 1 pi DpnII (10 U / pl). Det samlede volumen er 50 pi.
    2. Digest ved 37 ° C i 2-3 timer og inaktivere DpnII ved 65 ° C i 20 minutter.
  4. Forstærke adenin-methylerede DNA-fragmenter.
    1. Opsæt en reaktion på is med 5 pi DpnII fordøje fra 2.3.2, 5 μl 10x PCR-buffer, 12,5 pi 5 uM DamID PCR-primer 24, 4 pi 10 mM dNTP mix, 1 pi 50x polymerase mix og 22,5 pi H 2 O. Det samlede volumen er 50 pi.
    2. Kør PCR som følger: 68 ° C i 10 minutter; 94 ° C i 1 min, 65 ° C i 5 minutter, 68 ° C i 15 minutter; 4 cyklusser af 94 ° C i 1 min, 65 ° C i 1 min, 68 ° C i 10 minutter; 17 cykler ved 94 ° C i 1 min, 65 ° C i 1 min, 68 ° C i 2 min.
    3. Analyser 5 pi PCR-produkter fra hver reaktion på en 1% agarosegel. PCR-produkter skal fremstå som et smear intervallet 0,2-2 kb (figur 2). De "ingen Dpnl" og "ingen ligase" kontrol bør ikke have nogen eller tydeligt mindre forstærkning.
    4. Hvis resultatet fra trin 2.4.3 er tilfredsstillende, gentages trin 2.4.1-2.4.3 med to eller tre reaktioner for den eksperimentelle prøve og en omsætning for hver af de to negative kontroller.
    5. Pool og oprense PCR-produkter fra sammeeksperimentel prøve under anvendelse af PCR oprensningskit eller fastfase Vendbar Immobilisering (SPRI) perler ifølge producentens protokol. Må ikke rense "ingen Dpnl" eller "Nej ligase" kontroller. Eluering DNA med buffer EB.
    6. Måle koncentrationen af det oprensede DNA ved at måle OD260 under anvendelse af et spektrofotometer, der bør være omkring 0,1 pg / pl eller højere. Indsamle mindst 10 ug DNA for hver prøve. Hvis anvendelse af PCR oprensningskit, rense hver PCR-produkter 50 pi med en kolonne, eluering i 30 pi buffer EB og pool eluaterne.
  5. Digest DNA med DpnII at forhindre DamID PCR-primere fra at blive sekventeret.
    1. Opsæt en reaktion på is med 5 ug oprenset DNA fra 2.4.6, 5 pi 10x DpnII buffer, 1 pi DpnII (10 U / ul) og fyld med H2O til et samlet volumen på 50 pl. Forbered to eller tre reaktioner for hver prøve.
    2. Fordøje ved 37 ° C i 2-3 timerog inaktivere DpnII ved 65 ° C i 20 minutter.
    3. Pool og oprense fordøjelsesvæskerne fra den samme prøve med PCR oprensningskit eller SPRI perler ifølge producentens protokol. Eluering DNA med buffer EB.
    4. Måle koncentrationen af ​​det oprensede DNA, som bør være omkring 0,06 pg / pl eller højere. Indsamle mindst 6 ug DNA for hver prøve. Hvis du bruger PCR rensning kits, rense hver 50 pi fordøje med en kolonne, elueres i 30 pi buffer EB og samle eluaterne.

3. Bibliotek Forberedelse til High-throughput sekventering

  1. Fragment DNA
    1. Eksperimentelt bestemme den passende fordøjelse tid for hvert nyt parti af dsDNA Fragmentase. Som enzymaktiviteten kan falde over tid, gentag testen, før du udfører et nyt eksperiment. For at spare DNA fra 2.5.4 for selve fragmentering, brug rensede methyl PCR-produkter fra 2.4.6 eller ekstra DNA fra tidligere experimeNTS på dette trin.
      1. Opsæt en master mix med 6 ug DNA, 12 pi 10x Fragmentase buffer og fyld med H2O til et samlet volumen på 114 pi.
      2. Vortex Fragmentase lager hætteglasset i 3 sek, tilsættes 6 ul i master-mix og vortex master mix for 3 sek. Det samlede volumen er 120 pi.
      3. Portion 20 ul af master mix til hver af 5 nye rør. Inkuber alle 6 rør ved 37 ° C i 5 til 55 minutter ved en stigning på 10 min. Tilsæt 5 pi 0,5 M EDTA for at standse reaktionen.
      4. Analyser 12,5 pi fordøje (0,5 ug DNA) af hver reaktion, samt 0,5 ug ufordøjet DNA på en agarosegel (figur 3). Bestem den minimale tid (T 0.2kb) er nødvendig for at fordøje størstedelen af smear til omkring 0,2 kb. Vælg 6 time varigheder mellem 5 min og T 0.2kb (herunder 5 min og T 0.2kb) med lige intervaller for den aktuelle fragmentering.
    2. Oprette den faktiske fragmenteringførelsen som beskrevet i 3.1.1.1-3.1.1.3. Inkuber reaktioner ved 37 ° C for den tid varigheder bestemt i 3.1.1.4.
    3. Pool 6 reaktioner og oprense fordøjelser med PCR oprensningskit eller SPRI perler ifølge producentens protokol. Eluere DNA i 51 pi buffer EB. Den endelige eluat er ~ 50 pi.
  2. Reparation ender af fragmenteret DNA
    1. Opsætning af en reaktion på is med eluatet fra 3.1.3, 25 pi H2O, 10 pi 10x T4 DNA ligase buffer med 10 mM ATP, 4 pi 10 mM dNTP-blanding, 5 pi T4 DNA polymerase (3 U / pl) , 1 pi Klenow DNA-polymerase (5 U / pl) og 5 pi T4-polynukleotidkinase. Det samlede volumen er 100 pi. Bland godt med pipette. Undgå skum og bobler.
    2. Der inkuberes ved 20 ° C i 30 minutter.
    3. Oprense DNA med PCR oprensningskit eller SPRI perler ifølge producentens protokol. Eluere DNA i 33 pi buffer EB. Den endelige eluat er ~ 32 & #181 l.
  3. Tilføj "A" udhæng
    1. Opsæt en reaktion på is med eluatet fra 3.2.3, 5 pi 10x Klenow buffer, 10 pi 1 mM dNTP og 3 pi Klenow (3 '→ 5'exo) (5 U / ul). Det samlede volumen er 50 pi. Bland godt med pipette. Undgå skum og bobler.
    2. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
    3. Oprense DNA med PCR oprensningskit eller SPRI perler ifølge producentens protokol. Eluere DNA i 22 pi buffer EB. Den endelige eluat er ~ 21 pi.
  4. Afsnøre sekventering adaptere
    1. Forbered sekventering adaptere 28.
      1. Resuspender hver adapter oligo til en koncentration på 100 uM i 10 mM Tris-CI (pH 7,8), 0,1 mM EDTA (pH 8,0) og 50 mM NaCl.
      2. Bland lige store mængder af den universelle adapter 28 og en indekseret adapter 28.
      3. Anneale adapterne i en termisk cycler med følgendeprogram: 95 ° C i 2 minutter; 140 cykler for 30 sek begyndende ved 95 ° C og faldt med 0,5 ° C hver cyklus; hold ved 4 ° C.
      4. Alikvote adaptere og opbevares ved -20 ° C.
    2. Opsæt en reaktion på is med eluatet fra 3.3.3, 25 pi 2x ligeringsbuffer, 1,5 pi 50 pM udglødet sekventering adaptere (optøet på is) fra 3.4.1.4 og 2,5 pi T4 DNA ligase. Bland godt med pipette. Undgå skum og bobler. Hvis der ønskes multiplex sekventering, bruge en anden indekseret adapter til hver prøve.
    3. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
    4. Oprense DNA med PCR oprensningskit eller SPRI perler ifølge producentens protokol. Eluere DNA i 24 pi buffer EB. Den endelige eluat er ~ 23 pi.
  5. Konverter Y-formede adaptere til dsDNA at muliggøre nøjagtig bestemmelse DNA fragmentstørrelser 28
    1. Opsæt en reaktion på is med eluatet fra 3.4.4, 12,5 pi H2O, 1 pi 25 pM primer 1 28, 1 pi 25 pM primer 2 28, 1,5 pi 10 mM dNTP, 10 pi 5x PCR-buffer og 1 pi DNA-polymerase (1 U / pl).
    2. Kør PCR som følger: 95 ° C i 3 minutter; 5 cyklusser af 98 ° C i 15 sek, 63 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sek; 72 ° C i 1 min; 4 ° C på hold.
    3. Oprense DNA med PCR oprensningskit eller SPRI perler ifølge producentens protokol. Eluere DNA i 11 pi buffer EB. Den endelige eluat er ~ 10 pi.
  6. Størrelse Vælg biblioteket
    1. En 2% agarosegel med 1x TAE buffer. Tilføj ethidiumbromid (ADVARSEL!) Til en slutkoncentration på 500 ng / ml, når den smeltede TAE-agarose opløsningen er afkølet for at undgå indånding af ethidiumbromid. Sørg for at have nok baner for alle de prøver, DNA stigen og tomme baner.
    2. Tilføj 8pi 6x loading dye til eluatet fra 3.5.3.
      3. <li> Forbered DNA-stige ved at blande 1 kb DNA-stige plus (1,0 ug / ul), 6x loading dye og H2O i forholdet 1: 1: 4.
    3. Load 6 pi DNA-stige, prøverne fra 3.6.2 og anden 6 pi DNA-stige, hver i en separat bane, og med mindst én tomme lane fra de tilstødende prøver / stiger.
    4. Kør gel ved 120 V i 60 minutter.
    5. Se gelen på en UV-transilluminator (minimere eksponeringen tid til UV). Bær sikkerhedsbriller og ansigtsværn. Sørg mindst en af ​​DNA stiger køre godt med passende afstand (nok til at udskære 3 gelskiver) mellem 300 bp og 400 bp bånd. Smal afstand øger vanskelighederne ved udtagelse af flere gelskiver, mens bred afstand øger mængden af ​​udskårne gelskiver.
    6. Brug en ny skalpel eller et barberblad for hver bane. Excise tre tynde skiver gel mellem 300 og 400 bp fra hver bane (figur 4) og placere dem på hver et mikrocentrifugerør. Hold lydstyrken på hver gel slus så lavt som muligt (<100 pi).
    7. Mål mængden af ​​hver gel slice (1 pi gel vejer ca. 1 mg), der tilsættes 6x volumener QG puffer og inkuberes ved 50 ° C.
    8. Vortexes QG-gel-blanding hver 2-3 min, indtil gelen skive er fuldstændig opløst. Tilføj 2x gelvolumener isopropanol og blandes.
    9. Fra dette trin, skal du følge protokollen fra gel udvinding kits. Eluere DNA i 51 pi buffer EB. Den endelige eluat er ~ 50 pi.
  7. Berige sekventering adapter modificeret DNA-fragmenter
    1. Optimere antallet af PCR-cyklusser 29.
      1. Opsæt en reaktion på is med 1 pi eluat fra 3.6.10, 1 pi 25 pM primer 1 28, 1 pi 25 pM primer 2 28, 7 pi H2O og 10 pi SYBR Green Supermix. Det samlede volumen er 20 pi.
      2. Kør qPCR som følger: 95 ° C i 3 minutter; 20 cykler af 95 ° C i 30 sek, 63 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sek, aflæses pladen.
      3. Analysere data ved hjælp af en qPCR analyse software og bestemme Kvantificering Cycle (Cq) eller tærskelcyklus (Ct) for hver prøve under anvendelse af producentens protokol. Fortsæt med prøverne, der har Cq / Ct ≤ 14. Brug den maksimale Cq (CQ 0) minus 1 (afrundet op til det næste højere tal) som den endelige PCR-cyklus nummer (N PCR).
      4. Juster mængder skabelon-DNA, således at forskellige prøver vil blive forstærket til ca. lige store mængder efter at have kørt det samme antal PCR-cykler. Brug 8 pi skabelon til prøven med den højeste Cq (Cq 0), og beregne skabelonen volumen af andre prøver med følgende formel:
        Vol i = 8 x 1,8 Cq jeg -Cq 0
    2. Opsæt PCR-reaktioner på is med de beregnede fra 3.7.1.4 skabelon bind: 1 pi 25 pM primer 1 28, 1 pi 25 pM primer 2 28, 1,5pi 10 mM dNTP, 10 pi 5x puffer, 1 pi DNA-polymerase (1 U / pl) og fyld med H2O til et samlet volumen på 50 pi.
    3. Kør PCR som følger: 95 ° C i 45 sek; N PCR-cykler (bestemt i 3.7.1.3) af 98 ° C i 15 sek, 63 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sek; 72 ° C i 1 min; 4 ° C på hold.
    4. Analyser 5 pi PCR-produkter i en 2% agarosegel (figur 5A). En klar "single" båndet angiver, at de amplificerede DNA-fragmenter inden for et snævert interval og længde, at DNA-biblioteket kan være genstand for yderligere analyse.
    5. Gentag en reaktion for udvalgte prøver og samle de amplificerede DNA-biblioteker fra den samme prøve.
    6. Oprense udvalgte DNA-biblioteker til sekventering.
      1. Hvis primer / adaptordimerer er ikke synlige i 3.7.4, oprense DNA-biblioteker med PCR-oprensningskit eller SPRI perler ifølge producentens protokol. Eluere DNA i 21 pi buffer EB. Desluteluatet er ~ 20 pi. Hvis brugerens sekventeringsfaciliteten har konkrete anvisninger på elueringspufferen, slutvolumenet osv fremstille prøver i overensstemmelse hermed.
      2. Hvis primer / adapter dimerer er klart synlige i 3.7.4, rense biblioteker som følger.
        1. Load DNA fra 3.7.5 og DNA Ladder i en 2% præfabrikeret agarosegel. Prøverne kan renses som beskrevet i 3.7.6.1 for at reducere lydstyrken eller kan indlæses i flere brønde. Placer agarosegel i en passende strømsystem. Lad gelen at køre i 15 min.
        2. Ved hjælp af en passende transilluminator, skåret ud det ønskede bånd med en ren skalpel / barbermaskine for hver prøve og placere gelskiven i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
        3. Isoler DNA under anvendelse af Gel Extraction kit ifølge producentens protokol med to ændringer: inkuber buffer QG-gel blandingen i en termo-blander ved 37 ° C og 1000 rpm i 30 min, og tilsæt 2x gelvolumener isopropanol.
  8. Indsend oprensede DNA-biblioteker til en sekventering facilitet. Følg alle retningslinjer facility.
    Bemærk: En analyse kvalitet ved en Bioanalyzer (figur 5B) bør udføres før sekvensering for at bestemme den nøjagtige størrelse rækkevidde og koncentrationen af et DNA-bibliotek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dam-V5-LmnB1 fusionsproteinet blev verificeret at være co-lokaliseret med det endogene Lamin B protein ved immunfluorescensfarvning (figur 1).

Den vellykkede PCR-amplifikation af adenin-methylerede DNA-fragmenter er et vigtigt skridt for DamID-seq. De eksperimentelle prøver bør forstærke en udstrygning af 0,2 - 2 kb mens negative kontroller (uden Dpnl uden ligase eller uden PCR-skabelon) bør resultere i ingen eller klart mindre forstærkning (figur 2).

De methylerede DNA-fragmenter ligger i intervallet fra 0,2 til 2 kb, medens det ønskede insert-størrelse for en NGS biblioteket er fra 200 til 300 bp. Derfor er det vigtigt at fragmentere methyl PCR-produkterne ind i passende størrelse. Ikke desto mindre blev det konstateret, at være upraktisk at samtidig bryde større DNA-fragmenter ned til passende størrelses og holde de fleste mindre DNA-fragmenter intakte i en enkelt fragmentering varighed. Derfor blev tidsforløbet eksperimenter udført for at bestemme den minimale tid (T 0.2kb) er nødvendig for at fragment 1 ug DNA til et smear centreret ved 200 bp (figur 3). Så 6 tid varigheder i lige store intervaller blev udvalgt mellem 5 min og T 0.2kb for den faktiske fragmentering. Den enzymatiske aktivitet af dobbeltstrenget DNA Fragmentase kan variere fra parti til parti, og kan falde med tiden, så det anbefales at gentage dette trin for et nyt parti af Fragmentase eller efter opbevaring i en periode.

Den ønskede insert størrelse er mellem 200 og 300 bp svarende til DNA-fragmenter mellem 300 og 400 bp (herunder 121 bp sekventering adaptere) på agarosegel. Tre tynde skiver inden for dette område blev udskåret fra hver forsøgsgruppe prøve at indsnævre størrelsesområdet et bibliotek og øge muligheden forfor at opnå mindst en kvalificeret sekventering bibliotek (figur 4).

En portion på 5 pi af hver amplificeret DNA-bibliotek blev analyseret på agarosegel for at bestemme, hvilke biblioteket kan kvalificere sig til sekventering. Som vist i figur 5A, en klar enkelt bånd af samme størrelse som den udskårne gel slice være synlig på agarosegel (trin 3.7.4). Dernæst blev udvalgt biblioteker undersøgt af en Bioanalyzer (figur 5B) at fastslå den nøjagtige størrelse rækkevidde og koncentrationer før sekventering. Hvis det ønskes, kan amplificerede DNA-biblioteker direkte undersøgt af en Bioanalyzer uden gelanalyse. Når flere biblioteker er af god kvalitet, anbefales det at sekventere biblioteker af lignende størrelse intervaller for et par eksperimentelle (celler, der udtrykker Dam-V5-POI) og kontrol (celler der udtrykker V5-Dam) prøver.

Den korte læser genereres afsekventeringssystemer blev først kortlagt tilbage til den tilsvarende genom. Entydigt tilpasset læser blev derefter overført til efterfølgende analyser. En rørledning til at behandle korte læser, konstruere en genom-NL interaktion kort og analysere gen-NL sammenslutninger beskrevet i detaljer i vores tidligere arbejde 10. Repræsentative resultater er vist i figur 6.

Figur 1
Figur 1. Validering inde i kernen lokaliseringer af fusionsproteiner ved hjælp af immunfluorescens-farvning. IMR90 humane lunge fibroblastceller blev transient transficeret med et plasmid, der udtrykker Dam-V5-LmnB1 og blev farvet med anti-Lamin B (A, rød) og anti-V5 (B, grøn). (C) Flet af billeder i A og B. Klik her for at se en større version af thans figur.

Figur 2
Figur 2. PCR amplifikation adenin-methylerede DNA-fragmenter. En portion på 5 pi fra hver PCR-reaktion blev analyseret på en 1% agarosegel. En smøre spænder 0,2-2 kb blev amplificeret fra hver eksperimentel prøve, men ingen forstærkning blev observeret i negative kontroller (ingen Dpnl i trin 2.1, ingen Ligase i trin 2.2, eller ingen PCR skabelon). Til Klik her se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Fastlæggelse optimale fragmentering varigheder. Rensede methyl PCR-produkter var underlagt fragmentering for tid varigheder 5-55 min ved en tilvækst på 10 min (ufordøjet DNA , Mærket som "0 min"). 1 ug DNA stigen og 0,5 ug af hver fragmenteret DNA-prøve blev analyseret på en agarosegel. Den minimale tid til at fordøje størstedelen af DNA smear til omkring 200 bp blev bestemt til at være omkring 35 min, således seks jævnt fordelte tidsvarigheder mellem 5 og 35 min (5 og 35 min inkluderet) blev udvalgt til at udføre den egentlige fragmentering. Zoom klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Valg af det DNA-biblioteker. DNA-prøver fra Dam-V5-LmnB1 og V5-Dam fra trin 3.6 blev kørt på en 2% agarosegel, og tre lige store gelskiver (L, M og H svarende til lav, medium og høj i størrelse) blev skåret mellem 300 og 400 bp som det fremgår af gule linjer. about / filer / ftp_upload / 53620 / 53620fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Amplified DNA-biblioteker for high throughput sekventering. (A) Amplified DNA-biblioteker blev analyseret på en agarosegel. PCR-skabeloner blev oprenset fra gel skiver vist på figur 4. (B) Bioanalyzer resultaterne af V5-Dam (L) prøve og Dam-V5-LmnB1 (L) prøve, som blev understreget i (A). Disse to biblioteker havde lignende smalle størrelse intervaller og dermed kvalificeret sig til high throughput sekventering. Klik her for at se en større version af dette tal.

jpg "/>
Figur 6. NGS data, der vises i UCSC genom browser. Musekromosom 1 er vist som et eksempel. Sekvensdata blev produceret fra muse C2C12 myoblaster 10. Spor "MB.LmnB1.w2k" og "MB.Dam.w2k", svarende til data fra celler, der udtrykker Dam-V5-LmnB1 og V5-Dam henholdsvis plot normaliseret læse tætheder (læser pr kilobaser per million entydigt kortlagt læser eller RPKM ) i ikke-overlappende sammenhængende 2 kb vinduer langs kromosomet. Tracket "MB.log2FC.w2k" plots genom-NL foreninger, dvs. log2 RPKM forhold mellem LmnB1 end Dam, ved 2 kb opløsning. Spor "MB.sLADs" maler sekventering-baserede Lamina Associated Domæner (slads, dvs. genomiske regioner, der har højere læste tætheder af LmnB1 løbet Dam med statistisk signifikans) i Sort, ikke-slads i grå og ubestemte regioner i hvidt. Klik her for at download denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ViraPower Lentiviral Expression Systems Life Technologies K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20
Gateway BP Clonase II Enzyme Mix Life Technologies 11789-020
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Life Technologies 11791-020
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) QIAGEN 69506 or 69504  
Gateway pDONR 201 Life Technologies 11798-014
293T cells American Type Culture Collection CRL-11268
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Life Technologies 25300-054
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995-065
Fetal Bovine Serum Sigma F4135
Tris brand not critical
EDTA brand not critical
200 Proof EtOH brand not critical
Isopropanol brand not critical
Sodium Acetate brand not critical
DpnI New England Biolabs R0176 supplied with buffer
DamID adaptors "AdRt" and "AdRb" Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation.
T4 DNA Ligase Roche Life Science 10481220001 supplied with buffer
DpnII New England Biolabs R0543 supplied with buffer
DamID PCR primer "AdR_PCR" Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 24
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set New England Biolabs N0446 100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP
Advantage 2  Polymerase Mix Clontech 639201 supplied with buffer
1Kb Plus DNA Ladder Life Technologies 10787018 1.0 µg/µl
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104 or 28106
MinElute PCR Purification Kit QIAGEN 28004 or 28006 for an elution volume of less than 30 µl
SPRI beads / Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63880 apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used
Buffer EB QIAGEN 19086
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348 supplied with buffer
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England Biolabs B0202
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment New England Biolabs M0210
T4 Polynuleotide Kinase New England Biolabs M0201
Klenow Fragment (3’ → 5’ exo-) New England Biolabs M0212 supplied with buffer
sequencing adaptors Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 28
Quick Ligation Kit New England Biolabs M2200 used in 3.4.3; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase
sequencing primer 1 and 2 Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 28
KAPA HiFi PCR Kit Kapa Biosystems KK2101 or KK2102 supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10 mM dNTP mix
agarose Sigma Aldrich A4679
ethidium bromide Sigma Aldrich E1510-10ML 10 mg/ml
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704 or 28706
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad Laboratories 1725121 or 1725122
Spectrophotometer brand not critical
0.45 μm PVDF Filter brand not critical
25 ml Seringe brand not critical
10 cm Tissue Culture Plates brand not critical
6-well Tissue Culture Plates brand not critical
S1000 Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories for qPCR
Vortex Mixer brand not critical
Dry Block Heater or Thermomixer brand not critical
Microcentrifuge brand not critical
Gel electrophoresis system with power supply brand not critical
Magnet stand for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical
UV transilluminator brand not critical
E-gel electrophoresis system Life Technologies G6400, G6500, G6512ST

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase. Nat Genet. 27, 304-308 (2001).
  2. van Steensel, B., Henikoff, S. Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase. Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).
  3. Fu, A. Q., Adryan, B. Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays. Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).
  4. Guelen, L. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions. Nature. 453, 948-951 (2008).
  5. Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm. Cell. 140, 360-371 (2010).
  6. Kubben, N. Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions. Chromosoma. 121, 447-464 (2012).
  7. Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe. Nucleus. 3, 77-87 (2012).
  8. Harr, J. C. Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins. J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).
  9. Gonzalez-Aguilera, C. Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 15, R21 (2014).
  10. Wu, F., Yao, J. Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping. BMC Genomics. 14, 591 (2013).
  11. Filion, G. J. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
  12. Vogel, M. J. Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes. Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).
  13. Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).
  14. Shimbo, T. MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes. PLoS Genet. 9, e1004028 (2013).
  15. Orian, A. Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network. Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).
  16. Artegiani, B. Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis. EMBO J. , (2014).
  17. Schuster, E. DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO. Mol Syst Biol. 6, 399 (2010).
  18. Bianchi-Frias, D. Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila. PLoS Biol. 2, e178 (2004).
  19. Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe. Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).
  20. Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development. Development. 138, 2761-2771 (2011).
  21. Germann, S., Gaudin, V. Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method. Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).
  22. Zhang, X. The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation. Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).
  23. Orian, A. Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression. Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).
  24. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).
  25. Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase. Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).
  26. de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals. Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).
  27. DamID mammalian vectors. , Available from: http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm (2015).
  28. Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/ (2015).
  29. Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/ (2015).
  30. Bernstein, B. E. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).
  31. Encode Project Consortium. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS Biol. 9, e1001046 (2011).
  32. Asp, P. Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).
  33. Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).
  34. Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics. Genome Biol. 15, 110 (2014).
  35. Navin, N. E. Cancer genomics: one cell at a time. Genome Biol. 15, 452 (2014).
  36. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).
  37. Nagano, T. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  38. Kind, J. Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions. Cell. 153, 178-192 (2013).
  39. Southall, T. D. Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells. Dev Cell. 26, 101-112 (2013).

Tags

Molekylær Biologi DNA-adenin methyltransferase identifikation (DamID) DamID-seq næste generation sekventering high throughput sekventering protein-DNA interaktioner nuklear lamina
DamID-seq: Genome-wide Kortlægning af protein-DNA interaktioner af High Throughput sekventering af adenin-methylerede DNA fragmenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, F., Olson, B. G., Yao, J.… More

Wu, F., Olson, B. G., Yao, J. DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments. J. Vis. Exp. (107), e53620, doi:10.3791/53620 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter