Summary
We beschrijven hierin een test door het koppelen van DNA adenine methyltransferase identificatie (damid) tot high throughput sequencing (damid-volgende). Deze verbeterde werkwijze een hogere resolutie en een groter dynamisch bereik en maakt analyse damid-seq data in combinatie met andere high throughput sequentiebepaling gegevens zoals ChIP-seq, RNA-seq, etc.
Introduction
Identificatie van DNA adenine methyltransferase (damid) 1,2 is een methode om eiwit-DNA interacties in vivo detecteren en een alternatieve benadering chromatine immunoprecipitatie (ChIP) 3. Het maakt gebruik van een relatief lage hoeveelheid cellen en geen chemische cross-linking van eiwitten met DNA of een zeer specifiek antilichaam vereist. Dit laatste is vooral nuttig wanneer het doeleiwit los of indirect geassocieerd met DNA. Damid is met succes gebruikt om de bindingsplaatsen van verschillende eiwitten waaronder nucleaire envelopeiwitten 4-10, chromatine-geassocieerde eiwitten 11-13, 14 chromatine modificerende enzymen, transcriptiefactoren en cofactoren 15-18 en RNAi machines 19 in kaart. De werkwijze is in verschillende organismen, waaronder S. toepassing 13 cerevisiae, S. pombe 7, C. elegans 9,17, D. melanogaster 5,11,18,20, A. thaliana 21,22 evenals muis en menselijke cellijnen 6,8,10,23,24.
De ontwikkeling van de damid assay was gebaseerd op de specifieke detectie van adenine gemethyleerd DNA-fragmenten in eukaryote cellen die endogeen adenine methylering 2 ontberen. Een tot expressie gebracht fusie-eiwit, bestaande uit het DNA-bindende eiwit van belang en E. coli DNA adenine methyltransferase (Dam), kan de adenine base in GATC sequenties die in ruimtelijke nabijheid (belangrijkst binnen 1 kb en tot ongeveer 5 kb) aan de bindingsplaatsen van het eiwit in het genoom 2 methyleren. De gemodificeerde DNA-fragmenten kunnen specifiek worden geamplificeerd en gehybridiseerd met microarrays de genomische bindingsplaatsen van het eiwit van interesse 1,25,26 detecteren. Deze originele damid methode is beperkt door de beschikbaarheid van microarrays en de dichtheid van voorafbepaalde probes. We hebben daarom geïntegreerde high throughput sequencing indamid tot 10 aangeduid en de werkwijze damid-seq. Het grote aantal korte leest gegenereerd uit damid-seq maakt een nauwkeurige lokalisatie van eiwit-DNA interacties genoom-brede. We vonden dat damid-seq leverde een hogere resolutie en een groter dynamisch bereik dan damid door microarray voor het bestuderen van genoom-nucleaire lamina (NL) 10 verenigingen. Deze verbeterde werkwijze maakt sonderen NL associaties binnen genstructuren 10 en vergemakkelijkt vergelijkingen met andere high throughput sequencing data, zoals ChIP-seq en RNA-seq.
De damid-seq protocol hier beschreven is in eerste instantie ontwikkeld voor het in kaart brengen van het genoom-NL verenigingen 10. We genereerden een fusie-eiwit aangebonden muis of mens Lamine B1 E. coli DNA adenine methyltransferase en getest het protocol in 3T3 muis embryonale fibroblasten, C2C12 muis myoblasten 10 en IMR90 humane foetale long fibroblasten (gegevens niet gepubliceerd). In dit protocol, beginnen we met constructing vectoren en expressie tethered Dam-fusie-eiwitten door lentivirale infectie in zoogdiercellen 24. Vervolgens beschrijven we de gedetailleerde protocols amplificeren-adenine gemethyleerd DNA fragmenten en bereiden sequencing bibliotheken die in andere organismen toepassing moet zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie en expressie van fusie-eiwitten en Vrije Dam Eiwitten
- Kloon eiwit van belang in de damid vector.
- Amplify cDNA eiwit plaats (POI) met de gewenste high fidelity DNA polymerase en geschikte primers volgens het protocol van de fabrikant. Experimenteel bepalen optimale amplificatie omstandigheden kan amplificatie inzetstukken waarborgen.
- Uitvoeren van een agarose gel en zuiveren geamplificeerde cDNA van NP op de gel extractie kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Clone cDNA van NP in de pDONR201-vector met behulp BP Clonase II volgens het protocol van de fabrikant.
- Kloon het cDNA van NP van de donor vector in de bestemming pLGW-RFC1-V5-EcoDam vector of de bestemming pLGW-EcoDam-V5-RFC1 vector 27 met behulp van LR Clonase II volgens protocol van de fabrikant, afhankelijk van de gewenste richting van het fuseren van POI de N-terminus of the C-terminus van de E. coli DNA adenine methyltransferase (EcoDam) 27.
- Controleer door sequentiebepaling dat het gekloneerde cDNA een juiste volgorde en vormen in-frame fusie te EcoDam.
- Genereren lentiviraal voorraden.
- Genereren lentiviraal voorraden uiten Dam-V5-NP en V5-Dam (van de pLGW-V5-EcoDam vector 27) met behulp van lentivirale expressie systemen. Met de voorwaartse transfectie procedure volgens het protocol van de fabrikant.
- Gebruik 293T cellen en lipofectie om lentivirale bestanden te genereren volgens het protocol van de fabrikant voor transfectie.
- Onder de 0,45 pm PVDF filter stap.
- Genereren lentiviraal voorraden uiten Dam-V5-NP en V5-Dam (van de pLGW-V5-EcoDam vector 27) met behulp van lentivirale expressie systemen. Met de voorwaartse transfectie procedure volgens het protocol van de fabrikant.
- Cellen infecteren met lentivirus.
- De dag voor infectie (dag 0), passeren hechtende cellen gekweekt in geschikte kweekmedia voor dit celtype een 6-well weefselkweek plaat met dezelfde groeimedia zonder antibioticabereikt 50% confluentie op de dag van de infectie. Plaats cellen in een 37 ° C incubator.
- Op de dag van infectie (dag 1), verwijder 2 cryovials van zowel de Dam-V5-NP en V5-Dam lentivirale supernatanten van een -80 ° C vriezer en plaats in een 37 ° C waterbad te ontdooien.
- Verwijder kweekmedium uit cellen en vervangen door 0,5 ml vers kweekmedium zonder antibiotica.
- Voeg 1 ml van de ontdooide lentivirus aan elk putje (2 waterputten met V5-Dam en 2 waterputten met Dam-V5-NP). Voeg 1 ml groeimedium zonder antibiotica om de resterende 2-wells deze zal dienen als een negatieve controle. Schud de 6-well plaat mengen en opnieuw in een 37 ° C incubator O / N.
- De dag na infectie (dag 2), verwijderen virale schorsingen van cellen en te vervangen door 2 ml groeimedium zonder antibiotica. Plaats cellen opnieuw in een 37 ° C incubator gedurende 48 uur.
- Isoleren gDNA.
- Zuig media uit elk putje en detach cellen gebruiken 250 pi 0,05% trypsine-EDTA. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 min.
- Was de cellen van de plaat met 1 ml kweekmedium en pipetteer cellen uit elk putje in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Pellet cellen door centrifugeren bij 200 g gedurende 5 min bij RT.
- Was gepelleteerde cellen met 500 pi PBS en centrifugeer bij 200 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer gepelleteerde cellen in 200 ul PBS.
- Isoleer gDNA van bloed en weefsel kit volgens het protocol van de fabrikant. Elueer gDNA in 200 gl buffer AE en bepaal de concentratie door meting OD 260 met een spectrofotometer.
Opmerking: gDNA van geïnfecteerde of mock-geïnfecteerde cellen kunnen geïsoleerd worden als negatieve controles. Neerslaan gDNA aan hogere concentraties voor de lange termijn opslag.- Voeg 3 volumes 100% ethanol en 0,1 volume 3 M natriumacetaat (pH 5,5) en meng door buizen 4-6 keer.
- Bewaren bij -20 ° CO / N.
- Centrifuge bij 16.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant voorzichtig. Was pellets met 70% (volume / volume) ethanol en centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder voorzichtig ethanol en laat de pellets aan de lucht drogen gedurende 3 min bij RT.
- Los gDNA in T 10 E 0,1 (pH 7,5) tot ongeveer 1 ug / ul. Pool gDNA van elke experimentele monster of de negatieve controle en meet de concentratie. Bewaren bij -20 ° C.
2. Amplify Adenine-gemethyleerd DNA Fragmenten
- Digest gDNA met DpnI dat alleen snijdt-adenine gemethyleerd GATCs.
- Stel een reactie op ijs met 2,5 ug gDNA, 1 gl 10x buffer, 0,5 ui Dpnl (20 U / ul) en vul met H 2 O tot een totaal volume van 10 pl. Voor elk gDNA monster, drie reacties - een zonder DpnI ("no DpnI", vervang DpnI met 0,5 ul H 2 O) en twee wi DpnI ("met DpnI").
- Digest O / N bij 37 ° C en DpnI inactiveren bij 80 ° C gedurende 20 min.
- Afbinden damid adapters.
- Bereid damid adapters.
- Resuspendeer elk van beide damid adapter oligo 24 in H 2 O tot een eindconcentratie van 100 pM.
- Combineer gelijke volumes van de twee damid adapter oligo, meng en plaats in een goed gesloten buis. Sluit de buis met Parafilm, zitten in een rek en plaats in een beker gevuld met water van 90 ° C. Houd het waterniveau onder de dop van de buis (water voorkomen dat in de buis), maar boven het oppervlak van de oligo mix.
- Laat het water afkoelen tot kamertemperatuur, zodat de adapters gloeien langzaam.
- Aliquot de gegloeide adapters (50 uM) en bewaar bij -20 ° C.
- Het opzetten van een reactie op het ijs. In elke buis van 2.1.2, voeg 6,2 ul H 2 O, 2 pl 10x ligatiebuffer, 0,8 ul 50 uM damid advertentieaptors (ontdooid op ijs) en 1 pi T4 DNA ligase (5 eenheden / pl). Het totale volume is 20 gl. In één van de twee "met DpnI" buizen vervangen ligase met 1 ui H2O ("no ligase") Merk op dat elke gDNA monster twee negatieve controles -. "No DpnI" en "geen ligase".
- Ligeer O / N bij 16 ° C en inactiveren ligase bij 65 ° C gedurende 10 min.
- Bereid damid adapters.
- Digest DNA met DpnII fragmenten die gemethyleerd GATCs bevatten vernietigen.
- Het opzetten van een reactie op het ijs. In elke buis van 2.2.3, voeg 24 ul H2O, 5 pi 10x DpnII buffer en 1 ui DpnII (10 U / ul). Het totale volume is 50 gl.
- Digest bij 37 ° C gedurende 2-3 uur en inactiveren DpnII bij 65 ° C gedurende 20 min.
- Amplify-adenine gemethyleerd DNA-fragmenten.
- Het opzetten van een reactie op ijs met 5 ul DpnII verteren van 2.3.2, 5 μl 10 x PCR-buffer, 12,5 gl 5 uM damid PCR-primer 24, 4 ui 10 mM dNTP mix, 1 ui 50x polymerase mengsel en 22,5 ui H2O Het totale volume is 50 gl.
- Voer het PCR als volgt: 68 ° C gedurende 10 min; 94 ° C gedurende 1 min, 65 ° C gedurende 5 min, 68 ° C gedurende 15 min; 4 cycli van 94 ° C gedurende 1 min, 65 ° C gedurende 1 min, 68 ° C gedurende 10 min; 17 cycli van 94 ° C gedurende 1 min, 65 ° C gedurende 1 min, 68 ° C gedurende 2 min.
- Analyseer 5 pi PCR producten van elke reactie op een 1% agarosegel. PCR producten zou verschijnen als een uitstrijkje varieert van 0,2 om 2 kb (Figuur 2). De "geen DpnI" en "geen ligase" controles mag geen of duidelijk minder versterking.
- Indien het resultaat van stap 2.4.3 bevredigend Herhaal stap 2.4.1-2.4.3 met twee of drie reacties voor de experimentele monster en een reactie voor elk van de twee negatieve controles.
- Pool en zuiveren PCR producten van dezelfdeexperimentele monster met behulp van PCR zuivering kit of Solid Phase omkeerbare immobilisatie (SPRI) korrels volgens het protocol van de fabrikant. Niet te zuiveren "geen DpnI" of "nee ligase" controles. Elueer DNA met buffer EB.
- Meet de concentratie van het gezuiverde DNA door het meten van OD 260 met een spectrofotometer, die ongeveer 0,1 ug / ul of hoger moeten zijn. Verzamel minste 10 ug DNA per monster. Als met behulp van PCR zuivering kits, zuiveren elk 50 pi PCR-producten met één kolom, elueren in 30 ul buffer EB en bundelen de eluaten.
- Digest DNA met DpnII voorkomen damid PCR primers van worden gesequentieerd.
- Stel een reactie op ijs met 5 ug gezuiverd DNA uit 2.4.6, 5 gl 10 x DpnII buffer, 1 ui DpnII (10 U / ul) en vul met H 2 O tot een totaal volume van 50 pl. Bereid twee of drie reacties voor elk monster.
- Digest bij 37 ° C gedurende 2-3 uurDpnII en inactiveren bij 65 ° C gedurende 20 min.
- Pool en zuivert de monsters van hetzelfde monster met PCR zuivering kit of SPRI parels volgens het protocol van de fabrikant. Elueer DNA met buffer EB.
- Meet de concentratie van het gezuiverde DNA die ongeveer 0,06 ug / ul of hoger moeten zijn. Verzamel minimaal 6 ug DNA per monster. Als met behulp van PCR zuivering kits, zuiveren elk 50 pi verteren met één kolom, elueren in 30 ul buffer EB en bundelen de eluaten.
3. Bibliotheek Voorbereiding voor High-throughput Sequencing
- DNA-fragment
- Experimenteel bepalen van de juiste spijsvertering tijd voor elke nieuwe partij dsDNA Fragmentase. Zoals de enzymactiviteit kan afnemen na verloop van tijd, herhaal de test voor het uitvoeren van een nieuw experiment. Om DNA te redden van 2.5.4 voor de eigenlijke fragmentatie, gebruiken gezuiverde methyl PCR producten uit 2.4.6 of extra DNA van vorige experimeNTS bij deze stap.
- Het opzetten van een master mix met 6 ug DNA, 12 ui 10x Fragmentase buffer en vul aan met H 2 O tot een totaal volume van 114 pi.
- Vortex de Fragmentase voorraad flesje 3 seconden, voeg 6 ul in de master mix en vortex de master mix voor 3 sec. Het totale volume is 120 pi.
- Aliquot 20 ul van de master mix aan elk van 5 nieuwe buizen. Incubeer alle 6 buizen bij 37 ° C gedurende 5 tot 55 min bij een toename van 10 min. Voeg 5 gl 0,5 M EDTA om de reactie te stoppen.
- Analyseer 12,5 gl digest (0,5 ug DNA) van elke reactie en 0,5 ug verteerd DNA op een agarose gel (figuur 3). Bepaal de minimale tijd (T 0.2kb) nodig zijn om de meeste uitstrijkje verteren tot ongeveer 0,2 kb. Selecteer 6 keer looptijden tussen 5 min en T 0.2kb (inclusief 5 min en T 0.2kb) met gelijke stappen voor de eigenlijke fragmentatie.
- Het opzetten van de werkelijke Fragmentatie zoals beschreven in 3.1.1.1-3.1.1.3. Incubeer reacties bij 37 ° C voor tijdsduren bepaald 3.1.1.4.
- Zwembad 6 reacties en zuiveren de digests met PCR zuivering kits of SPRI kralen volgens het protocol van de fabrikant. Elueren DNA in 51 ul buffer EB. De uiteindelijke eluaat ~ 50 ul.
- Experimenteel bepalen van de juiste spijsvertering tijd voor elke nieuwe partij dsDNA Fragmentase. Zoals de enzymactiviteit kan afnemen na verloop van tijd, herhaal de test voor het uitvoeren van een nieuw experiment. Om DNA te redden van 2.5.4 voor de eigenlijke fragmentatie, gebruiken gezuiverde methyl PCR producten uit 2.4.6 of extra DNA van vorige experimeNTS bij deze stap.
- Reparatie uiteinden van de gefragmenteerde DNA
- Stel een reactie op ijs met het eluaat uit 3.1.3, 25 ui H2O, 10 gl 10x T4 DNA ligase buffer met 10 mM ATP, 4 ui 10 mM dNTP mix, 5 ui T4 DNA polymerase (3 U / ul) , 1 pl Klenow DNA polymerase (5 U / pl) en 5 pi T4 polynucleotide kinase. Het totale volume 100 pl. Meng goed met pipet. Vermijd schuim en bubbels.
- Incubeer bij 20 ° C gedurende 30 min.
- Zuiver het DNA met PCR zuivering kit of SPRI parels volgens het protocol van de fabrikant. Elueren DNA in 33 ul buffer EB. Het uiteindelijke eluaat ~ 32 & #181; l.
- Add "A" overhangen
- Stel een reactie op ijs met het eluaat uit 3.2.3, 5 pi 10x Klenow-buffer, 10 pl 1 mM dNTP en 3 pl Klenow (3 '→ 5' exo-) (5 U / pl). Het totale volume is 50 gl. Meng goed met pipet. Vermijd schuim en bubbels.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min.
- Zuiver het DNA met PCR zuivering kit of SPRI parels volgens het protocol van de fabrikant. Elueren DNA in 22 ul buffer EB. Het uiteindelijke eluaat ~ 21 ul.
- Ligeren sequencing adapters
- Bereid sequencing adapters 28.
- Resuspendeer elk adapter oligo tot een concentratie van 100 pM in 10 mM Tris-Cl (pH 7,8), 0,1 mM EDTA (pH 8,0) en 50 mM NaCl.
- Meng gelijke volumes van de universele adapter 28 en een geïndexeerde adapter 28.
- Temperen de adapters in een thermische cycler met de volgendeprogramma: 95 ° C gedurende 2 min; 140 cycli van 30 sec vanaf 95 ° C en afneemt met 0,5 ° C per cyclus; houden op 4 ° C.
- Aliquot adapters en bewaar bij -20 ° C.
- Het opzetten van een reactie op ijs met het eluaat van 3.3.3, 25 pi 2x ligatiebuffer, 1,5 ul 50 uM onthard sequencing adapters (op ijs ontdooid) van 3.4.1.4 en 2,5 ul T4 DNA ligase. Meng goed met pipet. Vermijd schuim en bubbels. Als multiplex sequencing gewenst is, gebruik dan een andere geïndexeerde adapter voor elk monster.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Zuiver het DNA met PCR zuivering kit of SPRI parels volgens het protocol van de fabrikant. Elueren DNA in 24 ul buffer EB. Het uiteindelijke eluaat ~ 23 ul.
- Bereid sequencing adapters 28.
- Zet Y-vormige adapters dsDNA nauwkeurig mogelijk bepalen DNA-fragment sizes 28
- Het opzetten van een reactie op ijs met het eluaat van 3.4.4, 12,5 ul H 2 O, 1 pl 25 pM primer 1 28, 1 pl 25 pM primer 2 28, 1,5 ul 10 mM dNTP, 10 ui 5 x PCR buffer en 1 pl DNA polymerase (1 U / pl).
- Voer het PCR als volgt: 95 ° C gedurende 3 min; 5 cycli van 98 ° C gedurende 15 sec, 63 ° C gedurende 30 sec, 72 ° C gedurende 30 seconden; 72 ° C gedurende 1 min; 4 ° C in de wacht.
- Zuiver het DNA met PCR zuivering kit of SPRI parels volgens het protocol van de fabrikant. Elueren DNA in 11 ul buffer EB. De uiteindelijke eluaat ~ 10 ul.
- Te selecteren van de bibliotheek
- Bereid een 2% agarosegel met 1 x TAE buffer. Voeg ethidium bromide (LET) tot een uiteindelijke concentratie van 500 ng / ml bij de gesmolten TAE-agarose-oplossing afgekoeld om aanzuiging van ethidium bromide voorkomen. Zorg ervoor dat u voldoende rijstroken hebben voor alle monsters, DNA ladder en lege rijstroken.
- Voeg 8 ul 6x laden kleurstof aan het eluaat uit 3.5.3. <li> DNA ladder Bereid door het mengen plus 1 kb DNA ladder (1,0 ug / ul), 6x ladingskleurstof en H2O in een verhouding van 1: 1: 4.
- Lading 6 pl DNA ladder, de monsters van 3.6.2 en andere 6 pl DNA ladder, elk in een afzonderlijke baan en met ten minste één lege baan van de aangrenzende samples / ladders.
- Voer de elektroforese bij 120 V gedurende 60 min.
- Bekijk de gel op een UV transilluminator (minimaliseren van de blootstelling aan UV tijd). Draag een veiligheidsbril en gezichtsbescherming. Zorg ervoor dat een van de DNA ladders werking goed passende afstand (genoeg voor het uitsnijden van 3 gelstukjes) tussen 300 bp en 400 bp banden. Smalle tussenruimte vergroot de moeilijkheden bij het uitsnijden van meerdere gelplakken, terwijl grote afstand verhoogt het volume van de gel uitgesneden segmenten.
- Gebruik een nieuwe scalpel of een scheermesje voor elke baan. Accijns drie dunne gelplakjes tussen 300 en 400 bp van elke laan (figuur 4) en plaats ze elk in een microcentrifugebuis. Houd het volume van elk gel sluizen zo laag mogelijk (<100 pl).
- Meet het volume van elke gel slice (1 pl gel weegt ongeveer 1 mg), voeg 6x volumes QG buffer en incubeer bij 50 ° C.
- Vortex de QG-gelmengsel elke 2-3 min totdat de gel slice volledig is opgelost. Voeg 2x gel volumes isopropanol en meng.
- Vanaf deze stap volgt het protocol van gel extractie kits. Elueren DNA in 51 ul buffer EB. De uiteindelijke eluaat ~ 50 ul.
- Optimaliseer het aantal PCR-cycli 29.
- Stel een reactie op ijs met 1 ui eluaat van 3.6.10, 1 pl 25 pM primer 1 28, 1 pl 25 pM primer 2 28, 7 ul H2O en 10 pi SYBR Green Supermix. Het totale volume is 20 gl.
- Voer het qPCR als volgt: 95 ° C gedurende 3 min; 20 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 63 ° C gedurende 30 sec, 72 ° C gedurende 30 sec, de plaat te lezen.
- Analyseer gegevens met behulp van qPCR analysesoftware en bepaal de kwantificering Cycle (Cq) of drempelcyclus (Ct) voor elk monster met behulp van het protocol van de fabrikant. Ga verder met de monsters die Cq / Ct ≤ 14. Met de maximale Cq (Cq 0) min 1 (afgerond naar de volgende hogere integer) als de laatste PCR-cyclus nummer (N PCR).
- Pas de hoeveelheid DNA templates zodat verschillende monsters worden versterkt tot ongeveer gelijke hoeveelheden na het uitvoeren van hetzelfde aantal PCR-cycli. Met 8 ul sjabloon voor het monster met de hoogste Cq (Cq 0), en bereken de template hoeveelheden van andere monsters met de volgende formule:
Vol i = 8 x 1,8 Cq i CQ komt 0
- Het opzetten van PCR-reacties op ijs met het sjabloon volumes berekend uit 3.7.1.4: 1 ui 25 uM primer 1 28, 1 ui 25 uM primer 2 28, 1.5gl 10 mM dNTP, 10 ui 5 x buffer, 1 ui DNA polymerase (1 U / ul) en vul met H 2 O tot een totaal volume van 50 pl.
- Voer het PCR als volgt: 95 ° C gedurende 45 seconden; N PCR-cycli (bepaald 3.7.1.3) van 98 ° C gedurende 15 sec, 63 ° C gedurende 30 sec, 72 ° C gedurende 30 seconden; 72 ° C gedurende 1 min; 4 ° C in de wacht.
- Analyseer 5 pi PCR producten op een 2% agarosegel (Figuur 5A). Een duidelijke "single" band geeft aan dat de geamplificeerde DNA fragmenten in een nauw lengtebereik en het DNA bibliotheek kan worden onderworpen aan verdere analyse.
- Herhaal één reactie voor geselecteerde monsters en het zwembad van de versterkte DNA-bibliotheken van hetzelfde monster.
- Zuiver geselecteerd DNA-bibliotheken voor sequentiebepaling.
- Als primer / adapter dimeren niet zichtbaar in 3.7.4, zuiveren DNA-bibliotheken met PCR zuivering kit of SPRI parels volgens het protocol van de fabrikant. Elueren DNA in 21 ul buffer EB. Deuiteindelijke eluaat ~ 20 ul. Als de gebruiker sequencing faciliteit specifieke instructies voor de elutiebuffer, het eindvolume enz bereiden monsters dienovereenkomstig.
- Als primer / adapter dimeren zijn duidelijk zichtbaar in 3.7.4, zuiveren bibliotheken volgt.
- Laad DNA van 3.7.5 en DNA Ladder in een 2% agarosegel geprefabriceerd. De monsters kunnen worden gezuiverd zoals beschreven in 3.7.6.1 het volume verminderen of in meerdere putjes kunnen worden geladen. Plaats de agarosegel in een geschikt energie systeem. Laat de gel lopen voor 15 min.
- Met behulp van een geschikte transilluminator, knip de gewenste band met een schone scalpel / razor voor elk monster en plaats de gel slice in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Isoleer DNA met gel extractie kit volgens het protocol van de fabrikant met twee modificaties: incubeer buffer QG-gel mengsel in een thermo-menger bij 37 ° C en 1000 rpm gedurende 30 min en voeg 2x gel volumes isopropanol.
Opmerking: Een analyse van de kwaliteit van een Bioanalyzer (figuur 5B) worden uitgevoerd voorafgaand aan sequencing om de exacte grootte bereik en de concentratie van een DNA-bibliotheek te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
The Dam-V5-LmnB1 fusie-eiwit werd geverifieerd als co-gelokaliseerd met het endogene Lamine B eiwit door immunofluorescentiekleuring (figuur 1).
De succesvolle PCR amplificatie van adenine gemethyleerd DNA fragmenten is een belangrijke stap voor damid-seq. De experimentele monsters moet een uitstrijkje van 0,2 amplificeren - 2 kb terwijl de negatieve controles (zonder DpnI zonder ligase of zonder PCR-matrijs) moet resulteren in geen of duidelijk minder-amplificatie (Figuur 2).
Het gemethyleerde DNA-fragmenten in het traject 0,2-2 kb, terwijl de gewenste insert grootte voor een NGS bibliotheek 200-300 bp. Daarom is het essentieel om de methylgroep PCR producten fragmenteren in de geschikte grootte. Toch bleek onpraktisch om gelijktijdig breken grotere DNA-fragmenten geschikte omvang hebbens en houden de meeste kleinere DNA-fragmenten intact in één fragmentatie duur. Daarom werden tijdsverloop experimenten uitgevoerd om de minimale tijd (T 0.2kb) nodig fragment 1 ug DNA tot een uitstrijkje gecentreerd op 200 bp (figuur 3) te bepalen. Dan 6 tijdsduren in gelijke stappen werden geselecteerd tussen 5 min en T 0.2kb voor de eigenlijke fragmentatie. De enzymatische activiteit van dubbele streng DNA Fragmentase kan variëren van partij tot partij en kan afnemen na verloop van tijd, dus het is aan te raden om deze stap voor een nieuwe batch van Fragmentase of na opslag gedurende een periode van tijd te herhalen.
De gewenste insert grootte tussen 200 en 300 bp overeenkomend met DNA-fragmenten tussen 300 en 400 bp (met inbegrip van 121 bp sequentie adapters) op de agarosegel. Drie dunne plakjes binnen dit traject werden uit elke experimentele monster het groottebereik van een bibliotheek beperken, waardoor de kansverkrijgen van ten minste één bevoegd sequencing bibliotheek (Figuur 4).
Een monster van 5 gl van elke geamplificeerde DNA bibliotheek werd geanalyseerd op agarose gel om te bepalen welke bibliotheek kan komen voor sequentiebepaling. Zoals getoond in figuur 5A, moet duidelijk enkele band van dezelfde grootte als de gel uitgesneden segment zichtbaar op de agarosegel (stap 3.7.4) zijn. Vervolgens werden geselecteerd bibliotheken door een Bioanalyzer (Figuur 5B) onderzocht om de exacte grootte bereik en concentraties voorafgaand bepalen sequencing. Desgewenst geamplificeerde DNA bibliotheken worden direct door Bioanalyzer onderzocht zonder gelanalyse. Wanneer meerdere bibliotheken van goede kwaliteit, is het raadzaam om de sequentie bibliotheken van vergelijkbare grootte varieert van een paar experimentele (cellen die Dam-V5-NP) en controle (cellen die V5-Dam) samples.
De korte leest gegenereerd doorsequencing systemen werden eerst in kaart gebracht naar het overeenkomstige genoom. Uniek uitgelijnd leest werden vervolgens doorgegeven aan de volgende analyses. Een pijpleiding te verwerken korte leest, de bouw van een genoom-NL interactie kaart en analyseren van gen-NL verenigingen werden in detail beschreven in onze eerdere werk 10. Representatieve resultaten worden getoond in figuur 6.
Figuur 1. Het bevestigen subnucleaire lokalisaties van fusie-eiwitten door immunofluorescentiekleuring. IMR90 humane long fibroblast cellen werden voorbijgaand getransfecteerd met een plasmide dat Dam-V5-LmnB1 en werden gekleurd met anti-Lamine B (A, rood) en anti-V5 (B, groen). (C) samenvoegen van beelden in A en B. Klik hier om een grotere versie van t bekijkenzijn figuur.
Figuur 2. PCR amplificatie-adenine gemethyleerd DNA-fragmenten. Een monster van 5 gl van elke PCR-reactie werd geanalyseerd op een 1% agarosegel. Een uitstrijkje variërend 0,2-2 kb werd geamplificeerd van elke experimentele monster, maar geen versterking werd waargenomen in negatieve controles (geen DpnI in stap 2.1, geen Ligase in stap 2.2, of geen PCR-template). Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.
Figuur 3. Het bepalen van optimale fragmentatie looptijden. Gezuiverd methyl PCR-producten werden onderworpen aan de versnippering van de tijd duur 5-55 min bij een toename van 10 min (onverteerd DNA , Aangeduid als "0 min"). 1 ug DNA ladder en 0,5 ug van elk gefragmenteerde DNA monster werden geanalyseerd op een agarosegel. De minimale tijd om de meerderheid van het DNA uitstrijkje verteren ongeveer 200 bp werd bepaald op ongeveer 35 min, dus zes gelijkmatig verdeeld tijdsduren tussen 5 en 35 min (5 en 35 min inbegrepen) werden geselecteerd om de werkelijke fragmentatie uit te voeren. Zoom klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Grootte selecteren van DNA-bibliotheken. DNA-monsters van Dam-V5-LmnB1 en V5-Dam vanaf stap 3,6 werden op een 2% agarosegel, en drie even grote gelplakken (L, M en H overeenkomend met lage, medium en hoog in grootte) tussen 300 en 400 bp werden uitgesneden zoals getoond door de gele lijnen. OM / files / ftp_upload / 53.620 / 53620fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Amplified DNA-bibliotheken voor high throughput sequentiebepaling. (A) geamplificeerde DNA-bibliotheken op een agarosegel geanalyseerd. PCR matrijzen werden gezuiverd uit gel segmenten weergegeven in figuur 4. (B) Bioanalyzer resultaten van de V5-Dam (L) monster en de Dam-V5-LmnB1 (L) monster die onderstreept in (A). Deze twee bibliotheken hadden de soortgelijke smalle omvang bereiken en dus gekwalificeerd voor high throughput sequencing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
jpg "/>
Figuur 6. NGS gegevens in UCSC genoom browser. Muis chromosoom 1 wordt als voorbeeld weergegeven. Sequence gegevens werden verkregen uit muizen C2C12 myoblasten 10. Tracks "MB.LmnB1.w2k" en "MB.Dam.w2k", wat overeenkomt met gegevens uit cellen die Dam-V5-LmnB1 en V5-Dam respectievelijk plot genormaliseerd read dichtheden (leest per kilobase per miljoen unieke wijze in kaart gebracht leest, of RPKM ) in niet-overlappende rij 2 kb vensters langs het chromosoom. Volg "MB.log2FC.w2k" plots genoom-NL verenigingen, dwz log2 RPKM verhoudingen van LmnB1 dan Dam, op 2 kb resolutie. Volg "MB.sLADs" schildert sequencing-gebaseerde Lamina Associated Domeinen (slads, dwz genomische regio's die hogere lees- dichtheden van LmnB1 hebben meer dan Dam met statistische significantie) in zwart, niet-slads in grijs en onbepaalde regio's in het wit. Klik hier om downloaD Dit bestand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ViraPower Lentiviral Expression Systems | Life Technologies | K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11791-020 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | QIAGEN | 69506 or 69504 | |
| Gateway pDONR 201 | Life Technologies | 11798-014 | |
| 293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | |
| Tris | brand not critical | ||
| EDTA | brand not critical | ||
| 200 Proof EtOH | brand not critical | ||
| Isopropanol | brand not critical | ||
| Sodium Acetate | brand not critical | ||
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | supplied with buffer |
| DamID adaptors "AdRt" and "AdRb" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation. | |
| T4 DNA Ligase | Roche Life Science | 10481220001 | supplied with buffer |
| DpnII | New England Biolabs | R0543 | supplied with buffer |
| DamID PCR primer "AdR_PCR" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England Biolabs | N0446 | 100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639201 | supplied with buffer |
| 1Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787018 | 1.0 µg/µl |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 or 28106 | |
| MinElute PCR Purification Kit | QIAGEN | 28004 or 28006 | for an elution volume of less than 30 µl |
| SPRI beads / Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63880 | apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used |
| Buffer EB | QIAGEN | 19086 | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348 | supplied with buffer |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203 | |
| DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs | M0210 | |
| T4 Polynuleotide Kinase | New England Biolabs | M0201 | |
| Klenow Fragment (3’ → 5’ exo-) | New England Biolabs | M0212 | supplied with buffer |
| sequencing adaptors | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200 | used in 3.4.3; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase |
| sequencing primer 1 and 2 | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
| KAPA HiFi PCR Kit | Kapa Biosystems | KK2101 or KK2102 | supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10 mM dNTP mix |
| agarose | Sigma Aldrich | A4679 | |
| ethidium bromide | Sigma Aldrich | E1510-10ML | 10 mg/ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 or 28706 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725121 or 1725122 | |
| Spectrophotometer | brand not critical | ||
| 0.45 μm PVDF Filter | brand not critical | ||
| 25 ml Seringe | brand not critical | ||
| 10 cm Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
| 6-well Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | ||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | for qPCR | |
| Vortex Mixer | brand not critical | ||
| Dry Block Heater or Thermomixer | brand not critical | ||
| Microcentrifuge | brand not critical | ||
| Gel electrophoresis system with power supply | brand not critical | ||
| Magnet stand | for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical | ||
| UV transilluminator | brand not critical | ||
| E-gel electrophoresis system | Life Technologies | G6400, G6500, G6512ST |
References
- van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase. Nat Genet. 27, 304-308 (2001).
- van Steensel, B., Henikoff, S. Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase. Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).
- Fu, A. Q., Adryan, B. Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays. Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).
- Guelen, L. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions. Nature. 453, 948-951 (2008).
- Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm. Cell. 140, 360-371 (2010).
- Kubben, N. Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions. Chromosoma. 121, 447-464 (2012).
- Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe. Nucleus. 3, 77-87 (2012).
- Harr, J. C. Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins. J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).
- Gonzalez-Aguilera, C. Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 15, R21 (2014).
- Wu, F., Yao, J. Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping. BMC Genomics. 14, 591 (2013).
- Filion, G. J. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Vogel, M. J. Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes. Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).
- Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).
- Shimbo, T. MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes. PLoS Genet. 9, e1004028 (2013).
- Orian, A. Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network. Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).
- Artegiani, B. Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis. EMBO J. , (2014).
- Schuster, E. DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO. Mol Syst Biol. 6, 399 (2010).
- Bianchi-Frias, D. Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila. PLoS Biol. 2, e178 (2004).
- Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe. Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).
- Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development. Development. 138, 2761-2771 (2011).
- Germann, S., Gaudin, V. Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method. Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).
- Zhang, X. The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation. Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).
- Orian, A. Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression. Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).
- Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase. Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).
- de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals. Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).
- DamID mammalian vectors. , Available from: http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm (2015).
- Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/ (2015).
- Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/ (2015).
- Bernstein, B. E. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).
- Encode Project Consortium. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS Biol. 9, e1001046 (2011).
- Asp, P. Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).
- Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).
- Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics. Genome Biol. 15, 110 (2014).
- Navin, N. E. Cancer genomics: one cell at a time. Genome Biol. 15, 452 (2014).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).
- Nagano, T. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
- Kind, J. Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions. Cell. 153, 178-192 (2013).
- Southall, T. D. Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells. Dev Cell. 26, 101-112 (2013).
