Summary
Vi beskriver häri en analys genom att koppla DNA adenin metyltransferas identifiering (DamID) till hög genomströmning sekvensering (DamID-punkter). Denna förbättrade metod ger en högre upplösning och ett bredare dynamiskt omfång, och låter analysera DamID-seq uppgifter i samband med andra high throughput sekvense data såsom Chip-punkter, RNA-punkter, etc.
Introduction
DNA adenin metyltransferas identifiering (DamID) 1,2 är en metod för att detektera protein-DNA-interaktioner in vivo och är ett alternativ till kromatin immunoprecipitation (chip) 3. Den använder en relativt liten mängd av celler och inte kräver kemisk tvärbindning av proteinet med DNA eller en höggradigt specifik antikropp. Det senare är särskilt användbart när målproteinet är löst eller indirekt i samband med DNA. DamID har framgångsrikt använts för att kartlägga bindningsställen av olika proteiner, inklusive kärnhöljesproteiner 4-10, kromatin associerade proteiner 11-13, kromatin modifierande enzymer 14, transkriptionsfaktorer och co-faktorer 15-18 och RNAi maskinerier 19. Metoden kan användas på flera organismer, inklusive S. cerevisiae 13, S. pombe 7, C. elegans 9,17, D. melanogaster 5,11,18,20 A. thaliana 21,22 samt mus och humana cellinjer 6,8,10,23,24.
Utvecklingen av DamID analysen var baserad på den specifika detekteringen av adenin-metylerade DNA-fragment i eukaryota celler som saknar endogen adenin metylering 2. Ett uttryckt fusionsprotein, bestående av den DNA-bindande protein av intresse och E. coli DNA-adenin metyltransferas (Dam), kan metylera adeninbasen i GATC-sekvenser som är i rumslig närhet (mest påtagligt inom 1 kb och upp till ungefär 5 kb) till bindningsställen av proteinet i genomet 2. De modifierade DNA-fragment kan amplifieras specifikt och hybridiserades till microarrays att detektera de genomiska bindningsställen hos proteinet av intresse 1,25,26. Denna original- DamID metod begränsas av tillgången av microarrays och tätheten av förutbestämda prober. Vi har därför integrerat hög genomströmning sekvensering itill DamID 10 och betecknas metoden som DamID-punkter. Det stora antalet kort läsningar genereras från DamID-punkter möjliggör exakt lokalisering av protein-DNA-interaktioner genom omfattande. Vi fann att DamID-punkter gav en högre upplösning och ett bredare dynamiskt omfång än DamID av microarray för att studera genomet-nukleär lamina (NL) föreningar 10. Denna förbättrade metod gör det möjligt att sondera NL sammanslutningar inom genen strukturer 10 och underlättar jämförelser med andra med hög kapacitet sekvenseringsdata, såsom Chip-punkter och RNA-punkter.
Den DamID-punkter protokoll som beskrivs här utvecklades ursprungligen för kartläggning genom-NL föreningar 10. Vi genererade ett fusionsprotein uppbundna mus eller människa Lamin B1 till E. coli-DNA-adenin metyltransferas och testade protokollet i 3T3 mus embryonala fibroblaster, C2C12 musen myoblaster 10 och IMR90 humana fetala lungfibroblaster (data ej offentliggjort). I detta protokoll börjar vi med constructing vektorer och uttrycka Dam-bundna fusionsproteiner från Lentiviral infektion i däggdjursceller 24. Därefter beskriver vi de detaljerade protokoll för att förstärka adenin-metylerade DNA-fragment och förbereda sekvense bibliotek som ska vara tillämplig i andra organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generation och uttryck av fusionsproteiner och gratis Dam proteiner
- Klon proteinet av intresse i DamID vektorn.
- Amplify cDNA för proteinet av intresse (POI) med användning av den önskade hifi-DNA-polymeras och lämpliga primrar i enlighet med tillverkarens protokoll. Experimentellt bestämma optimala förstärknings villkor för att säkerställa en korrekt förstärkning av insatser.
- Kör en agarosgel och rena amplifierat cDNA av IP genom den gelextraheringskit enligt tillverkarens protokoll.
- Klon cDNA av POI i pDONR201 vektorn med hjälp av BP Clonase II enligt tillverkarens protokoll.
- Klona cDNA för POI från donator vektorn i pLGW-RFC1-V5-EcoDam destination vektor eller pLGW-EcoDam-V5-RFC1 destination vektor 27 med hjälp av LR Clonase II enligt tillverkarens protokoll, beroende på den önskade riktningen för att smälta POI till N-terminalen eller the C-änden av E. coli-DNA-adenin metyltransferas (EcoDam) 27.
- Kontrollera genom sekvensering att den klonade cDNA har en korrekt sekvens och bildar in-frame fusion till EcoDam.
- Generera lentivirala bestånd.
- Generera lentivirala bestånd uttrycker Dam-V5-POI och V5-Dam (från pLGW-V5-EcoDam vektor 27) med hjälp av lentivirala expressionssystem. Använd framåt transfektionsförfarandet enligt tillverkarens protokoll.
- Använd 293T-celler och lipofektion att generera lentivirala lagren i enlighet med tillverkarens protokoll för transfektion.
- Inkludera 0,45 um PVDF-filtersteg.
- Generera lentivirala bestånd uttrycker Dam-V5-POI och V5-Dam (från pLGW-V5-EcoDam vektor 27) med hjälp av lentivirala expressionssystem. Använd framåt transfektionsförfarandet enligt tillverkarens protokoll.
- Infektera celler med lentivirus.
- Dagen före infektion (dag 0), passera adherenta celler odlade i lämpligt tillväxtmedium för denna celltyp till en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta med användning av samma tillväxtmedium utan antibiotika tilluppnå 50% sammanflytning på dagen för infektionen. Placera cellerna i en 37 ° C inkubator.
- På dagen för infektion (dag 1), ta bort 2 kryokärl både Dam-V5-POI och V5-Dam lentivirala supernatanter från en -80 ° C frys och placera det i en 37 ° C vattenbad för att tina.
- Ta tillväxtmedium från celler och ersätta med 0,5 ml färskt tillväxtmedium utan antibiotika.
- Tillsätt 1 ml av den tinade lentivirus till varje brunn (2 brunnar med V5-Dam och 2 brunnar med Dam-V5-POI). Tillsätt 1 ml av tillväxtmedia utan antibiotika till de återstående 2 brunnar-detta kommer att fungera som en negativ kontroll. Skaka försiktigt 6-brunnar för att blanda och placera tillbaka i en 37 ° C inkubator O / N.
- Dagen efter infektion (Dag 2), ta bort virus suspensioner från celler och ersätta med 2 ml tillväxtmedium utan antibiotika. Placera cellerna tillbaka i en 37 ° C inkubator i 48 timmar.
- Isolera gDNA.
- Aspirera media från varje brunn och detach celler med användning av 250 pl 0,05% trypsin-EDTA. Inkubera vid 37 ° C under 2 minuter.
- Tvätta cellerna från plattan med 1 ml tillväxtmedium och pipett celler från varje brunn till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Pelletera celler genom centrifugering vid 200 xg under 5 min vid RT.
- Tvätta pelleterade cellerna med 500 | il PBS och centrifugera vid 200 xg under 2 min vid rumstemperatur.
- Resuspendera pelleterat celler i 200 pl PBS.
- Isolera gDNA genom blod och vävnad kit enligt tillverkarens protokoll. Eluera gDNA i 200 pl buffert AE och bestämma koncentrationen genom att mäta OD 260 med hjälp av en spektrofotometer.
Obs: gDNA från oinfekterade eller skeninfekterade celler kan isoleras som negativa kontroller. Fällning gDNA till högre koncentrationer för långtidsförvaring.- Tillsätt 3 volymer av 100% etanol och 0,1 volym av 3 M natriumacetat (pH 5,5), och blanda genom att vända rören 4-6 gånger.
- Förvara vid -20 ° CO / N.
- Centrifugera vid 16.000 xg under 15 min vid 4 ° C.
- Försiktigt bort supernatanten. Tvätta pellets med 70% (volym / volym) etanol och centrifugera vid 16 tusen xg under 5 min vid 4 ° C.
- Försiktigt bort etanol och låt pellets lufttorka under 3 minuter vid RT.
- Lös gDNA i T 10 E 0,1 (pH 7,5) till ungefär 1 | ig / | il. Pool gDNA från varje försöksprov eller den negativa kontrollen och mäta koncentrationen. Förvara vid -20 ° C.
2. Amplify Adenin-metylerade DNA-fragment
- Digest gDNA med Dpnl som bara skär adenin-metylerade GATCs.
- Inrätta en reaktion på is med 2,5 pg gDNA, 1 pl 10x buffert, 0,5 pl Dpnl (20 U / l) och fyll med H2O till en total volym på 10 pl. För varje gDNA prov, förbereda tre reaktioner - en utan Dpnl ("ingen Dpnl", ersätt Dpnl med 0,5 pl H2O) och två wed Dpnl ("med Dpnl").
- Digest O / N vid 37 ° C och inaktivering av Dpnl vid 80 ° C under 20 minuter.
- Ligera DamID adaptrar.
- Förbered DamID adaptrar.
- Resuspendera vardera av de två DamID adapter oligos 24 i H2O till en slutlig koncentration av 100 | iM.
- Kombinera lika stora volymer av de två DamID adapter oligos, blanda och placera i en väl tillsluten rör. Förslut röret med Parafilm, sitta i ett ställ och placera i en bägare fylld med vatten vid 90 ° C. Hålla vattennivån under locket på röret (för att undvika att vatten tränger in i röret) men ovanför ytan på oligo mixen.
- Låt vattnet svalna till RT så adaptrar glödgning långsamt.
- Alikvotera de hybridiserade adaptrar (50 | iM) och lagra vid -20 ° C.
- Inrätta en reaktion på is. I varje rör från 2.1.2, tillsätt 6,2 | il H2O, 2 ^ il 10 x ligeringsbuffert, 0,8 | il 50 | iM DamID annonsaptors (tinade på is) och ett pl T4-DNA-ligas (5 U / | il). Den totala volymen är 20 l. I en av de två "med Dpnl" rör, byt ligas med 1 pl H2O ("ingen ligas") Observera att varje gDNA prov har två negativa kontroller -. "No Dpnl" och "ingen ligas".
- Ligera O / N vid 16 ° C och inaktivera ligas vid 65 ° C under 10 minuter.
- Förbered DamID adaptrar.
- Digest DNA med DpnII att förstöra fragment som innehåller ometylerade GATCs.
- Inrätta en reaktion på is. I varje rör från 2.2.3, tillsätt 24 | il H2O, 5 ^ il 10 x DpnII buffert och 1 pl DpnII (10 U / | il). Den totala volymen är 50 l.
- Digest vid 37 ° C under 2-3 h och inaktivera DpnII vid 65 ° C under 20 minuter.
- Amplify adenin-metylerade DNA-fragment.
- Inrätta en reaktion på is med 5 pl DpnII smälta från 2.3.2, 5 μl 10x PCR-buffert, 12,5 pl 5 iM DamID PCR-primer 24, 4 pl 10 mM dNTP-blandning, 1 pl 50x polymerasblandning och 22,5 pl H2O Den totala volymen är 50 l.
- Kör PCR enligt följande: 68 ° C under 10 min; 94 ° C under 1 min, 65 ° C under 5 min, 68 ° C under 15 min; 4 cykler med 94 ° C under 1 min, 65 ° C under 1 min, 68 ° C under 10 min; 17 cykler av 94 ° C under 1 min, 65 ° C under 1 min, 68 ° C under 2 min.
- Analysera 5 pl PCR-produkter från varje reaktion på en 1% agarosgel. PCR-produkter ska visas som ett utstryk som sträcker sig från 0,2 till 2 kb (Figur 2). "No Dpnl" och "ingen ligas" kontroller bör ha ingen eller klart mindre förstärkning.
- Om resultatet från steg 2.4.3 är tillfredsställande, upprepa steg 2.4.1-2.4.3 med två eller tre reaktioner för det experimentella provet och en reaktion för vardera av de två negativa kontroller.
- Pool och rena PCR-produkter från sammaexperimentella prov med användning av PCR-reningssatser eller fast fas Reversibel immobilisering (SPRI) pärlor enligt tillverkarens protokoll. Inte rena "nej Dpnl" eller "ingen ligas" kontroller. Eluera DNA med buffert EB.
- Mäta koncentrationen av det renade DNA: t genom att mäta OD 260 med användning av en spektrofotometer, vilken bör vara cirka 0,1 mikrogram / l eller högre. Samla minst 10 mikrogram DNA för varje prov. Om du använder PCR rening kit, rena varje 50 il PCR-produkter med en kolumn, eluera i 30 l buffert EB och pool eluaten.
- Digest DNA med DpnII att förhindra DamID PCR-primrar från att sekvenseras.
- Sätt upp en reaktion på is med 5 ^ g renat DNA från 2.4.6, 5 pl 10x DpnII buffert, 1 | il DpnII (10 U / | il) och fyll med H2O till en total volym av 50 pl. Förbered två eller tre reaktioner för varje prov.
- Smälta vid 37 ° C under 2-3 hoch inaktivera DpnII vid 65 ° C under 20 minuter.
- Pool och rena de digere från samma prov med PCR-reningssatser eller SPRI pärlor enligt tillverkarens protokoll. Eluera DNA med buffert EB.
- Mäta koncentrationen av det renade DNA som bör vara cirka 0,06 mikrogram / l eller högre. Samla minst 6 mikrogram DNA för varje prov. Om du använder PCR rening kit, rena varje 50 pl smälta med en kolumn, eluera i 30 l buffert EB och pool eluaten.
3. Bibliotek Förberedelse för hög kapacitet sekvensering
- Fragment-DNA
- Experimentellt bestämma lämplig uppslutningstiden för varje nytt parti dsDNA Fragmentase. Som enzymaktiviteten kan minska med tiden, upprepa testet innan du utför ett nytt experiment. För att spara DNA från 2.5.4 för själva fragmentering använda renade metyl PCR-produkter från 2.4.6 eller extra DNA från tidigare experiments på detta steg.
- Sätt upp en huvudblandning med 6 pg DNA, 12 | j, l 10 x Fragmentase buffert och fyll med H2O till en total volym av 114 | il.
- Vortex Fragmentase aktie flaskan under 3 sekunder, tillsätt 6 pl i Master Mix och skaka Master Mix i 3 sek. Den totala volymen är 120 l.
- Alikvotera 20 ul av Master Mix till varje 5 nya rör. Inkubera alla 6 rören vid 37 ° C under 5 till 55 minuter vid ett inkrement av 10 min. Lägg 5 pl 0,5 M EDTA för att stoppa reaktionen.
- Analysera 12,5 pl smälta (0,5 | ig DNA) i varje reaktion samt 0,5 ^ g osmält-DNA på en agarosgel (figur 3). Bestäm den minimala tiden (T 0.2kb) som behövs för att smälta de flesta av utstryket till cirka 0,2 kb. Välj 6 tidsvaraktig mellan 5 min och T 0.2kb (inklusive 5 min och T 0.2kb) med lika steg för själva fragmentering.
- Ställ upp den verkliga fragmenteringförandet enligt beskrivningen i 3.1.1.1-3.1.1.3. Inkubera reaktioner vid 37 ° C under den tid löptider bestäms i 3.1.1.4.
- Pool 6 reaktioner och rena de digere med PCR-reningssatser eller SPRI pärlor enligt tillverkarens protokoll. Eluera DNA i 51 pl buffert EB. Det slutliga eluatet är ~ 50 ^.
- Experimentellt bestämma lämplig uppslutningstiden för varje nytt parti dsDNA Fragmentase. Som enzymaktiviteten kan minska med tiden, upprepa testet innan du utför ett nytt experiment. För att spara DNA från 2.5.4 för själva fragmentering använda renade metyl PCR-produkter från 2.4.6 eller extra DNA från tidigare experiments på detta steg.
- Reparation ändar fragmenterat DNA
- Sätt upp en reaktion på is med eluatet från 3.1.3, 25 | il H2O, 10 ^ il 10 x T4 DNA-ligasbuffert med 10 mM ATP, 4 | il 10 mM dNTP-blandning, 5 pl T4-DNA-polymeras (3 U / | il) , 1 ^ il Klenow-DNA-polymeras (5 U / | il), och 5 ^ il T4-polynukleotidkinas. Den totala volymen är 100 l. Blanda väl med pipett. Undvik skum och bubblor.
- Inkubera vid 20 ° C under 30 minuter.
- Rena DNA med PCR-reningssatser eller SPRI pärlor enligt tillverkarens protokoll. Eluera DNA i 33 pl buffert EB. Den slutliga eluatet är ~ 32 & #181, l.
- Lägg "A" överhäng
- Inrätta en reaktion på is med eluatet från 3.2.3, 5 pl 10x Klenow buffert, 10 ^ 1 mM dNTP, och 3 pl Klenow (3 '→ 5 "exo-) (5 U / l). Den totala volymen är 50 l. Blanda väl med pipett. Undvik skum och bubblor.
- Inkubera vid 37 ° C under 30 minuter.
- Rena DNA med PCR-reningssatser eller SPRI pärlor enligt tillverkarens protokoll. Eluera DNA i 22 pl buffert EB. Det slutliga eluatet är ~ 21 | il.
- Ligera sekvense adaptrar
- Förbered sekvense adaptrar 28.
- Resuspendera varje adapter oligo till en koncentration av 100 | iM i 10 mM Tris-Cl (pH 7,8), 0,1 mM EDTA (pH 8,0) och 50 mM NaCl.
- Blanda lika stora volymer av universaladapter 28 och en indexerad adapter 28.
- Glödga adaptrarna i en termocykler med följandeprogrammet: 95 ° C under 2 min; 140 cykler för 30 sekunder med början vid 95 ° C och minskar med 0,5 ° C varje cykel; håll vid 4 ° C.
- Alikvotera adaptrar och förvara vid -20 ° C.
- Inrätta en reaktion på is med eluatet från 3.3.3, 25 pl 2x ligeringsbuffert, 1,5 pl 50 iM glödgade sekvense adaptrar (tinas på is) från 3.4.1.4 och 2,5 pl T4 DNA-ligas. Blanda väl med pipett. Undvik skum och bubblor. Om multiplex sekvensering önskas, använd en annan indexerad adapter för varje prov.
- Inkubera vid rumstemperatur under 1 timme.
- Rena DNA med PCR-reningssatser eller SPRI pärlor enligt tillverkarens protokoll. Eluera DNA i 24 pl buffert EB. Det slutliga eluatet är ~ 23 | il.
- Förbered sekvense adaptrar 28.
- Konvertera Y-formade adaptrar till dsDNA att exakt göra det möjligt att bestämma DNA-fragment storlekar 28
- Inrätta en reaktion på is med eluatet från 3.4.4, 12,5 pl H2O, 1 pl 25 iM primer 1 28, 1 pl 25 iM primer 2 28, 1,5 pl 10 mM dNTP, 10 pl 5x PCR-buffert och 1 pl DNA-polymeras (1 U / l).
- Kör PCR enligt följande: 95 ° C under 3 min; 5 cykler av 98 ° C under 15 sek, 63 ° C under 30 sek, 72 ° C under 30 sek; 72 ° C under 1 min; 4 ° C på is.
- Rena DNA med PCR-reningssatser eller SPRI pärlor enligt tillverkarens protokoll. Eluera DNA i 11 pl buffert EB. Det slutliga eluatet är ~ 10 | il.
- Storlek väljer biblioteket
- Bered en 2% agarosgel med 1x TAE-buffert. Lägg etidiumbromid (VARNING!) Till en slutlig koncentration av 500 ng / ml när den smälta TAE-agaros lösningen har svalnat för att undvika inandning av etidiumbromid. Se till att ha tillräckligt med banor för alla prover, DNA-stege och tomma körfält.
- Tillsätt 8 il 6x laddningsfärg till eluatet från 3.5.3. <li> Förbered DNA-stege genom att blanda 1 kb plus DNA-stege (1,0 ^ g / ^ il), 6x laddningsfärg och H2O i ett förhållande av 1: 1: 4.
- Belastning 6 pl DNA-stege, proverna från 3.6.2 och ytterligare 6 pl DNA-stege, var och en i en separat fil och med åtminstone en tom bana från intilliggande prover / stegar.
- Kör gelen vid 120 V under 60 minuter.
- Visa gelen på en UV-transilluminator (minimera exponeringstiden för UV). Använd skyddsglasögon och ansiktsskärm. Se till att åtminstone en av de DNA-stegar kör väl med lämplig mellanrum (tillräckligt för att skära 3 gelskivor) mellan 300 bp och 400 bp band. Begränsa avståndet ökar svårigheterna i att skära flera gelskivor, medan större avståndet ökar volymen av utskurna gelskivor.
- Använd en ny skalpell eller ett rakblad för varje bana. Punkt tre tunna gelskivor mellan 300 och 400 bp från varje bana (fig 4) och placera dem var och en i ett mikrocentrifugrör. Håll volymen av varje gel slöss så låg som möjligt (<100 | j, l).
- Mät volymen av varje gelskiva (1 | j, l gel väger ungefär 1 mg), tillsätt 6x volymer av QG-buffert och inkubera vid 50 ° C.
- Virvel QG-gelblandningen varje 2-3 min tills gelskivan har helt upplöst. Lägg till 2x gelvolymer isopropanol och blanda.
- Från detta steg, följer protokollet från gel extraktion kit. Eluera DNA i 51 pl buffert EB. Det slutliga eluatet är ~ 50 ^.
- Optimera antalet PCR-cykler 29.
- Sätt upp en reaktion på is med 1 | il eluat från 3.6.10, 1 pl 25 pM primer 1 28, 1 | al 25 | iM primer 2 28, 7 | il H2O och 10 ^ il SYBR Green Supermix. Den totala volymen är 20 l.
- Kör qPCR enligt följande: 95 ° C under 3 min; 20 cykler av 95 ° C under 30 sek, 63 ° C under 30 sek, 72 ° C under 30 sekunder, läs plattan.
- Analysera data med hjälp av en qPCR analysprogram och bestämma kvantifiering Cycle (Cq) eller Tröskel Cycle (Ct) för varje prov med hjälp av tillverkarens protokoll. Fortsätt med de prover som har Cq / Ct ≤ 14. Använd den maximala Cq (Cq 0) minus 1 (avrundat uppåt till nästa högre heltal) som den slutliga PCR-cykelantalet (N PCR).
- Justera kvantiteter DNA-mallar, så att olika prover kommer att förstärkas till ungefär lika stora mängder efter att ha kört samma antal PCR-cykler. Använd 8 pl mall för provet med högsta Cq (Cq 0) och beräkna mallen volymen andra prover med följande formel:
Vol I = 8 x 1,8 Cq jag -Cq 0
- Ställ in PCR-reaktioner på is med mallvolymerna beräknas från 3.7.1.4: 1 pl 25 iM primer 1 28, 1 pl 25 iM primer 2 28 1,5il 10 mM dNTP, 10 | al 5x buffert, 1 | il DNA-polymeras (1 U / | il) och fyll med H2O till en total volym av 50 pl.
- Kör PCR enligt följande: 95 ° C under 45 sek; N PCR-cykler (bestämd i 3.7.1.3) av 98 ° C under 15 sek, 63 ° C under 30 sek, 72 ° C under 30 sek; 72 ° C under 1 min; 4 ° C på is.
- Analysera 5 pl PCR-produkter i en 2% -ig agarosgel (figur 5A). En klar "singel" bandet indikerar att de amplifierade DNA-fragmenten är inom ett smalt längdområde, och att DNA-biblioteket kan bli föremål för ytterligare analys.
- Upprepa en reaktion för utvalda prover och samla de förstärkta DNA-bibliotek från samma prov.
- Rena valda DNA-bibliotek för sekvensering.
- Om primer / adapter dimerer syns inte i 3.7.4, rena DNA-bibliotek med PCR-reningssatser eller SPRI pärlor enligt tillverkarens protokoll. Eluera DNA i 21 pl buffert EB. Deslutliga eluatet är ~ 20 ^. Om användarens sekvense anläggning har specifika instruktioner om elueringsbufferten, den slutliga volymen, etc., framställning av prover i enlighet därmed.
- Om primer / adapter dimerer syns tydligt i 3.7.4, rena bibliotek enligt följande.
- Last DNA från 3.7.5 och DNA Ladder i en 2% förgjuten agarosgel. Prover kan renas enligt beskrivningen i 3.7.6.1 för att minska volymen eller kan laddas i flera brunnar. Placera agarosgel i ett lämpligt kraftsystemet. Tillåt gelén att löpa i 15 min.
- Med hjälp av en lämplig transilluminator, klippa ut det önskade bandet med en ren skalpell / rakhyvel för varje prov och placera gelskivan i en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Isolera DNA med användning av Gel Extraction kit enligt tillverkarens protokoll med två ändringar: inkubera buffert QG-gel-blandningen i en termoblandare vid 37 ° C och 1000 rpm under 30 minuter, och tillsätt 2x gel volymer isopropanol.
Anmärkning: En kvalitetsanalys av en Bioanalyzer (figur 5B) bör utföras före sekvenser för att bestämma den exakta storlek och koncentrationen av ett DNA-bibliotek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dam-V5-LmnB1 fusionsprotein verifierades att samlokaliserade med den endogena Lamin B-protein genom immunofluorescensinfärgning (Figur 1).
Den framgångsrika PCR-förstärkning av adenin-metylerade DNA-fragment är ett viktigt steg för DamID-punkter. De experimentella prover ska förstärka ett utstryk av 0,2 - 2 kb medan de negativa kontrollerna (utan Dpnl, utan ligas eller utan PCR-mall) bör resultera i ingen eller klart mindre förstärkning (Figur 2).
De metylerade DNA-fragmenten är i intervallet från 0,2 till 2 kb, medan den önskade insertstorlek för en NGS biblioteket är från 200 till 300 bp. Därför är det nödvändigt att fragmentera de metyl PCR-produkter in i den lämpliga storleksområdet. Ändå visade det sig vara opraktiskt att samtidigt bryta större DNA-fragment ner till lämplig storleks och hålla de flesta av mindre DNA-fragment intakt i en enda fragmentering varaktighet. Därför ingick tidsförloppet experiment utfördes för att bestämma den minimala tiden (T 0.2kb) som behövs för att fragmentet 1 pg DNA till ett utstryk centrerat vid 200 bp (figur 3). Sedan 6 tidsvaraktig i lika steg valdes mellan 5 min och T 0.2kb för själva fragmentering. Den enzymatiska aktiviteten hos dubbelsträngat DNA Fragmentase kan variera från sats till sats och kan minska över tiden, så det rekommenderas att upprepa detta steg för ett nytt parti av Fragmentase eller efter förvaring under en tid.
Den önskade insättningsstorlek är mellan 200 och 300 bp motsvarande DNA-fragment mellan 300 och 400 bp (inklusive 121 bp sekvense adaptrar) på agarosgelen. Tre tunna skivor inom detta intervall skars ut från varje försöksprov för att begränsa storleksområdet av ett bibliotek och öka möjlighetenatt få åtminstone en kvalificerad sekvense bibliotek (Figur 4).
En portion av 5 il av varje förstärkt DNA-bibliotek analyserades på agarosgel för att bestämma vilka bibliotek kan kvalificera sig för sekvensering. Såsom visas i figur 5A, bör en klar enda band med samma storlek som den utskurna gelbiten vara synlig på agarosgel (steg 3.7.4). Därefter valdes bibliotek undersökas av en Bioanalyzer (Figur 5B) för att bestämma den exakta storlek och koncentrationer före sekvensering. Om så önskas, kan amplifierade DNA-bibliotek kan undersökas direkt av en Bioanalyzer utan gelanalys. När flera bibliotek är av god kvalitet, är det rekommenderat att sekvensera bibliotek av liknande storleksintervall i ett par av experimentella (celler som uttrycker Dam-V5-POI) och kontroll (celler som uttrycker V5-Dam) prover.
Den korta läsningar genereras avsekvense systemen först avbildas tillbaka till motsvarande genomet. Unikt inriktade läser fördes sedan till efterföljande analyser. En pipeline för att bearbeta kort läser, konstruera ett genom-NL interaktion karta och analysera gen-NL föreningar beskrevs i detalj i vårt tidigare arbete 10. Representativa resultat visas i fig 6.
Figur 1. Validera subnukleära lokaliseringar av fusionsproteiner genom immunofluorescens-färgning. IMR90 humana lungfibroblast-celler transfekterades transient med en plasmid som uttrycker Dam-V5-LmnB1 och färgades med anti-Lamin B (A, röd) och anti-V5 (B, grön). (C) Sammanfoga bilder i A och B. Klicka här för att se en större version av thans gestalt.
Figur 2. PCR amplifiera adenin-metylerade DNA-fragment. En alikvot av 5 | il från varje PCR-reaktion analyserades på en 1% agarosgel. En smear sträcker sig från 0,2 till 2 kb förstärktes från varje försöksprov, men ingen förstärkning observerades i negativa kontroller (ingen Dpnl i steg 2.1, ingen ligas i steg 2.2, eller ingen PCR-mall). Att Klicka här för en större version av denna siffra.
Figur 3. Fastställande optimala fragmenterings löptider. Renade metyl PCR-produkter var föremål för fragmentering för tids löptider 5-55 minuter vid en ökning av 10 minuter (osmält DNA Märkt som "0 min"). 1 | j, g av DNA-stege och 0,5 ^ g av varje fragmenterat DNA prov analyserades på en agarosgel. Den minimala tid att smälta majoriteten av DNA smeta till cirka 200 bp bestämdes till cirka 35 minuter, alltså sex jämnt fördelade tidsvaraktig mellan 5 och 35 min (5 och 35 min ingår) valdes för att utföra själva fragmentering. Vänligen Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Storleks välja DNA-bibliotek. DNA-prover från Dam-V5-LmnB1 och V5-Dam från steg 3,6 kördes på en 2% agarosgel, och tre lika stora gelskivor (L, M och H motsvarande låg, medium och hög i storlek) klipptes ut mellan 300 och 400 bp såsom visas med de gula linjer. om / filer / ftp_upload / 53620 / 53620fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Amplified DNA-bibliotek för hög genomströmning sekvensering. (A) Amplified DNA-bibliotek som analyserades på en agarosgel. PCR-mallar renades från gelskivor som visas på figur 4. (B) Bioanalyzer Resultaten av V5-dammen (L) prov och Dam-V5-LmnB1 (L) provet som understruket i (A). Dessa två bibliotek hade liknande smalt storleksintervall och därmed kvalificerade för hög genomströmning sekvensering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
jpg "/>
Figur 6. NGS data som visas i UCSC genomet webbläsare. Muskromosom 1 visas som ett exempel. Sekvensdata ställdes från mus C2C12 myoblaster 10. Spår "MB.LmnB1.w2k" och "MB.Dam.w2k", motsvarande uppgifter från celler som uttrycker Dam-V5-LmnB1 och V5-Dam respektive tomt normaliserad läs densiteter (läser per kilobas per miljon unikt kartlagt läser, eller RPKM ) i icke-överlappande varandra följande 2 kb fönster längs kromosomen. Spåra "MB.log2FC.w2k" tomter genomet NL föreningar, dvs log2 RPKM förhållanden av LmnB1 över Dam, på 2 kb upplösning. Spåra "MB.sLADs" målar sekvensebaserade Lamina Associated Domäner (sLADs, det vill säga genomregioner som har högre lästa tätheter av LmnB1 över Dam med statistisk signifikans) i svart, icke-sLADs i grått och obestämda regioner i vitt. Klicka här för att download denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ViraPower Lentiviral Expression Systems | Life Technologies | K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11791-020 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | QIAGEN | 69506 or 69504 | |
| Gateway pDONR 201 | Life Technologies | 11798-014 | |
| 293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | |
| Tris | brand not critical | ||
| EDTA | brand not critical | ||
| 200 Proof EtOH | brand not critical | ||
| Isopropanol | brand not critical | ||
| Sodium Acetate | brand not critical | ||
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | supplied with buffer |
| DamID adaptors "AdRt" and "AdRb" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation. | |
| T4 DNA Ligase | Roche Life Science | 10481220001 | supplied with buffer |
| DpnII | New England Biolabs | R0543 | supplied with buffer |
| DamID PCR primer "AdR_PCR" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England Biolabs | N0446 | 100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639201 | supplied with buffer |
| 1Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787018 | 1.0 µg/µl |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 or 28106 | |
| MinElute PCR Purification Kit | QIAGEN | 28004 or 28006 | for an elution volume of less than 30 µl |
| SPRI beads / Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63880 | apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used |
| Buffer EB | QIAGEN | 19086 | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348 | supplied with buffer |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203 | |
| DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs | M0210 | |
| T4 Polynuleotide Kinase | New England Biolabs | M0201 | |
| Klenow Fragment (3’ → 5’ exo-) | New England Biolabs | M0212 | supplied with buffer |
| sequencing adaptors | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200 | used in 3.4.3; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase |
| sequencing primer 1 and 2 | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
| KAPA HiFi PCR Kit | Kapa Biosystems | KK2101 or KK2102 | supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10 mM dNTP mix |
| agarose | Sigma Aldrich | A4679 | |
| ethidium bromide | Sigma Aldrich | E1510-10ML | 10 mg/ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 or 28706 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725121 or 1725122 | |
| Spectrophotometer | brand not critical | ||
| 0.45 μm PVDF Filter | brand not critical | ||
| 25 ml Seringe | brand not critical | ||
| 10 cm Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
| 6-well Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | ||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | for qPCR | |
| Vortex Mixer | brand not critical | ||
| Dry Block Heater or Thermomixer | brand not critical | ||
| Microcentrifuge | brand not critical | ||
| Gel electrophoresis system with power supply | brand not critical | ||
| Magnet stand | for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical | ||
| UV transilluminator | brand not critical | ||
| E-gel electrophoresis system | Life Technologies | G6400, G6500, G6512ST |
References
- van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase. Nat Genet. 27, 304-308 (2001).
- van Steensel, B., Henikoff, S. Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase. Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).
- Fu, A. Q., Adryan, B. Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays. Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).
- Guelen, L. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions. Nature. 453, 948-951 (2008).
- Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm. Cell. 140, 360-371 (2010).
- Kubben, N. Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions. Chromosoma. 121, 447-464 (2012).
- Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe. Nucleus. 3, 77-87 (2012).
- Harr, J. C. Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins. J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).
- Gonzalez-Aguilera, C. Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 15, R21 (2014).
- Wu, F., Yao, J. Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping. BMC Genomics. 14, 591 (2013).
- Filion, G. J. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Vogel, M. J. Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes. Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).
- Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).
- Shimbo, T. MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes. PLoS Genet. 9, e1004028 (2013).
- Orian, A. Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network. Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).
- Artegiani, B. Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis. EMBO J. , (2014).
- Schuster, E. DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO. Mol Syst Biol. 6, 399 (2010).
- Bianchi-Frias, D. Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila. PLoS Biol. 2, e178 (2004).
- Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe. Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).
- Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development. Development. 138, 2761-2771 (2011).
- Germann, S., Gaudin, V. Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method. Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).
- Zhang, X. The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation. Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).
- Orian, A. Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression. Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).
- Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase. Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).
- de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals. Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).
- DamID mammalian vectors. , Available from: http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm (2015).
- Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/ (2015).
- Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/ (2015).
- Bernstein, B. E. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).
- Encode Project Consortium. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS Biol. 9, e1001046 (2011).
- Asp, P. Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).
- Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).
- Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics. Genome Biol. 15, 110 (2014).
- Navin, N. E. Cancer genomics: one cell at a time. Genome Biol. 15, 452 (2014).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).
- Nagano, T. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
- Kind, J. Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions. Cell. 153, 178-192 (2013).
- Southall, T. D. Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells. Dev Cell. 26, 101-112 (2013).
