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DamID-seq: L'échelle du génome Cartographie des protéine-ADN Interactions par séquençage à haut débit de fragments d'ADN adénine-méthylé

Published: January 27, 2016 doi: 10.3791/53620
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

Summary

Nous décrivons ici un essai en couplant l'identification ADN adénine méthyltransférase (DamID) pour le séquençage à haut débit (DamID-seq). Cette méthode améliorée offre une résolution plus élevée et une plage dynamique plus large, et permet l'analyse des données DamID-Seq en conjonction avec d'autres données de séquençage à haut débit tels que ChIP-seq, ARN-Seq, etc.

Introduction

ADN identification adénine méthyltransférase (DamID) 1,2 est une méthode pour détecter les interactions protéine-ADN in vivo et est une approche alternative à immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) 3. Il utilise une quantité relativement faible de cellules et ne nécessite pas de reticulation chimique de l'ADN ou de protéines avec un anticorps hautement spécifique. Ce dernier est particulièrement utile lorsque la protéine cible est associée de façon lâche ou indirectement avec de l'ADN. DamID a été utilisé avec succès pour cartographier les sites de liaison d'une variété de protéines y compris des protéines d'enveloppe nucléaire 4-10, 11-13 protéines associées à la chromatine, les enzymes modifiant la chromatine, 14 facteurs de transcription et des co-facteurs d'ARNi 15-18 et 19 machines. Le procédé est applicable dans de nombreux organismes, y compris S. 13 cerevisiae, S. 7 pombe, C. 9,17 elegans, D. melanogaster 5,11,18,20, A. thaliana 21,22 ainsi que la souris et cellules humaines lignes 6,8,10,23,24.

Le développement de l'essai DamID était basée sur la détection spécifique de fragments d'ADN adénine-méthylé dans des cellules eucaryotes qui ne disposent pas la méthylation 2 adénine endogène. Une protéine de fusion exprimée, consistant en la protéine de liaison à l'ADN d'intérêt et E. adénine méthyltransférase coli DNA (barrage), peut méthyler la base adénine dans des séquences GATC qui sont à proximité spatiale (la plus significative au sein de 1 kb et jusqu'à environ 5 ko) pour les sites de liaison de la protéine dans le génome 2. Les fragments d'ADN peuvent être modifiées spécifiquement amplifiés et hybrides à des puces pour détecter les sites de fixation génomiques de la protéine d'intérêt 1,25,26. Cette méthode originale a été DamID limitée par la disponibilité de puces et la densité de sondes prédéterminées. Nous avons donc intégré séquençage à haut débit dansà DamID 10 et désigné la méthode que DamID-seq. Le grand nombre de courte lectures généré à partir DamID-seq permet une localisation précise des interactions protéine-ADN pangénomique. Nous avons constaté que DamID-seq fourni une résolution plus élevée et une plage dynamique plus large que DamID par microarray pour l'étude du génome nucléaire lamina (NL) 10 associations. Cette méthode permet une meilleure sonder les associations NL au sein des structures de gènes 10 et facilite les comparaisons avec d'autres données de séquençage à haut débit, tels que ChIP-seq et de l'ARN-Seq.

Le protocole DamID-seq décrit ici a été initialement développé pour la cartographie du génome NL 10 associations. Nous avons généré une protéine de fusion de souris ou attacher Lamin B1 humaine à E. coli ADN adénine méthyltransférase et testé le protocole 3T3 souris fibroblastes embryonnaires, C2C12 myoblastes de souris 10 et IRM90 fibroblastes pulmonaires de foetus humain (données non publiées). Dans ce protocole, nous commençons avec constructing vecteurs et exprimant Dam-captifs protéines de fusion par l'infection lentiviral dans des cellules mammifères 24. Ensuite, nous décrivons les protocoles détaillés de l'amplification de fragments d'ADN adénine-méthylé et de préparer des bibliothèques de séquençage qui devraient être applicables dans d'autres organismes.

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Protocol

1. Génération et expression de protéines de fusion et Dam gratuit Protéines

  1. Clone protéines d'intérêt dans le vecteur DamID.
    1. Amplifier l'ADNc de protéine d'intérêt (POI) à l'aide de la haute fidélité de l'ADN polymerase et des amorces appropriées souhaitée selon le protocole du fabricant. Expérimentalement déterminer les conditions d'amplification optimales pour assurer une bonne amplification des inserts.
    2. Exécuter un gel d'agarose et on purifie l'ADNc amplifié de POI par le kit d'extraction sur gel selon le protocole du fabricant.
    3. Le clone d'ADNc de POI dans le vecteur pDONR201 utilisant BP Clonase II selon le protocole du fabricant.
    4. Cloner l'ADNc de POI à partir du vecteur des bailleurs de fonds dans le vecteur de destination pLGW-RFC1-V5-EcoDam ou la destination vecteur pLGW-EcoDam-V5-RFC1 27 utilisant LR Clonase II selon le protocole du fabricant, en fonction de la direction souhaitée de la fusion de POI à l'extrémité N-terminale ou ee C-terminale de la E. adénine méthyltransférase coli ADN (EcoDam) 27.
    5. Vérifiez par séquençage que l'ADNc clone a une séquence correcte et formes en cadre de la fusion EcoDam.
  2. Générer des stocks lentiviraux.
    1. Générer des stocks lentiviraux exprimant Dam-V5-POI et V5-Dam (à partir du vecteur pLGW-V5-EcoDam 27) en utilisant des systèmes d'expression lentiviraux. Utiliser la procédure de transfection vers l'avant selon le protocole du fabricant.
      1. Utilisation des cellules 293T et la lipofection pour générer des stocks lentiviraux selon le protocole du fabricant pour la transfection.
      2. Inclure l'étape de filtre de 0,45 um de PVDF.
  3. Infecter les cellules avec des lentivirus.
    1. Le jour avant l'infection (jour 0), passer cellules adhérentes cultivées dans un milieu de croissance approprié pour ce type de cellule à un tissu plaque de culture 6 puits en utilisant le même milieu de croissance sans antibiotiques àatteindre 50% de confluence le jour de l'infection. La place les cellules dans un incubateur à 37 ° C.
    2. Le jour de l'infection (Jour 1), retirez 2 cryovials de deux Dam-V5-POI et V5-Dam surnageants lentiviraux d'un congélateur à -80 ° C et le placer dans un bain d'eau de 37 ° à dégeler.
      1. Retirez le support de la croissance des cellules et la remplacer par 0,5 ml de milieu de croissance frais sans antibiotiques.
      2. Ajouter 1 ml de la lentivirus décongelé à chaque puits (2 puits avec V5-Dam et 2 puits avec Dam-V5-POI). Ajouter 1 ml de milieu de croissance sans antibiotiques pour les 2 autres puits-cela servira comme contrôle négatif. Secouer doucement la plaque de 6 puits à mélanger et à replacer dans un 37 ° C incubateur O / N.
    3. Le jour après l'infection (Jour 2), supprimer suspensions virales à partir de cellules et de remplacer par 2 ml de milieu de croissance sans antibiotiques. La place des cellules de retour dans un incubateur à 37 ° pendant 48 heures.
  4. Isoler ADNg.
    1. Aspirer le milieu de chaque bien et decellules tach utilisant 250 pi 0,05% de trypsine-EDTA. Incuber à 37 ° C pendant 2 min.
    2. Laver les cellules de la plaque avec 1 ml de milieu de croissance et des cellules de pipettes de chaque puits dans un tube de 1,5 ml. Pellet les cellules par centrifugation à 200 xg pendant 5 min à température ambiante.
    3. Laver les cellules en culot avec 500 pi de PBS et centrifuger à 200 g pendant 2 min à température ambiante.
    4. Reprendre culot de cellules dans 200 pi de PBS.
    5. Isoler ADNg par le sang et les tissus kit selon le protocole du fabricant. Elute ADNg dans 200 pi de tampon AE et déterminer la concentration en mesurant OD 260 en utilisant un spectrophotomètre.
      Remarque: ADNg des cellules infectées ou non infectées simulées peuvent être isolés en tant que témoins négatifs. ADNg précipiter à des concentrations plus élevées d'un stockage à long terme.
      1. Ajouter 3 volumes d'éthanol à 100% et de 0,1 volume de 3 M d'acétate de sodium (pH 5,5), et mélanger par inversion des tubes 4-6 fois.
      2. Conserver à -20 ° CO / N.
      3. Centrifugeuse à 16.000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
      4. Retirer délicatement le surnageant. Laver pastilles avec 70% (volume / volume) d'éthanol et centrifuger à 16 000 g pendant 5 min à 4 ° C.
      5. Retirez délicatement l'éthanol et laisser sécher à l'air pastilles pendant 3 min à température ambiante.
      6. Dissoudre ADNg en T 10 E 0,1 (pH 7,5) à environ 1 ug / ul. Piscine ADNg de chaque échantillon expérimental ou le contrôle négatif et mesurer la concentration. Conserver à -20 ° C.

Fragments d'ADN 2. Amplifier Adénine-méthylés

  1. Digest ADNg avec Dpnl que seule coupe GATCs adénine-méthylé.
    1. Mettre en place une réaction sur la glace avec 2,5 pg ADNg, 1 ul 10x tampon, 0,5 pi Dpnl (20 U / pl) et remplir avec H 2 O pour un volume total de 10 ul. Pour chaque échantillon, ADNg, trois réactions - préparer un coup Dpnl («non Dpnl", remplacer Dpnl avec 0,5 pi de H 2 O) et deux wième Dpnl ("avec Dpnl").
    2. Digest O / N à 37 ° C et inactiver Dpnl à 80 ° C pendant 20 min.
  2. Ligaturer les adaptateurs DamID.
    1. Préparer adaptateurs DamID.
      1. Remettre en suspension chacun des deux oligos adaptateurs DamID 24 dans H 2 O à une concentration finale de 100 uM.
      2. Combiner des volumes égaux des deux oligos adaptateurs DamID, mélanger et placer dans un tube hermétiquement fermé. Scellez le tube avec du Parafilm, assis dans un rack et le placer dans un bécher rempli d'eau à 90 ° C. Gardez le niveau d'eau au-dessous du bouchon du tube (pour éviter l'eau de pénétrer dans le tube) mais au-dessus de la surface du mélange d'oligo.
      3. Laisser refroidir à la température ambiante de l'eau de sorte que le recuit adaptateurs lentement.
      4. Aliquoter les adaptateurs recuites (50 pm) et conserver à -20 ° C.
    2. Mettre en place une réaction sur de la glace. Dans chaque tube de 2.1.2, ajouter 6,2 ul de H 2 O, 2 ul de tampon de ligation 10x, 0,8 pi de 50 pM DamID annonceaptors (décongelés sur de la glace) et 1 pl T4 ADN ligase (5 U / pl). Le volume total est de 20 pi. Dans l'une des deux "tubes" avec Dpnl, remplacer ligase avec 1 ul de H 2 O («non ligase") On notera que chaque échantillon a ADNg deux contrôles négatifs -. «Non Dpnl» et «non ligase".
    3. Ligaturer O / N à 16 ° C et inactiver la ligase à 65 ° C pendant 10 min.
  3. Digest ADN avec Dpnll de détruire les fragments non méthylés qui contiennent GATCs.
    1. Mettre en place une réaction sur de la glace. Dans chaque tube de 2.2.3, ajouter 24 ul de H 2 O, 5 pi de tampon 10x Dpnll et 1 ul Dpnll (10 U / ul). Le volume total est de 50 pi.
    2. Digest à 37 ° C pendant 2-3 h et inactiver Dpnll à 65 ° C pendant 20 min.
  4. Amplifier des fragments d'ADN adénine-méthylé.
    1. Mettre en place une réaction sur de la glace avec 5 pi Dpnll digérer de 2.3.2, 5 μL 10x tampon de PCR, l'amorce 24, 4 pi 10 mM dNTP mix, 12,5 pi 5 uM DamID PCR 1 ul 50x mélange de polymerase et 22,5 pi H 2 O. Le volume total est de 50 pi.
    2. Exécuter la PCR comme suit: 68 ° C pendant 10 min; 94 ° C pendant 1 min, 65 ° C pendant 5 min, 68 ° C pendant 15 min; 4 cycles de 94 ° C pendant 1 min, 65 ° C pendant 1 min, 68 ° C pendant 10 min; 17 cycles de 94 ° C pendant 1 min, 65 ° C pendant 1 min, 68 ° C pendant 2 min.
    3. Analyser les 5 produits de PCR ul de chaque réaction sur un gel d'agarose à 1%. Les produits de PCR doivent apparaître comme un frottis allant de 0,2 à 2 kb (Figure 2). Les contrôles "pas Dpnl» et «non ligase" ne devraient pas avoir ou nettement moins amplification.
    4. Si le résultat de l'étape 2.4.3 est satisfaisant, répéter les étapes 2.4.1-2.4.3 avec deux ou trois réactions pour l'échantillon expérimental et une réaction pour chacun des deux témoins négatifs.
    5. Piscine et purifier des produits de PCR à partir de la mêmeéchantillon expérimental en utilisant des kits de purification de PCR en phase solide ou immobilisation réversible (SPRI) des billes selon le protocole du fabricant. Ne pas purifier »Dpnl pas» ou «pas de contrôles de ligase". Eluer avec du tampon EB ADN.
    6. Mesurer la concentration de l'ADN purifié par mesure de la DO 260 en utilisant un spectrophotomètre, ce qui devrait être d'environ 0,1 ug / ul ou plus. Recueillir un minimum de 10 pg d'ADN de chaque échantillon. Si vous utilisez des kits de purification de PCR, purifier chacun des produits de PCR de 50 pi avec une colonne, éluer dans 30 pl de tampon EB et mettre en commun les éluats.
  5. Digest ADN avec Dpnll pour empêcher les amorces de PCR DamID d'être séquencé.
    1. Mettre en place une réaction sur de la glace avec de l'ADN purifié à partir de 5 ug 2.4.6, 5 pi de tampon 10x Dpnll, 1 ul Dpnll (10 U / ul) et se remplissent de H 2 O à un volume total de 50 ul. Préparer deux ou trois réactions pour chaque échantillon.
    2. Digérer à 37 ° C pendant 2-3 heureset inactiver Dpnll à 65 ° C pendant 20 min.
    3. Piscine et purifier les produits de digestion du même échantillon avec des kits de purification de PCR ou des billes SPRI selon le protocole du fabricant. Eluer avec du tampon EB ADN.
    4. Mesurer la concentration de l'ADN purifié qui devrait être d'environ 0,06 ug / ul ou plus. Recueillir un minimum de 6 pg d'ADN de chaque échantillon. Si vous utilisez des kits de purification de PCR, de purifier chaque 50 pi digérer avec une colonne, éluer dans 30 pl de tampon EB et mettre en commun les éluats.

3. Préparation de la bibliothèque à haut débit de séquençage

  1. Fragment d'ADN
    1. Expérimentalement déterminer le temps de la digestion appropriée pour chaque nouveau lot de ADNds Fragmentase. Comme l'activité enzymatique peut diminuer au fil du temps, répéter le test avant de réaliser une nouvelle expérience. Pour enregistrer l'ADN de 2.5.4 à la fragmentation actuelle, utiliser des produits de PCR de méthyle purifié à partir de 2.4.6 ou de l'ADN supplémentaire de experime précédentents à cette étape.
      1. Mettre en place un mélange maître avec l'ADN de 6 pg, tampon 12 ul 10x Fragmentase et remplir avec H 2 O pour un volume total de 114 ul.
      2. Vortex l'Fragmentase Stock flacon pendant 3 secondes, ajouter 6 ul dans le mélange maître et Vortex mélange maître pendant 3 sec. Le volume total est de 120 pi.
      3. Aliquote de 20 pi de mélange maître à chacun des 5 nouveaux tubes. Incuber tous les tubes 6 à 37 ° C pendant 5 à 55 min à un incrément de 10 min. Ajouter 5 ul d'EDTA 0,5 M pour arrêter la réaction.
      4. Analyser digérer 12,5 ul (0,5 ug d'ADN) de chaque réaction, ainsi que 0,5 ug d'ADN non digéré sur un gel d'agarose (figure 3). Déterminer le temps minimal (T 0.2kb) nécessaire pour digérer la majorité du frottis à environ 0,2 kb. Sélectionner 6 durées de temps compris entre 5 min et T 0.2kb (y compris les 5 min et T 0.2kb) avec des incréments égaux à la fragmentation réelle.
    2. Mettre en place les fragmen réelsmise comme décrit dans 3.1.1.1-3.1.1.3. Incuber les réactions à 37 ° C pendant des durées de temps déterminées en 3.1.1.4.
    3. Piscine 6 réactions et purifier les digestions avec des kits de purification de PCR ou des perles SPRI selon le protocole du fabricant. Eluer ADN dans du tampon EB 51 ul. L'éluat final est d'environ 50 ul.
  2. La réparation d'extrémités de l'ADN fragmenté
    1. Mettre en place une réaction sur de la glace avec l'éluat à partir de 3.1.3, 25 ul de H 2 O, 10 ul de 10 x tampon de ligase d'ADN T4 avec 10 mM d'ATP, 4 ul de 10 mM dNTP mix, 5 ul de T4 ADN polymerase (3 U / ul) , 1 ul d'ADN polymerase de Klenow (5 U / ul), et 5 ul de T4 polynucleotide kinase. Le volume total est de 100 pi. Mélangez bien avec une pipette. Évitez mousse et de bulles.
    2. Incuber à 20 ° C pendant 30 min.
    3. Purifier l'ADN avec des kits de purification de PCR ou des billes SPRI selon le protocole du fabricant. Eluer ADN dans du tampon EB 33 ul. L'éluat final est d'environ 32 & #181; l.
  3. Ajouter surplombs "A"
    1. Mettre en place une réaction sur la glace avec l'éluat de 3.2.3, tampon de 5 ul 10x Klenow, 10 pi 1 mM dNTP, et 3 ul Klenow (3 '→ 5' exo) (5 U / pl). Le volume total est de 50 pi. Mélangez bien avec une pipette. Évitez mousse et de bulles.
    2. Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
    3. Purifier l'ADN avec des kits de purification de PCR ou des billes SPRI selon le protocole du fabricant. Eluer ADN dans du tampon EB 22 ul. L'éluat final est d'environ 21 ul.
  4. Adaptateurs de séquençage Ligaturer
    1. Préparer adaptateurs de séquençage 28.
      1. Remettre en suspension de chaque oligo adaptateur à une concentration de 100 uM dans 10 mM de Tris-Cl (pH 7,8), EDTA 0,1 mM (pH 8,0) et NaCl 50 mM.
      2. Mélanger des volumes égaux de l'adaptateur universel 28 et un adaptateur 28 indexée.
      3. Recuire les adaptateurs dans un cycleur thermique avec les éléments suivantsprogramme: 95 ° C pendant 2 min; 140 cycles de 30 s à partir de 95 ° C et en diminuant de 0,5 ° C à chaque cycle; maintenir à 4 ° C.
      4. Adaptateurs aliquotes et conserver à -20 ° C.
    2. Mettre en place une réaction sur de la glace avec de l'éluat 3.3.3, 25 ul de tampon de ligature 2x, 1,5 ul de 50 uM recuits adaptateurs de séquençage (décongelés sur de la glace) et de 2,5 pi 3.4.1.4 ADN ligase de T4. Mélangez bien avec une pipette. Évitez mousse et de bulles. Si séquençage multiplex est souhaitée, utiliser un autre adaptateur indexée pour chaque échantillon.
    3. Incuber à température ambiante pendant 1 heure.
    4. Purifier l'ADN avec des kits de purification de PCR ou des billes SPRI selon le protocole du fabricant. Eluer ADN dans du tampon EB 24 ul. L'éluat final est d'environ 23 ul.
  5. Autre adaptateurs en forme de Y à ADN double brin pour permettre de déterminer avec précision fragment d'ADN de tailles 28
    1. Mettre en place une réaction sur la glace avec l'éluat de 3.4.4, 12,5 pi H 2 O, 1 pl 25 uM amorce 1 28, 1 pl 25 uM amorce 2 28, 1,5 pl 10 mM dNTP, Tampon PCR 5x 10 pi et de 1 pl de l'ADN polymérase (1 U / pl).
    2. Exécuter la PCR comme suit: 95 ° C pendant 3 min; 5 cycles de 98 ° C pendant 15 sec, 63 ° C pendant 30 sec, 72 ° C pendant 30 s; 72 ° C pendant 1 min; 4 ° C en attente.
    3. Purifier l'ADN avec des kits de purification de PCR ou des billes SPRI selon le protocole du fabricant. Eluer ADN dans du tampon EB 11 ul. L'éluat final est d'environ 10 ul.
  6. Taille sélectionner la bibliothèque
    1. Préparation d'un gel d'agarose à 2% avec du tampon TAE 1X. Ajouter du bromure d'éthidium (ATTENTION!) À une concentration finale de 500 ng / ml, lorsque la solution TAE-agarose fondu est refroidi afin d'éviter l'inhalation de bromure d'éthidium. Assurez-vous d'avoir suffisamment de pistes pour tous les échantillons, échelle d'ADN et les ruelles vides.
    2. Ajouter 8 pi 6x colorant de charge à l'éluat de 3.5.3.
      3. <li> Préparez échelle d'ADN de 1 kb en plus de mélange échelle d'ADN (1,0 ug / ul), 6x colorant de chargement et H 2 O dans un rapport de 1: 1: 4.
    3. Charge 6 pi échelle d'ADN, les échantillons provenant de 3.6.2 et une autre échelle d'ADN de 6 pi, chacun dans une voie séparée et avec au moins une voie vide à partir des échantillons / échelles adjacentes.
    4. Exécutez le gel à 120 V pendant 60 min.
    5. Afficher le gel sur un transilluminateur UV (minimiser le temps d'exposition aux UV). Porter des lunettes de sécurité et un écran facial. Assurez-vous au moins une des échelles d'ADN bien fonctionner avec un espacement approprié (assez pour exciser 3 tranches de gel) entre 300 pb et 400 pb bandes. Affiner espacement augmente les difficultés pour exciser plusieurs tranches de gel, tandis que l'espacement large augmente le volume de tranches de gel excisés.
    6. Utilisez un nouveau scalpel ou une lame de rasoir pour chaque voie. Accise trois fines tranches de gel entre 300 et 400 pb de chaque voie (Figure 4) et les placer chacun dans un tube à centrifuger. Gardez le volume de chaque gel spoux aussi bas que possible (<100 pi).
    7. Mesurez le volume de chaque tranche de gel (1 gel de pi pèse environ 1 mg), ajouter des volumes de tampon 6x QG et incuber à 50 ° C.
    8. Vortex le mélange QG-gel tous les 2-3 min jusqu'à ce que la tranche de gel soit complètement dissous. Ajouter volumes de gel 2x de l'isopropanol et mélanger.
    9. De cette étape, suivre le protocole à partir de kits d'extraction de gel. Eluer ADN dans du tampon EB 51 ul. L'éluat final est d'environ 50 ul.
  7. Enrichir adaptateur modifié fragments d'ADN de séquençage
    1. Optimiser le nombre de cycles de PCR 29.
      1. Mettre en place une réaction sur la glace avec 1 ul éluat de 3.6.10, 1 pl 25 uM amorce 1 28, 1 pl 25 uM amorce 2 28, 7 pi H 2 O et 10 pi SYBR Green Supermix. Le volume total est de 20 pi.
      2. Exécuter la qPCR comme suit: 95 ° C pendant 3 min; 20 cycles de 95 ° C pendant 30 sec, 63 ° C pendant 30 secondes, sept2 ° C pendant 30 secondes, la plaque lire.
      3. Analyser les données en utilisant un logiciel d'analyse qPCR et de déterminer le cycle de quantification (CQ) ou Seuil cycle (Ct) pour chaque échantillon en utilisant le protocole du fabricant. Continuer avec les échantillons qui ont Cq / Ct ≤ 14. Utilisez le CQ maximale (CQ 0) moins 1 (arrondi à l'entier supérieur) que le nombre de cycles PCR final (N PCR).
      4. Ajuster les quantités de matrices d'ADN de sorte que les différents échantillons seront amplifiés à des quantités approximativement égales après avoir exécuté le même nombre de cycles de PCR. Utilisation gabarit 8 ul de l'échantillon avec la plus haute Cq (0 Cq), et de calculer le volume de la matrice d'autres échantillons ayant la formule suivante:
        Vol i = 8 x 1,8 Cq i -cq 0
    2. Mettre en place des réactions de PCR sur la glace avec les volumes de modèles calculés à partir 3.7.1.4: 1 pi 25 uM amorce 1 28, 1 pl 25 uM amorce 2 28, 1.5ul de dNTP 10 mM, 10 ul de tampon 5x, 1 ul d'ADN polymerase (1 U / ul) et le remplir avec H 2 O pour obtenir un volume total de 50 ul.
    3. Exécuter la PCR comme suit: 95 ° C pendant 45 s; N cycles de PCR (déterminées 3.7.1.3) de 98 ° C pendant 15 s, 63 ° C pendant 30 sec, 72 ° C pendant 30 s; 72 ° C pendant 1 min; 4 ° C en attente.
    4. Analyser les 5 produits de PCR ul dans un gel d'agarose à 2% (Figure 5A). Une bande claire "single" indique que les fragments d'ADN amplifiés sont dans une gamme de longueur étroite et que la banque d'ADN peut être soumis à une analyse plus poussée.
    5. Répéter une réaction pour les échantillons sélectionnés et mettre en commun les bibliothèques d'ADN amplifiés à partir du même échantillon.
    6. Purifier banques d'ADN sélectionnés pour le séquençage.
      1. Si les dimères d'amorce / adaptateur ne sont pas visibles dans 3.7.4, purifier banques d'ADN avec des kits de purification de PCR ou des billes SPRI selon le protocole du fabricant. Eluer ADN dans du tampon EB 21 ul. leéluat final est d'environ 20 ul. Si l'installation de séquençage de l'utilisateur contient des instructions spécifiques sur le tampon d'élution, le volume final, etc., préparer des échantillons en conséquence.
      2. Si dimères amorce / adaptateur sont clairement visibles dans 3.7.4, purifier les bibliothèques comme suit.
        1. ADN Load from 3.7.5 et l'ADN Ladder dans un gel d'agarose préfabriqué de 2%. Les échantillons peuvent être purifiés comme décrit dans l'3.7.6.1 pour réduire le volume ou peut être chargée dans des puits multiples. Placez le gel d'agarose dans un système d'alimentation appropriée. Laisser le gel de fonctionner pendant 15 min.
        2. Utilisation d'un transilluminateur échéant, découper la bande souhaitée avec un scalpel propre / rasoir pour chaque échantillon et placer la tranche de gel dans un tube de 1,5 ml.
        3. Isoler l'ADN en utilisant des kits d'extraction de gel selon le protocole du fabricant avec deux modifications: incuber mélange QG-gel tampon dans un thermo-mélangeur à 37 ° C et 1 000 rpm pendant 30 min, et ajouter des volumes de gel 2x d'isopropanol.
  8. Proposez bibliothèques d'ADN purifiés à une installation de séquençage. Suivez toutes les directives de l'établissement.
    Remarque: Une analyse de la qualité d'un bioanalyseur (figure 5B) doit être réalisée avant le séquençage afin de déterminer la plage de taille exacte et la concentration d'une banque d'ADN.

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Representative Results

La protéine de fusion Dam-V5-LMNB1 a été vérifiée pour être co-localisé avec le protéine endogène Lamin B par immunofluorescence (Figure 1).

L'amplification par PCR réussie de fragments d'ADN adénine-méthylé est une étape clé pour DamID-seq. Les échantillons expérimentaux devraient amplifier un frottis de 0,2 - 2 ko, tandis que les contrôles négatifs (sans Dpnl, sans ligase ou sans matrice PCR) devrait entraîner aucune ou nettement moins-amplification (Figure 2).

Les fragments d'ADN méthylées sont dans la gamme de 0,2 à 2 kb, tandis que la taille de l'insert souhaité pour une bibliothèque NGS est de 200 à 300 pb. Par conséquent, il est essentiel de fragmenter les produits de PCR de méthyle dans la gamme de taille appropriée. Néanmoins, il a été trouvé peu pratique à rompre simultanément de plus grands fragments d'ADN de taille appropriée vers le bass et de garder la majorité des petits fragments d'ADN intacts dans une durée de fragmentation unique. Par conséquent, des expériences de décours temporel ont été effectuées pour déterminer le temps minimal (T 0.2kb) nécessaire pour le fragment 1 pg d'ADN à un frottis centrée à 200 pb (figure 3). Ensuite, 6 durées de temps par incréments égaux ont été sélectionnés entre 5 min et T 0.2kb pour la fragmentation réelle. L'activité enzymatique des ADN double brin Fragmentase peut varier d'un lot à l'autre et peut diminuer au fil du temps, il est donc recommandé de répéter cette étape pour un nouveau lot de Fragmentase ou après stockage pendant une période de temps.

La taille de l'insert désiré est comprise entre 200 et 300 pb correspondant à des fragments d'ADN entre 300 et 400 pb (y compris les adaptateurs de séquençage 121 pb) sur le gel d'agarose. Trois tranches minces dans cette gamme ont été excisées chaque échantillon expérimental pour réduire la gamme de taille d'une bibliothèque et d'accroître la possibilitéd'obtention d'au moins une bibliothèque de séquençage qualifié (figure 4).

Une partie aliquote de 5 ul de chacune des bibliothèques d'ADN amplifié a été analysé sur gel d'agarose afin de déterminer quelle bibliothèque peut être admissible pour le séquençage. Comme le montre la figure 5A, une seule bande claire de la même taille que la tranche de gel excisée doit être visible sur le gel d'agarose (étape 3.7.4). Ensuite, les bibliothèques sélectionnées ont été examinées par un Bioanalyzer (figure 5B) pour déterminer la portée et les concentrations de taille exacte avant le séquençage. Si vous le souhaitez, les bibliothèques d'ADN amplifiés peuvent être directement examinés par un Bioanalyzer sans analyse de gel. Lorsque plusieurs bibliothèques sont de bonne qualité, il est recommandé de séquencer les bibliothèques de taille similaire gammes pour une paire de expérimentaux (cellules exprimant Dam-V5-POI) et de contrôle (cellules exprimant V5-Dam) échantillons.

Le court lectures généré parsystèmes de séquençage ont d'abord été mappés vers le génome correspondante. Unique aligné lectures ont ensuite été transmis à des analyses ultérieures. Un pipeline pour traiter à court lit, construire une interaction carte du génome-NL et d'analyser les associations de gènes-NL ont été décrits en détail dans notre travail précédent 10. Les résultats représentatifs sont présentés sur la figure 6.

Figure 1
Figure 1. Validation localisations subnucléaires de protéines de fusion par immunofluorescence. IMR90 cellules de fibroblastes de poumon humain ont été transfectées de manière transitoire avec un plasmide exprimant Dam-V5-LMNB1 et ont été colorées par anti-lamine B (A, rouge) et anti-V5 (B, vert). (C) Fusionner des images en A et B. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de tsa figure.

Figure 2
Figure 2. l'amplification PCR des fragments d'ADN adénine-méthylé. Une partie aliquote de 5 ul de chaque réaction de PCR a été analysé sur un gel d'agarose à 1%. Un frottis allant de 0,2 à 2 Ko a été amplifié à partir de chaque échantillon expérimental, mais pas d'amplification a été observée dans les contrôles négatifs (pas Dpnl à l'étape 2.1, pas de ligase à l'étape 2.2, ou pas de modèle de PCR). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3. La détermination des durées optimales de fragmentation. Les produits de PCR purifiés de méthyle ont été soumis à une fragmentation pour des durées de 5 à 55 min à un incrément de 10 min (ADN non digéré , Étiquetés comme "0 min"). 1 pg d'ADN et échelle de 0,5 pg de chaque échantillon d'ADN fragmenté ont été analysés sur un gel d'agarose. Le temps minimal de digérer la plupart des frottis d'ADN à environ 200 paires de bases a été déterminée comme étant de l'ordre de 35 min, par conséquent six durées de temps espacés de façon égale entre 5 et 35 min (5 et 35 min inclus) ont été choisies pour effectuer la fragmentation réelle. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Taille sélection des banques d'ADN. Des échantillons d'ADN de Dam-V5-LMNB1 et V5-Dam provenant de l'étape 3.6 a été exécuté sur un gel d'agarose à 2%, et trois tranches de gel de taille égale (L, M et H correspondant à basse, moyenne et riche en taille) ont été excisées entre 300 et 400 pb, comme illustré par les lignes jaunes. om / files / ftp_upload / 53620 / 53620fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. bibliothèques ADN amplifié pour le séquençage à haut débit. (A) Amplified banques d'ADN analysés sur un gel d'agarose. Modèles PCR ont été purifiés à partir de tranches de gel indiquées sur la figure 4. (B) les résultats de la bioanalyse échantillon V5-Dam (L) et l'échantillon Dam-V5-LMNB1 (L) qui ont été souligné dans (A). Ces deux bibliothèques ont les gammes de taille similaire étroite et donc qualifié pour le séquençage à haut débit. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 6. données de l'END affichées dans UCSC navigateur génome. Chromosomique souris 1 est montrée comme un exemple. Les données de séquence ont été produites à partir de myoblastes C2C12 de souris 10. Pistes "MB.LmnB1.w2k" et "MB.Dam.w2k", correspondant à des données provenant de cellules exprimant Dam-V5-LMNB1 et V5-Dam, respectivement, tracé normalisé densités de lecture (lecture par kilobase par million mappé unique lit, ou RPKM ) en non-chevauchement des fenêtres consécutives 2 ko long du chromosome. TRACK terrains "MB.log2FC.w2k« associations génome-NL, soit log2 RPKM ratios de LMNB1 sur la digue, à une résolution de 2 ko. Track "MB.sLADs" Peintures Lamina domaines associés basée séquençage (slads, à savoir les régions génomiques qui ont des densités plus élevées de lecture de LMNB1 sur la digue avec une signification statistique) en noir, non-slads dans les régions grises et indéterminées en blanc. S'il vous plaît cliquez ici pour downloaD ce fichier.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ViraPower Lentiviral Expression Systems Life Technologies K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20
Gateway BP Clonase II Enzyme Mix Life Technologies 11789-020
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Life Technologies 11791-020
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) QIAGEN 69506 or 69504  
Gateway pDONR 201 Life Technologies 11798-014
293T cells American Type Culture Collection CRL-11268
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Life Technologies 25300-054
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995-065
Fetal Bovine Serum Sigma F4135
Tris brand not critical
EDTA brand not critical
200 Proof EtOH brand not critical
Isopropanol brand not critical
Sodium Acetate brand not critical
DpnI New England Biolabs R0176 supplied with buffer
DamID adaptors "AdRt" and "AdRb" Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation.
T4 DNA Ligase Roche Life Science 10481220001 supplied with buffer
DpnII New England Biolabs R0543 supplied with buffer
DamID PCR primer "AdR_PCR" Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 24
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set New England Biolabs N0446 100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP
Advantage 2  Polymerase Mix Clontech 639201 supplied with buffer
1Kb Plus DNA Ladder Life Technologies 10787018 1.0 µg/µl
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104 or 28106
MinElute PCR Purification Kit QIAGEN 28004 or 28006 for an elution volume of less than 30 µl
SPRI beads / Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63880 apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used
Buffer EB QIAGEN 19086
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348 supplied with buffer
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England Biolabs B0202
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment New England Biolabs M0210
T4 Polynuleotide Kinase New England Biolabs M0201
Klenow Fragment (3’ → 5’ exo-) New England Biolabs M0212 supplied with buffer
sequencing adaptors Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 28
Quick Ligation Kit New England Biolabs M2200 used in 3.4.3; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase
sequencing primer 1 and 2 Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 28
KAPA HiFi PCR Kit Kapa Biosystems KK2101 or KK2102 supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10 mM dNTP mix
agarose Sigma Aldrich A4679
ethidium bromide Sigma Aldrich E1510-10ML 10 mg/ml
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704 or 28706
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad Laboratories 1725121 or 1725122
Spectrophotometer brand not critical
0.45 μm PVDF Filter brand not critical
25 ml Seringe brand not critical
10 cm Tissue Culture Plates brand not critical
6-well Tissue Culture Plates brand not critical
S1000 Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories for qPCR
Vortex Mixer brand not critical
Dry Block Heater or Thermomixer brand not critical
Microcentrifuge brand not critical
Gel electrophoresis system with power supply brand not critical
Magnet stand for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical
UV transilluminator brand not critical
E-gel electrophoresis system Life Technologies G6400, G6500, G6512ST

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References

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DamID-seq: L&#39;échelle du génome Cartographie des protéine-ADN Interactions par séquençage à haut débit de fragments d&#39;ADN adénine-méthylé
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Wu, F., Olson, B. G., Yao, J. DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments. J. Vis. Exp. (107), e53620, doi:10.3791/53620 (2016).

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