Abstract
我々は、開発中に、鳥類の胚によって栄養利用を媒介に特定の酵素やタンパク質の機能を研究するための内胚葉上皮細胞培養モデル（EEC）を設立しました。受精したウズラの卵を、5日間37℃でインキュベートし、次いで嚢膜（YSM）がEEC培養システムを確立するために収集された卵黄ました。我々はYSMから胚の胚葉層を単離し、そして2内膜をスライス - 3mmの小片と部分的に24ウェル培養プレートに播種する前に、コラゲナーゼで消化しました。 EECSは、組織の外に増殖し、細胞培養研究のための準備ができています。我々は、ステロールO-アシルトランスフェラーゼ、およびリポタンパク質リパーゼの発現、例えば、EECSがインビボで YSMの典型的な特徴を有していること脂肪滴の蓄積を見出しました。部分的消化処理が大幅EEC文化の成功率を増加させました。 EECSを利用して、我々はSOAT1の発現がcAMPのDによって調節されることを実証しましたependentタンパク質は、関連経路キナーゼ。このプライマリ日本ウズラEEC培養システムは、胚脂質輸送を研究すると鳥類の胚発生の間YSMに栄養利用を媒介に関与する遺伝子の役割を明確にするために便利なツールです。
Introduction
鳥類胚の主要な栄養リソースは、胚発生の間に33％脂質、17％のタンパク質、および1％の灰分から成る卵黄、。1で、卵黄嚢膜（YSM）は、胚腹腔内から成長し、次第に卵黄をカバー表面。胚2日目で開始し、脂質代謝と血管新生に関連した遺伝子発現が徐々にYSMに増加し、YSMはゆっくり絨毛状突起を開発しています。8,9これらの予測は、胚発生をサポートするために、卵黄の栄養素の吸収を増加させます。 YSMは、三胚葉、内胚葉、中胚葉および外胚葉が含まれている胚体外組織である。14卵黄嚢の外胚葉は優しく卵黄嚢をカバーするために卵黄膜と卵白とリンクに直面しています。内胚葉上皮細胞は、卵黄に向かって直接直面し、などの栄養素の利用ポータルを提供しています。6 YSMが拡大するにつれて、内胚葉上皮細胞（EECS）SHAPによって分割することができています二つのグループ、地域の卵黄と血管野にeと機能性。7
エリア卵黄は、内胚葉細胞で構成され、胚から遠いです。血管野は、中胚葉細胞で構成され、血管や結合組織に分化さEECSを覆っています。胚5日目までに、卵黄を完全にYSMの外胚葉と内胚葉で覆われていると血管領域が急速に成長してきました。 YSMは、胚の循環系に、吸収し再構成すると解放（卵黄由来の超低密度リポタンパク質など）、脂質やタンパク質。9、2はしたがって、我々は脂質のメカニズムを研究するために、主要な日本のウズラ胚性内胚葉上皮細胞培養系を確立しました鳥類の胚発生時のYSMで利用。
このようなトリアシルグリセロール、レシチン、リン脂質とコレステロールエステル（CE）などの脂質は、鳥類の胚のための一次エネルギー源です。開発の初期段階で、卵黄脂質は、Cでありますわずか1.3％のCEのomposed、それは鳥類の胚発生3、11の中期で10から15%に上昇する。コレステロールエステルは、鳥類の胚YSMにステロールO-アシルトランスフェラーゼ1（SOAT1）によってコレステロールから合成される。4
コレステロールの貯蔵形態は、CE、CEはリポタンパク質で運ばれており、リポタンパク質は、組織への循環によって輸送される。13週ハッチの前に鳥類の胚の急速な成長があります。約卵黄の残りの脂質含有量の68％は、この段階で吸収される。10脂質はEEC研究モデルによって明らかにすることができる利用されている卵黄れる機構。鶏のEEC培養プロトコルは、この研究の目標を達成するために設立されました。2、9しかし、改善されたEEC細胞培養手順はによって栄養利用を媒介に特定の酵素やタンパク質の機能を研究するために必要とされる組織外植片の低い成功率に開発中に鳥類の胚。
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Protocol
注：この手順では、バウアーら 2013と中澤らによって開発された鶏のモデル培養プロトコルの変形例であり、2011年2,9
1.健康な胚5日目胚ウズラからの準備
- 同じケージで一緒に男性1人と女性3性的に成熟した日本のウズラを置きます。サプライ飼料と水を自由 。光の14時間と闇の10時間に動物室に光を調整します。
- 午後には毎日のビニール袋に受精卵を収集し、胚の成長率を遅らせるために16℃の冷蔵庫に保管してください。
- 2週間の期間内に卵の十分な数を収集した後、5日間通気性のいい37℃のインキュベーター中で受精卵を培養します。
2.基礎培地と洗浄ソリューションを準備します
- 増殖培地として（pH7.2に調整）、DMEM / F-12培地を使用し、それを補完10％新生ウシ血清（NBCS）および1％ペニシリン - ストレプトマイシン両性で。ソリューション（PSA;ペニシリン、10 5単位/ L;ストレプトマイシン、100 mg / Lで、アムホテリシンB、0.25 mg / Lで）。
- 貯蔵のために10倍濃度でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を調製します。卵黄嚢膜しばらく洗浄し、湿らせる（pHを7.2に調整;のKCl、2.667ミリモル; KH 2 PO 4、1.471ミリモル;のNa 2 HPO 4・7H 2 O、8.06のNaCl、137.93ミリモルを含む）1×PBS溶液を使用卵黄とアルブミンから内胚葉を分離します。
- 内胚葉ペレットを再懸濁する（pHを7.2に調整）DMEM培地を使用してください。
ウズラYSMsからプライマリEECSの3コレクション
- 5日間（ステップ1.3）のために収集した卵をインキュベートします。正常な胚発生を確認するために検卵器によって卵を調べます。
注：胚5日目に、YSMの中胚葉の境界が非常に明確であり、3胚層が少ない一緒に緊密にリンクされているので、OBするのは簡単ですTainの内胚葉。 YSMコレクションの正常な毛細血管循環の発達を示す卵のみを使用します。 - 慎重に新鮮な水と75％エタノールを使用して卵殻を清掃してください。ハサミによって空気セル位置から卵殻を開き、そっと出て剥離し、37℃、1×PBSで満たされた10cmの培養皿で鉗子と場所によって全体YSMを集めます。
- はさみのペアを使用すると、胚、卵黄と卵白を削除し、穏やかに1×PBSで3回YSMを洗浄し、10cmの培養皿にPBS溶液中でYSMを配置します。
- YSMから外胚葉を除去するために鉗子やハサミを使用してください。 2ピンセットを使用し、一方はしっかりと内胚葉細胞層を保持し、他方は、毛管中胚葉を保持します。
- 解剖顕微鏡下で、引き離すと胚に向かう方向に中胚葉の端から内胚葉を分離します。 37°Cワットで増殖培地15ml中ドロッパーと場所を使用して、50ml遠心管中で淡黄色胚葉を収集ER浴すべての組織のコレクションは完了するまで。
コラゲナーゼ消化により内胚葉スライスの4消化
- たてDMEM 10ml中のIV型コラゲナーゼの6.5単位を溶解します。
- 遠心分離を室温で3分間、130×gで50mlチューブ（3.4）。培地を吸引し、ピペットを用いてを6cm培養皿内のすべての内胚葉を配置します。この培養皿に1ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を追加します。
- 各スライスのサイズが約2〜3mm程度になるまで、湾曲したハサミで2ウズラ胚から収集した内胚葉をスライス。新鮮なコラゲナーゼ溶液の9ミリリットルと一緒に50ミリリットルの遠心分離管にすべてのスライスを収集し、スポイトを使用してください。
- 175 rpmで37℃の振とう水浴中で30分間コラゲナーゼで組織を消化します。コラゲナーゼとこの部分消化は、外植片の細胞増殖を改善するために使用されます。
- RTで3分間130×gで遠心分離し、静かにピペットを用いて上清画分を除去。 20ミリリットルDMEM中に懸濁することによってペレットを洗浄し、3分間130×gで遠心分離後の上清画分を除去します。
- 成長培地（10％NBCSと1％のPSAを含むDMEM / F12）の12ミリリットルでペレットを再懸濁し、（500μlの細胞溶液で各ウェル）を24ウェルプレートに穏やかに均等に種子。
- 細胞は組織外に増殖することを可能にする2日間空気中に5％、37℃でCO 2の組織外植片をインキュベートします。
- さらに2日間、細胞をインキュベートし、細胞生存率アッセイプロトコルによって、細胞生存率を特徴付ける。15
注：生細胞は、細胞質ゾル内の還元環境を維持します。レサズリン、活性成分は、色が青色と実質的に非蛍光性である非毒性、細胞透過性化合物です。細胞培養物に添加した場合に、レサズリンは、ミトコンドリア酵素によって細胞質にレゾルフィンに還元されます。レゾルフィンの色は赤と非常に蛍光性です。生存細胞が連続レサズリンをレゾルフィンに変換、incre細胞周囲の培地の全体的な蛍光と色をasing。 - 説明したように内胚葉上皮細胞の全RNAの単離を行い、逆転写し、マーカー遺伝子のmRNA発現の定量的リアルタイムPCR。16,17
- SOAT1 mRNAを検出するために、逆転写酵素PCRを使用してください（センス：5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 ';アンチセンス：5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; PCR産物= 168 bp）をEEC細胞に特異的なマーカーとして。 βアクチンのmRNAを使用し（センス：5'TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 ';アンチセンス：5'GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; PCR産物= 151 bp）のハウスキーピング遺伝子および内部コントロールとして。
- RT-qPCRのの製品サイズを検出するために、ゲル電気泳動を使用してください。 1％アガロースゲルを準備し、2μlのローディング色素と10μlの定量PCR産物を混合します。 1％アガロースゲル中の各ウェルに負荷10μlの混合物を、30分間100Vてゲルを実行します。
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Representative Results
一貫性のある有用な細胞モデルを確立する目的を達成するために、我々は、トリEECSの増殖速度と性能を拡張し、安定させる必要があります。我々は、部分的に、このようなコラゲナーゼまたはコラゲナーゼプラスディスパーゼの0.6 Uのようなタンパク質分解酵素で消化内胚葉と無酵素消化と内胚葉の直接のインキュベーションを比較しました。ディスパーゼは、非極性アミノ酸残基のN末端のペプチド結合を加水分解するアミノ - エンドペプチダーゼです。プロテアーゼ消化治療はなし消化（ 図1）と比較して細胞増殖を増加させたのに対し、細胞増殖は、5日間のインキュベーション（ 図2）の後に2つの酵素処置間著しく異なっていませんでした。しかし、コラゲナーゼ処理は、より良好な成長曲線をもたらし、EECSは6-9日（ 図2）のために着実に増殖することを示しました。このように、部分的コラゲナーゼ消化からEECSの成長を改善しex vivoでの外植片と十分かつ機能的なEECを取得することをお勧めします。
4日間のインキュベーション後、EECSは、培養細胞の正確な生理学的特性を示唆し、ホルマリン固定し、オイルレッドO染色（ 図3）の後に検出された脂肪細胞様の外観を有していました。
（IBMX; cAMPの分解を減少させるため）、我々は、環状アデノシン一リン酸（cAMP）の転写調節剤、cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤、3-イソブチル-1-メチルキサンチンであると仮定し、アデニルシクラーゼ活性化剤、フォルスコリン（cAMPの合成を増加させます）両方の24時間の処理（ 図4）後SOAT1 mRNA発現を刺激しました。これらの処理はまた、コレステロール合成の調節転写因子をSREBP2の発現の増加、およびフォルスコリンは、ペリリピン-2（PLIN2）の発現を増強し、表面タンパク質マーカーOF脂質滴（ 図5）。リアルタイムPCRによって定量化脂質生成遺伝子のためのEECのmRNAプロファイルは、脂肪細胞（ 図5）に類似しています。
図1の内胚葉上皮細胞上の部分のコラゲナーゼ消化の効果は 、組織外植片は、細胞が組織の外に増殖することを可能にする2日間インキュベートしました。我々は観察し、正常に成長しEECSの数を算出しました。数値は、部分的に、コラゲナーゼで消化していない消化し、細胞と細胞のために計算しました。両方の24ウェルプレート中で増殖させました。 Y軸は正常に24ウェルの細胞培養プレートにEECSの増殖ウェル数です。データは、平均±SEMとして示しました。分析は、対応のあるt検定によって決定しました。 P <0.0001。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
部分的な酵素消化後のEECSの細胞増殖性能2.図 。増殖速度は、細胞生存率アッセイによって検出しました。アッセイはレサズリンを含有し、弱い蛍光およびレサズリンを有する青色化合物が細胞に入るレゾルフィンに還元されます。生存細胞を継続的に全体的な蛍光および細胞周囲の培地の色を増やす、レゾルフィンするレサズリンを変換します。生存細胞を、600nmで正規化して570 nmの吸光度によって検出しました。データは、平均±SEMとして示しました。分析は、ボンフェローニポストテスト（;コラゲナーゼ+ディスパーゼグループのn = 11コラゲナーゼ群のn = 10）との双方向ANOVAによって決定しました。 * P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001。 下さいCLIこの図の拡大版を表示するには、こちらのCK。
図3.培養EECSの形態は、4日間のインキュベーションの後、EECSは、ホルマリン固定し、オイルレッドO染色後に検出された脂肪細胞のような外観を持っていました。左から右に：EECのを明視野で100倍の倍率で、200X倍率で明視野および200X倍率でオイルレッドOおよびヘマトキシリンで染色した後。一番左の図の左側に暗点が部分的に消化された内胚葉（膜）です。スケールバーは200μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4. SOAT1トランスcAMPの活性化剤で処理したEECSのcription。私たちは24時間5日目にIBMXまたはフォルスコリンの濃度を増加させてEECSを処理しました。我々は、処理した細胞からmRNAを抽出し、逆転写PCRにより、RNAをcDNAに変換します。我々は、リアルタイム定量的PCRによって転写レベルを分析しました。 βアクチンは、ハウスキーピング遺伝子として使用しました。データは、平均±SEMとして示しました。分析は、Tukeyの事後テストで一方向ANOVAによってであった（n = 6）が（*P≤0.05、**P≤0.01）。 IBMXは、細胞内cAMPを上昇させる競合的非選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤であるPKAを活性化し、TNF-αおよびロイコトリエンの合成を阻害し、炎症および先天性免疫を低下させ、非選択的アデノシン受容体アンタゴニストです。フォルスコリンは、一般的にcAMPのレベルを上昇させるために使用される真核生物のアデニル酸シクラーゼの遍在活性化剤である。 このfiguの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。再。
図5は、5日間EECの増殖させたmRNA表現は、その後24時間のcAMP活性化剤で処理した 図4のcDNAを、定量的リアルタイムPCRによる遺伝子発現レベルを分析するために使用しました。 βアクチンは、ハウスキーピング遺伝子として使用し、内部対照としての役割を果たしました。データは、平均±SEMとして示しました。分析は、コントロールに治療法を比較するためにTukeyの事後テスト（n≤6）で一方向ANOVAによってでした。 SREBP2、ステロール調節エレメント結合タンパク質2; LPL、リポタンパク質リパーゼ; PLIN2、ペリリピン-2は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
前培養系のみ限定された成功を有しているので、より良好な培養系が必要です。日本ウズラYSM内胚葉は、ex vivoでの外植片でより良い成長の性能を達成するために、細胞間結合を緩めコラゲナーゼのようなタンパク質分解酵素で処理することが必要です。我々のデータは、部分消化処理の細胞数は、2日間（ 図1）のために播種した後、未消化組織培養からより大きかったことを示しています。したがって、部分的なタンパク質分解消化はYSMから細胞収量を改善するための重要なステップです。
現在の培養プロトコルにおける重要な変更は、部分的なタンパク質分解性消化です。この処理は大幅に細胞収率とライブEECSを得るための成功率を高めました。過剰消化が組織から細胞を分離し、細胞は、プレートに付着しないので、下の消化から少ない細胞収量が得られたのに対し、消化時間は非常に重要です組織外植片。我々は、上記の条件を用いて、30〜40分間の消化が最適であることを見出しました。
現在のプロトコルは、EECSを得るために、高い技術トレーニングを必要とします。 EECSを収集する時点は、例えば、我々は唯一の胚5日目でEECSを収集し、制限されている理由は、鳥類胚が成長するにつれて、卵黄嚢の膜内の層の間の接続は、より複雑であり、それが収集の成功率を減少させることですEECS。プロトコルは、初期胚のEECSはなく、後期胚を得るために使用することができます。これは、後期EECSに直接的な研究の可能性を制限します。
SOAT1およびリポタンパク質リパーゼ、および脂質蓄積の発現がYSM 4,5,11、特にEECSの本質的な特徴です。現在の研究では、SOAT1、LPL、およびペリリピン2（PLN2）はmRNAは培養系が正しい生理charactで細胞を生成することができます示唆、EECSで高度に発現しました。eristics。現在の技術では、一次EECSの大量を生産しました。我々は以前記載された手順9を使用した場合、現在のプロトコルは、EECSでほぼ100％の成功率を生成し、一方、EEC培養の成功率は、24ウェルの細胞培養プレート中で約60％でした。
卵黄嚢の膜は、このように開発中の胚に卵黄から栄養素を転送する機能、卵黄由来のタンパク質、脂質、およびコレステロールを吸収する主要な組織です。コレステロールエステル形成のための主要な酵素であるSOAT1。11大量のコレステロールエステル化は、4を発生したときにSOAT1は、鳥類の胚発生の後期段階で劇的に増加しているので、我々は、培養EECSの特性を評価するためのマーカー遺伝子としてSOAT1 mRNAの発現を使用していました。私たちは、この一次EEC培養系が期待される生理学的特徴を生じたことを実証しました。したがって、EEC培養系はembryonを研究するための貴重なツールとなりますIC脂質輸送や鳥類の胚発生の間YSMにおける栄養利用を媒介に関与する遺伝子の役割を明確にします。
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Acknowledgments
現在のプロトコルの開発のための資金調達、特に国立台湾大学の「トップ大学の計画のねらい」によってサポートされ、台湾（グラントID-104R350144）、ならびに台湾の科学技術省（グラントID：MOST 104 -2313-B-002から039-MY3）。我々は、特に現在の研究のための動物室と実験室のスペースを提供するために国立台湾大学のバイオテクノロジーセンターに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100 ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1 g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24-well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ml PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50 ml Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
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