Summary
我々は、高スループットシーケンシング（DamID-SEQ）に、DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ識別（DamID）を結合することにより、本明細書のアッセイを説明します。この改良された方法は、より高い解像度、より広いダイナミックレンジを提供し、可能にする等のChIP-seqの、RNA-配列などの他のハイスループットシークエンシングデータと併せてDamID、配列データを分析します
Introduction
DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ識別（DamID）1,2 は 、in vivoでのタンパク質-DNA相互作用を検出するための方法であり、クロマチン免疫沈降（チップ）3の代替的なアプローチです。それは、細胞の比較的少量を使用して、DNAまたは高度に特異的な抗体を用いてタンパク質の化学的架橋を必要としません。標的タンパク質が緩くまたは間接的にDNAと関連している場合、後者は特に便利です。 DamIDが正常核膜タンパク質4-10、クロマチン関連タンパク質11-13、クロマチン修飾酵素14、転写因子および15-18補因子とのRNAi機械19を含む種々のタンパク質の結合部位をマッピングするために使用されています。この方法は 、Sを含む複数の生物に適用可能ですセレビシエ 13、S。ポンベ 7、C。エレガンス 9,17、D。ショウジョウバエ 5,11,18、20、A。シロイヌナズナ 21,22と同様に、マウスおよびヒト細胞株6,8,10,23,24。
DamIDアッセイの開発は、内因性アデニンメチル化2を欠く真核細胞におけるアデニンメチル化DNA断片の特異的検出に基づいていました。関心及びEの DNA結合タンパク質からなる発現された融合タンパク質、 大腸菌のDNAアデニンメチルトランスフェラーゼ（ダム）、ゲノム2中のタンパク質の結合部位に空間的に近接（最も重要な1キロバイト内およびおよそ5キロバイトまで）であるGATC配列中のアデニン塩基をメチル化することができます。修飾されたDNA断片は、特に関心1,25,26のタンパク質のゲノム結合部位を検出するためのマイクロアレイにハイブリダイズし、増幅することができます。この元DamID方法は、マイクロアレイの可用性および所定のプローブの密度によって制限されていました。そこで我々は、高スループットシーケンシングを統合していますDamID 10へとDamID-seqのような方法を指定。 DamID-配列から生成された読み取り、短い多数のゲノムワイドタンパク質-DNA相互作用の正確な位置を可能にします。我々はDamID-seqはゲノム核ラミナ（NL）団体10を研究するためのマイクロアレイによってDamIDよりも高い解像度と広いダイナミックレンジを提供することがわかりました。この改良された方法は、遺伝子構造10内NL関連付けをプロービングでき、このようなチップ-seqの、そしてRNA-seqのような他のハイスループット配列決定データとの比較を容易にします。
ここで説明するDamID-seqのプロトコルでは、最初にマッピングゲノム-NL団体10のために開発されました。我々は、Eに 、マウスまたはヒトのラミンB1を係留することによって融合タンパク質を生成しました大腸菌のDNAアデニンメチルトランスフェラーゼとは、C2C12マウス（データは公開されません）10とIMR90ヒト胎児肺線維芽細胞を筋芽細胞、3T3マウス胚線維芽細胞内のプロトコルをテストしました。このプロトコルでは、我々は、cで始まりますベクターonstructingおよび哺乳動物細胞24にレンチウイルス感染によってダム係留融合タンパク質を発現します。次に、我々は、アデニンメチル化DNA断片を増幅し、他の生物に適用可能であるべきであるシーケンシングライブラリーを調製の詳細なプロトコルを記述します。
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Protocol
1.生成および融合タンパク質とフリーダムタンパク質の発現
- DamIDベクターに目的のタンパク質を複製します。
- 製造業者のプロトコルに従って、所望の高忠実度DNAポリメラーゼおよび適切なプライマーを使用して、目的のタンパク質のcDNAの（POI）を増幅します。実験インサートの適切な増幅を確実にするために最適な増幅条件を決定します。
- アガロースゲルを実行し、製造業者のプロトコルに従ってゲル抽出キットによりPOIの増幅したcDNAを精製します。
- 製造業者のプロトコルに従って、BPクロナーゼIIを使用してpDONR201ベクターへのPOIのクローンのcDNA。
- POIを融合の所望の方向に応じて、製造業者のプロトコルに従って、LRクロナーゼIIを使用してpLGW-RFC1-V5-EcoDamデスティネーションベクターまたはpLGW-EcoDam-V5-RFC1デスティネーションベクター27へのドナーベクターからPOIのcDNAのクローンを作成N末端または番目にEの E C末端大腸菌のDNAアデニンメチルトランスフェラーゼ（EcoDam）27。
- クローニングされたcDNAは、インフレーム融合EcoDamに正しい順序と形式があり、配列決定により確認してください。
- レンチウイルス株を生成します。
- レンチウイルス発現系を用いて、（pLGW-V5-EcoDamベクトル27から ）ダム-V5-POIとV5-ダムを発現しているレンチウイルス株を生成します。製造業者のプロトコルに従って、前方のトランスフェクション手順を使用します。
- トランスフェクションのための製造業者のプロトコルに従って、レンチウイルス株を生成するために、293T細胞およびリポフェクションを使用してください。
- 0.45μmのPVDFフィルターの工程を含みます。
- レンチウイルス発現系を用いて、（pLGW-V5-EcoDamベクトル27から ）ダム-V5-POIとV5-ダムを発現しているレンチウイルス株を生成します。製造業者のプロトコルに従って、前方のトランスフェクション手順を使用します。
- レンチウイルスを細胞に感染します。
- 感染（0日目）の前日に、抗生物質を含まない同じ増殖培地を用いて、6ウェル組織培養プレートにこの細胞型に適切な増殖培地中で培養した接着細胞を渡します感染の日に50％コンフルエンスを達成。 37℃のインキュベーター中で細胞を配置します。
- 感染症（1日目）の日に、解凍する37℃の水浴中でCの冷凍庫と場所-80からダム-V5-POIとV5-ダムレンチウイルス上清の両方の2クライオバイアルを取り外します。
- 細胞から増殖培地を取り出して、抗生物質を含まない新鮮な増殖培地0.5mlで置き換えます。
- （V5-ダムとダム-V5-POIとの2ウェルを有する2つのウェル）を各ウェルに解凍したレンチウイルスの1ミリリットルを追加します。負の対照となる残りの2つのウェル-これに抗生物質を含まない増殖培地の1ミリリットルを追加します。穏やかに混合し、37℃のインキュベーターO / Nに戻って配置する6ウェルプレートを横に振ります。
- 感染症（2日目）の翌日には、細胞からのウイルス懸濁物を除去し、抗生物質を含まない2ミリリットルの増殖培地と交換してください。バック48時間37℃のインキュベーター中で細胞を配置します。
- gDNAを分離してください。
- 各ウェルドから吸引するメディア250μlの0.05％トリプシン-EDTAを用いて、タコ細胞。 2分間37℃でインキュベートします。
- 1.5mlの微小管に各ウェルから1ミリリットルの増殖培地とピペット細胞をプレートから細胞を洗浄。 RTで5分間、200×gで遠心分離して細胞をペレット化。
- 室温で2分間、200×gでペレット化し、500μlのPBSで細胞と遠心分離を洗ってください。
- 200μlのPBSでペレット化した細胞を再懸濁します。
- 製造業者のプロトコルに従って、血液および組織キットによってのgDNAを分離します。 200μlのBuffer AEで溶出のgDNAおよび分光光度計を用いてOD 260を測定して濃度を決定します。
注：未感染またはモック感染細胞からのgDNAを陰性対照として単離することができます。長期保存のためのより高い濃度までのgDNAを沈殿させます。- 100％エタノール3容量の3 M酢酸ナトリウム（pH5.5）の0.1容量を追加し、チューブを4~6回転倒混和します。
- -20°のCO / Nで保存します。
- 16,000 xでの遠心分離4℃で15分間、G。
- 注意深く上清を除去します。 4℃で5分間、16,000×gで70％（体積/体積）エタノール、遠心分離でペレットを洗浄します。
- 注意深くエタノールを除去し、室温で3分間空気乾燥したペレットを可能にします。
- /μlの約1μgのにT 10 E 0.1（pHは7.5）でのgDNAを溶かします。各実験試料または陰性対照からプールのgDNAと濃度を測定。 -20℃で保存してください。
2.アデニンメチル化DNA断片を増幅
- 唯一のアデニンメチル化GATCsをカットDpnIでダイジェストのgDNA。
- 2.5μgのgDNAを、1μlの10倍バッファー、0.5μlのDpnIの（20 U /μl）を氷上で反応を設定し、10μlの総体積に、H 2 Oで埋めます。そして2ワット（0.5μlのH 2 OでDpnIのを置き換え、「なしをDpnI」）をDpnIことなく、1 -それぞれのgDNAサンプルについて、3つの反応を準備（「DpnIで」）をDpnI番目。
- 37℃でのダイジェストO / Nおよび80℃で20分間をDpnIを不活性化します。
- DamIDアダプターを連結。
- DamIDアダプタを準備します。
- 100μMの最終濃度までH 2 Oで2 DamIDアダプターオリゴ24のそれぞれを再懸濁します。
- 、2 DamIDアダプターオリゴの等体積を組み合わせ混合し、密閉チューブに配置します。 90℃の水を満たしたビーカー内のラックと場所に座って、パラフィルムでチューブを密封。チューブのキャップ下の水位を保つが、オリゴミックスの表面の上（チューブに入る水を避けるため）。
- そうアダプタアニールをゆっくりと室温に水を低温にしてみましょう。
- -20℃でのアニールアダプタ（50μM）およびストアを等分。
- 氷上で反応を設定します。 2.1.2から各チューブに、6.2μlのH 2 Oを追加し、2μlの10倍ライゲーション緩衝液、0.8μlの50μMDamID広告aptors（ 氷上で解凍 ）、および1μlのT4 DNAリガーゼ（5U /μL）。総容量は20μlです。チューブ「DpnIで「二つのうちの一つで、1μlのH 2 O（「なしリガーゼ」）とのリガーゼを置き換える各gDNAのサンプルが2つの負のコントロールがあることに注意してください- 。 "ノーをDpnI」と「無リガーゼを」。
- 16℃でライゲートO / N、10分間65℃でリガーゼを不活性化します。
- DamIDアダプタを準備します。
- 非メチル化GATCsが含まれている断片を破壊することをDpnIIでDNAを消化。
- 氷上で反応を設定します。 2.2.3から各チューブに、24μlのH 2 O、5μlの10倍をDpnII緩衝液及び1μlのをDpnII（10 U /μl）を追加します。総容量は50μlです。
- 2〜3時間、37℃で消化し、20分間65℃でのDpnIIを不活性化します。
- アデニンメチル化DNA断片を増幅します。
- 2.3.2から5μLをDpnII消化、5μと氷の上での反応を設定しますリットルの10×PCR緩衝液、12.5μlの5μMDamID PCRプライマー24、4μlの10 mMのdNTPミックス、1μlの50×ポリメラーゼミックス22.5μlのH 2 O総容量は50μlです。
- 次のように、PCRを実行します。68℃を10分間。 1分間94℃、5分間、65℃で、15分間68°C。 1分、1分、65℃、10分間、68°C、94°Cの4サイクル。 1分、1分、2分68℃65℃94℃の17サイクル。
- 1％アガロースゲル上の各反応から5μlのPCR産物を分析します。 PCR産物を0.2から2キロバイト（ 図2）までのスメアとして表示されます。 「いいえDpnIの "と"ノーリガーゼ」のコントロールはありません持っているか、明確に少ない増幅する必要があります。
- ステップ2.4.3の結果が良好であれば、実験サンプルと2つの負のコントロールごとに1つの反応のための2つまたは3つの反応で2.4.1-2.4.3の手順を繰り返します。
- 同じからのPCR産物をプールし、精製し製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたは固相可逆固定（SPRI）ビーズを用いた実験サンプル。 「何をDpnI」または「noリガーゼ」のコントロールを浄化しません。バッファーEBでDNAを溶出します。
- 周りには0.1μg/μL以上である必要があり、分光光度計を使用して、OD 260を測定することにより、精製されたDNAの濃度を測定します。各サンプルの10μgのDNAの最小値を収集します。 PCR精製キットを使用している場合は、1列にそれぞれ50μlのPCR産物を精製し、30μlのBuffer EBで溶出し、溶出液をプール。
- 配列決定されることからDamID PCRプライマーを防止するためにをDpnIIでDNAを消化し ます。
- 2.4.6から5μgの精製されたDNA、5μlの10倍をDpnII緩衝液、1μlのをDpnII（10 U /μl）を氷上で反応を設定し、全量50μlに、H 2 Oで埋めます。各サンプルのための2つまたは3つの反応を準備します。
- 2〜3時間、37℃でダイジェスト、20分間65℃をDpnIIを不活性化。
- 製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはSPRIビーズと同じサンプルからダイジェストをプールし、精製します。バッファーEBでDNAを溶出します。
- 周り0.06μgの/μL以上でなければならない精製されたDNAの濃度を測定します。各サンプルの6μgのDNAの最小値を収集します。 PCR精製キットを使用している場合は、各50μlを1列に消化精製し、30μlのBuffer EBで溶出し、溶出液をプール。
ハイスループットシーケンシング3.ライブラリの準備
- DNA断片化
- 実験的に二本鎖DNA Fragmentaseの各新しいバッチのための適切な消化時間を決定します。酵素活性のような新しい実験を行う前にテストを繰り返し、時間の経過とともに低下することがあります。実際の断片化のために2.5.4からDNAを保存するには、以前のexperimeから2.4.6または余分なDNAから精製されたメチルPCR産物を使用この段階でNTS。
- 6μgのDNAとマスターミックス、12μlの10倍Fragmentaseバッファを設定し、114μlの総体積に、H 2 Oで埋めます。
- 渦3秒間Fragmentaseストックバイアル、マスターミックスに6μlを添加し、3秒のためのマスターミックスをボルテックス。総容積は120μlです。
- 小分け5新しい管のそれぞれにマスターミックス20μlの。 10分の増分で5〜55分間37℃で、すべての6のチューブをインキュベートします。反応を停止する5μlの0.5 M EDTAを追加します。
- 12.5μlの各反応の（0.5μgのDNAの）だけでなく、アガロースゲル（ 図3）の0.5μgの未消化のDNAを消化分析します。周り0.2キロバイトにスミアの大半を消化するために必要な最小限の時間（Tの0.2キロバイト）を決定します。実際の断片化のために等しい増分で（5分およびT 0.2キロバイトを含む）5分とT 0.2キロバイトの間の6時間分を選択します。
- 実際fragmenを設定3.1.1.1-3.1.1.3に記載されているようテーション。 3.1.1.4で求めた時間分、37℃で反応をインキュベートします。
- プール6反応し、製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはSPRIビーズとダイジェストを浄化します。 51μlのバッファーEBにDNAを溶出します。最終溶出液は、〜50μlのです。
- 実験的に二本鎖DNA Fragmentaseの各新しいバッチのための適切な消化時間を決定します。酵素活性のような新しい実験を行う前にテストを繰り返し、時間の経過とともに低下することがあります。実際の断片化のために2.5.4からDNAを保存するには、以前のexperimeから2.4.6または余分なDNAから精製されたメチルPCR産物を使用この段階でNTS。
- 断片化したDNAの修復が終了
- 3.1.3からの溶出液、25μlのHと氷の上での反応を設定し2 O、10μlの10 mMのATPと10倍のT4 DNAリガーゼ緩衝液、4μlの10mMのdNTPミックス、5μlのT4 DNAポリメラーゼ（3 U /μL） 、1μlのクレノウDNAポリメラーゼ（5U /μL）、および5μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼ。総容量は100μlです。ピペットでよく混ぜます。泡と泡を避けてください。
- 30分間20℃でインキュベートします。
- 製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはSPRIビーズにDNAを精製します。 33μlのバッファーEBにDNAを溶出します。最終溶出液は、32〜＆＃です181;リットル。
- 「A」オーバーハングを追加
- 3.2.3からの溶出液と氷上での反応、5μlの10倍クレノウ緩衝液、10μlの1 mMののdNTP、および3μlのクレノウ（3 '→5'エキソ）（5 U /μl）を設定します。総容量は50μlです。ピペットでよく混ぜます。泡と泡を避けてください。
- 30分間37℃でインキュベートします。
- 製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはSPRIビーズにDNAを精製します。 22μlのバッファーEBにDNAを溶出します。最終溶出液は〜21μlです。
- ライゲーションシークエンシングアダプター
- シークエンシングアダプター28を準備します。
- 10mMのトリス塩酸（pHは7.8）、0.1mMのEDTA（pHは8.0）、50 mMのNaCl中の100μMの濃度に各アダプタオリゴを再懸濁します。
- ユニバーサルアダプタ28とインデックス付きアダプタ28の等量混ぜます。
- 以下でサーマルサイクラーにアダプターをアニールプログラム：95℃で2分間; 30秒、95℃で開始し、0.5℃、毎サイクルによって減少させるための140サイクル。 4℃で保持します。
- -20℃で小分けアダプタとストア。
- 3.4.1.4および2.5μlのT4 DNAリガーゼから（氷上で解凍）3.3.3からの溶出液と氷上での反応、25μlの2倍ライゲーション緩衝液、シークエンシングアダプターをアニール1.5μlの50μMを設定します。ピペットでよく混ぜます。泡と泡を避けてください。マルチプレックスシーケンシングが必要な場合は、各試料について異なるインデックス付きのアダプタを使用してください。
- 室温で1時間インキュベートします。
- 製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはSPRIビーズにDNAを精製します。 24μlのバッファーEBにDNAを溶出します。最終溶出液は〜23μlです。
- シークエンシングアダプター28を準備します。
- Y字アダプタ正確DNA断片の大きさ28を決定可能にするために二本鎖DNAに変換します
- 3.4.4からの溶出液を氷上で反応を設定し、12.5μlのH 2 O、1μlの25μMのプライマー1 28、1μlの25μMのプライマー2 28、1.5μlの10mMのdNTPを、10μlの5X PCR緩衝液および1μlのDNAポリメラーゼ（1U /μl）を。
- 次のように、PCRを実行します。95℃を3分間; 15秒、30秒、63℃、30秒間72℃、98℃の5サイクル; 1分間72°C;保留4°C。
- 製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはSPRIビーズにDNAを精製します。 11μlのバッファーEBにDNAを溶出します。最終溶出液は、約10μlのです。
- サイズは、ライブラリを選択
- 1×TAE緩衝液で2％アガロースゲルを準備します。溶融TAEアガロースソリューションは、エチジウムブロマイドの吸入を避けるために、冷却したときに500 ngの/ mlの最終濃度になるように臭化エチジウム（ 注意！）を追加します。すべてのサンプル、DNAラダーと空のレーンのための十分なレーンを持っていることを確認してください。
- 3.5.3からの溶出液に8μlの6×ローディング色素を追加します。 <李> 1の割合で1キロバイトプラスDNAラダー（1.0μgの/μl）を、6Xローディング色素とH 2 Oを混合することにより、DNAラダーを準備：1：4。
- 負荷6μlのDNAラダー、3.6.2からのサンプルと別の6μlのDNAラダー、それぞれ別々のレーンで、隣接するサンプル/はしごからの少なくとも1つの空のレーンを持ちます。
- 60分間、120Vでゲルを実行します。
- （紫外線への露出時間を最小限に抑える）UVトランスイルミネーター上でゲルを表示します。安全メガネ及びフェイスシールドを着用してください。 300 bpおよび400 bpのバンド間（3ゲルスライスを切り出すための十分な）適切な間隔とよく実行DNAラダーの少なくとも一つを確認してください。広い間隔を切り出したゲルスライスの体積が増加しながら、狭い間隔は、複数のゲルスライスを切り出しの困難を増加させます。
- 各レーンのための新しいメスやカミソリの刃を使用してください。消費税各レーンから300と400bpの間に3つの薄いゲル切片（ 図4）とマイクロ遠心チューブでそれらをそれぞれ配置します。各ゲルSのボリュームをキープできるだけ低いシラミ（<100μL）。
- 各ゲルスライスの量を測定する（1μlのゲルは、約1 mgの重さ）、QGバッファの6倍のボリュームを追加し、50℃でインキュベートします。
- ゲルスライスが完全に溶解するまでQG-ゲル混合物を2〜3分ごとにボルテックス。イソプロパノールの2倍ゲルボリュームを加え、混合します。
- この段階から、ゲル抽出キットからプロトコルに従ってください。 51μlのバッファーEBにDNAを溶出します。最終溶出液は、〜50μlのです。
- PCRサイクル29の数を最適化します。
- 3.6.10から1μlの溶出液を、1μlの25μMのプライマー1 28、1μlの25μMのプライマー2 28、7μlのH 2 Oおよび10μlのSYBRグリーンスーパーミックスと氷の上での反応を設定します。総容量は20μlです。
- 以下のように定量PCRを実行します。95℃を3分間; 30秒間95℃の20サイクル、30秒間63℃、730秒間2℃、プレート読み取り。
- qPCR分析ソフトウェアを用いてデータを分析し、製造業者のプロトコルを使用して、各サンプルの定量化サイクル（CQ）、または閾値サイクル（CT）を決定します。最終的なPCRサイクル数（N PCR）としてはCq / CT≤14.最大Cqを（CQ 0）マイナス1（次に高い整数に切り上げ）を持つサンプルを続行します。
- 異なるサンプルは、PCRサイクルの同じ数を実行した後にほぼ等しい量に増幅されるように、DNAテンプレートの量を調整します。最高はCq（CQ 0）でサンプル8μlのテンプレートを使用して、以下の式で他のサンプルのテンプレート量を計算します。
第 I巻= 8×1.8 Cqを私は 0を -cq
- 1μlの25μMのプライマー1 28、1μlの25μMのプライマー2 28、1.5：3.7.1.4から計算テンプレートボリュームと氷上でのPCR反応を設定しますμlの10 mMのdNTPを、10μlの5×バッファー、1μlのDNAポリメラーゼ（1 U /μL）と、総容量50μlに、H 2 Oで埋めます。
- 次のように、PCRを実行します。95℃を45秒間、 N PCRサイクルは、15秒、30秒、63℃、30秒間72℃、98℃の（3.7.1.3で決定）。 1分間72°C;保留4°C。
- 2％アガロースゲル（ 図5A）に5μlのPCR産物を分析します。明確な「シングル」のバンドが増幅されたDNA断片が狭い長さの範囲内にあり、DNAライブラリーは、さらなる分析を受けることができることをことを示しています。
- 選択されたサンプルのための1つの反応を繰り返し、同じサンプルから増幅したDNAライブラリーをプール。
- 配列決定のため選択されたDNAライブラリーを精製します。
- プライマー/アダプターダイマーは3.7.4で表示されていない場合は、製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはSPRIビーズとDNAライブラリーを精製します。 21μlのバッファーEBにDNAを溶出します。ザ・最終溶出液は〜20μLです。ユーザーのシーケンシング機能が溶出バッファー、最終容量などの具体的な手順がある場合は、それに応じてサンプルを調製します。
- プライマー/アダプターダイマーは、3.7.4にはっきりと見える場合は、次のようにライブラリを浄化します。
- 2％プレキャストアガロースゲル中の3.7.5からの負荷のDNAとDNAラダー。容積を低減するために3.7.6.1に記載または複数のウェルにロードすることができるように、サンプルを精製することができます。適切な電源システムでアガロースゲルを置きます。ゲルを15分間実行を許可します。
- 適切なトランスイルミネーターを用いて、各サンプルのクリーンメス/かみそりで所望の帯域をカットし、1.5 mlのマイクロ遠心チューブにゲルスライスを配置します。
- 2つの変更で、製造業者のプロトコールに従ってゲル抽出キットを用いてDNAを分離：37℃のサーモミキサーでバッファQG-ゲル混合物をインキュベートし、30分間1,000rpmで、イソプロパノールの2倍ゲルボリュームを追加します。
注：バイオアナライザー（ 図5B）によって品質分析は、正確なサイズ範囲及びDNAライブラリーの濃度を決定するために、配列決定前に行うべきです。
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Representative Results
ダム-V5-LMNB1融合タンパク質は、免疫蛍光染色による内因性ラミンBタンパク質（ 図1）と共局在することが確認されました。
アデニンメチル化DNA断片の成功PCR増幅はDamID-seqのための重要なステップです。無または明らかに少ない増幅（ 図2）をもたらすはずである（リガーゼなしに、またはPCRの鋳型なし、DpnIのなし）ネガティブコントロールしながら2キロバイト-実験サンプルは0.2の汚れを増幅しなければなりません。
NGSライブラリの所望の挿入サイズは200から300塩基対でありながら、メチル化DNA断片を、0.2から2 kbの範囲内にあります。したがって、適切なサイズ範囲にメチルPCR産物を断片化することが不可欠です。それにもかかわらず、それは同時に、適切な大きさにまで大きなDNA断片を破壊することは非現実的であることが見出されましたsおよび単一の断片化の期間内にそのまま小さくしたDNA断片の大部分を維持します。したがって、時間経過実験は、200塩基対（ 図3）を中心にスメアフラグメント1μgのDNAに必要な最小の時間（Tの0.2キロバイト）を決定しました。次に等しい増分で6時間分は、実際の断片化のため5分とTの0.2キロバイトの間で選択しました。二本鎖DNA Fragmentaseの酵素活性は、バッチ毎に変化することができ、時間の経過とともに低下することがあり、それはFragmentaseの新しいバッチまたは一定期間保存した後、この手順を繰り返すことをお勧めします。
所望のインサートサイズは、アガロースゲル（121 bpの配列決定アダプターを含む）300と400bpの間のDNA断片に相当する200〜300塩基対です。この範囲内の3つの薄いスライスは、ライブラリーのサイズ範囲を狭くし、可能性を高めるために、各実験試料から切り出し少なくとも一つの修飾されたシークエンシングライブラリー（ 図4）を得ます 。
各増幅されたDNAライブラリーを5μlのアリコートを、配列決定のために修飾することができるライブラリーを決定するためにアガロースゲル上で分析しました。 図5（a）に示すように 、切り出したゲルスライスと同じ大きさの明確な単一のバンドをアガロースゲル（ステップ3.7.4）に表示される必要があります。次に、選択されたライブラリーは、配列決定の前に正確なサイズ範囲および濃度を決定するために、バイオアナライザ（ 図5B）によって調べました。必要に応じて、増幅されたDNAライブラリーを直接ゲル分析なしバイオアナライザーによって調べることができます。複数のライブラリが良い品質のものである場合には、同様のサイズのライブラリーは、サンプル（V5-ダムを発現する細胞）の実験（ダム-V5-POIを発現する細胞）および対照のペアに対して範囲を配列決定することをお勧めします。
ショートは発生し読み取りシーケンシングシステムは、最初に戻って、対応するゲノムにマッピングしました。ユニークその後の分析に渡された読み取り整列。読み込み短い処理するパイプライン、ゲノムNL相互作用マップを作成し、遺伝子-NLの関連を分析するには、私たちの以前の研究10で詳細に説明しました。代表的な結果を図6に示します 。
図1は、免疫蛍光染色により、融合タンパク質の核内局在を検証する。IMR90ヒト肺線維芽細胞を一過性ダム-V5-LMNB1を発現するプラスミドでトランスフェクトし、抗ラミンB（赤A）及び抗V5（Bで染色しました緑色）。 （C）AとBの画像のマージトンの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください彼の姿。
アデニンメチル化DNA断片を増幅し、図2 PCR。各PCR反応からの5μlのアリコートを1％アガロースゲル上で分析しました。 。0.2〜2 kbの範囲のスミアを、各実験サンプルから増幅したが、何の増幅はネガティブコントロール（ステップ2.1でノーをDpnI、ステップ2.2、または全くないPCRの鋳型で無リガーゼ）で観察されなかった拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。
最適な断片化の期間を決定する。精製されたメチルPCR産物を図3.（10分の増分で5から55分の持続時間のために未消化のDNA断片化の対象となりました 、「0分」）としてラベル。 1 DNAラダーμgの各断片化DNAサンプルの0.5μgのアガロースゲル上で分析しました。約200塩基対にDNAスメアの大半を消化する最小限の時間は、したがって、6等間隔の持続時間5〜35分（5と35分を含む）、約35分であると決定された実際の断片化を実行するために選択した。 してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.サイズステップ3.6を2％アガロースゲルに流したから。ダム-V5-LMNB1とV5-ダムのDNAサンプルをDNAライブラリーを選択すると、3つの等しいサイズのゲルスライス（L、M、Hは低に対応し、中黄色の線で示すように）サイズの高は300と400塩基対の間で切除しました。 OM /ファイル/ ftp_upload / 53620 / 53620fig4large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ハイスループットシークエンシングのために、図5の増幅されたDNAライブラリー（A）増幅したDNAライブラリーは、アガロースゲル上で分析しました。 PCRテンプレートは、図4に示されているゲルスライスから精製した。V5-ダム（L）サンプル（A）の下線たダム-V5-LMNB1（L）のサンプル（B）バイオアナライザーをもたらします。これら2つのライブラリは、同様の狭いサイズ範囲を有しており、ハイスループットシークエンシングのためにこのように修飾された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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UCSCゲノムブラウザマウス染色体1 に表示される図6 NGSデータは、一例として示されています。配列データは、マウスC2C12筋芽細胞10から製造しました。トラック「MB.LmnB1.w2k」と「MB.Dam.w2k」、それぞれダム-V5-LMNB1とV5-ダムを発現する細胞からのデータに対応し、プロット正規化された読み取り密度（読み込み一意にマッピングされた百万当たりのキロベースあたり読み込み、またはRPKM ）染色体に沿って非重複連続した2キロバイトの窓インチ「MB.log2FC.w2k「プロットゲノム-NL関連を追跡し、2kbの解像度でダムの上LMNB1のすなわち LOG2 RPKM比率。トラック「MB.sLADs」。白でグレーと未決定の領域で黒、非sLADsにおけるシーケンシングベースのラミナ関連ドメイン（統計的有意性とダムの上LMNB1の高い読み取り密度を有するsLADs、 すなわちゲノム領域）をペイントするには、ここをクリックしてくださいdownloaこのファイルをdは。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ViraPower Lentiviral Expression Systems | Life Technologies | K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11791-020 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | QIAGEN | 69506 or 69504 | |
| Gateway pDONR 201 | Life Technologies | 11798-014 | |
| 293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | |
| Tris | brand not critical | ||
| EDTA | brand not critical | ||
| 200 Proof EtOH | brand not critical | ||
| Isopropanol | brand not critical | ||
| Sodium Acetate | brand not critical | ||
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | supplied with buffer |
| DamID adaptors "AdRt" and "AdRb" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation. | |
| T4 DNA Ligase | Roche Life Science | 10481220001 | supplied with buffer |
| DpnII | New England Biolabs | R0543 | supplied with buffer |
| DamID PCR primer "AdR_PCR" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England Biolabs | N0446 | 100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639201 | supplied with buffer |
| 1Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787018 | 1.0 µg/µl |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 or 28106 | |
| MinElute PCR Purification Kit | QIAGEN | 28004 or 28006 | for an elution volume of less than 30 µl |
| SPRI beads / Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63880 | apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used |
| Buffer EB | QIAGEN | 19086 | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348 | supplied with buffer |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203 | |
| DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs | M0210 | |
| T4 Polynuleotide Kinase | New England Biolabs | M0201 | |
| Klenow Fragment (3’ → 5’ exo-) | New England Biolabs | M0212 | supplied with buffer |
| sequencing adaptors | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200 | used in 3.4.3; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase |
| sequencing primer 1 and 2 | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
| KAPA HiFi PCR Kit | Kapa Biosystems | KK2101 or KK2102 | supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10 mM dNTP mix |
| agarose | Sigma Aldrich | A4679 | |
| ethidium bromide | Sigma Aldrich | E1510-10ML | 10 mg/ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 or 28706 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725121 or 1725122 | |
| Spectrophotometer | brand not critical | ||
| 0.45 μm PVDF Filter | brand not critical | ||
| 25 ml Seringe | brand not critical | ||
| 10 cm Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
| 6-well Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | ||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | for qPCR | |
| Vortex Mixer | brand not critical | ||
| Dry Block Heater or Thermomixer | brand not critical | ||
| Microcentrifuge | brand not critical | ||
| Gel electrophoresis system with power supply | brand not critical | ||
| Magnet stand | for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical | ||
| UV transilluminator | brand not critical | ||
| E-gel electrophoresis system | Life Technologies | G6400, G6500, G6512ST |
References
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