Abstract
Nous avons établi un modèle épithélial de culture de cellules endodermiques (CEE) pour étudier la fonction de certaines enzymes et des protéines dans la médiation de l'utilisation des nutriments par les embryons aviaires au cours du développement. Fécondés oeufs de caille japonaise ont été incubées à 37 ° C pendant 5 jours, puis jaunes d'membranes sac (YSM) ont été collectées pour établir le système de culture CEE. Nous avons isolé la couche endoderme embryonnaire de YSM et tranché la membrane en 2 - 3 pièces mm et partiellement digéré avec de la collagénase avant le semis dans des plaques de culture de 24 puits. Les CPE prolifèrent sur le tissu et sont prêts pour les études de culture cellulaire. Nous avons constaté que les CPE a des caractéristiques typiques de YSM in vivo, par exemple, l' accumulation de gouttelettes lipidiques, l' expression de la stérol O-acyltransférase et la lipoprotéine lipase. Le traitement de la digestion partielle a augmenté de manière significative le taux de réussite de la culture CEE. Utilisant les CPE, nous avons démontré que l'expression de SOAT1 a été réglementé par le AMPc dla protéine kinase A ependent voie connexe. Ce système de culture caille japonaise CEE primaire est un outil utile pour étudier le transport des lipides embryonnaire et de clarifier le rôle des gènes impliqués dans la médiation de l'utilisation des nutriments dans YSM pendant le développement embryonnaire aviaire.
Introduction
La ressource nutritive majeure de l'embryon aviaire est le jaune, composé de 33% de lipides, 17% de protéines et 1% de cendres. 1 Au cours du développement embryonnaire, la membrane de la vésicule ombilicale (YSM) croît de l' intérieur de la cavité abdominale de l' embryon et recouvre progressivement le jaune d' oeuf surface. Commençant à jour embryonnaire 2, l' expression des gènes associés au métabolisme des lipides et de l' angiogenèse est progressivement augmentée en YSM et le YSM développe lentement projections villosités-like. 8,9 Ces projections augmentent l' absorption des nutriments de jaune pour soutenir le développement embryonnaire. Le YSM est un tissu extra - embryonnaire qui contient trois couches germinales, endoderme, mésoderme et ectoderme. 14 L'ectoderme jaune sac fait face à l'albumen et des liens avec la membrane vitelline pour couvrir délicatement le sac jaune. Les cellules épithéliales endodermiques sont confrontés directement vers le jaune d'œuf et servent de portails d'utilisation des éléments nutritifs. 6 Comme étend la YSM, endodermique cellules épithéliales (CPE) peut être divisé par shape et la fonctionnalité en deux groupes, zone vitellines et la zone vasculosa. 7
Zone vitelline est composé de cellules endodermiques et est éloigné de l'embryon; zone vasculosa est composé de cellules mésodermiques et couvre les CPE différenciées avec les vaisseaux sanguins et les tissus conjonctifs. Par jour embryonnaire 5, le jaune est totalement couvert par l'ectoderme et l'endoderme de YSM et la région vasculaire a connu une croissance rapide. La YSM absorbe, recompose et libère les lipides (comme le jaune dérivé très lipoprotéines de basse densité) et des protéines dans le système circulatoire embryonnaire. 9, 2 Par conséquent, nous avons mis en place un système primaire japonais de caille embryonnaire endodermique épithéliales de culture cellulaire, pour étudier les mécanismes de lipides l'utilisation en YSM pendant le développement embryonnaire aviaire.
Lipides tels que les triacylglycérols, de la lécithine, un phospholipide et un ester de cholestérol (EC) sont les principales sources d'énergie pour les embryons aviaires. Aux premiers stades de leur développement, les lipides du jaune sont composed de seulement 1,3% CE et il monte à 10-15% à mi-parcours du développement embryonnaire aviaire 3, 11 ester de cholestérol. est synthétisée à partir du cholestérol par stérol O-acyltransférase 1 (SOAT1) dans aviaire embryon YSM. 4
La forme de stockage du cholestérol est CE, C'est effectuée dans les lipoprotéines, et les lipoprotéines sont transportées par la circulation vers les tissus. 13 Une semaine avant l' éclosion il y a une croissance rapide des embryons d' oiseaux. Environ 68% du contenu en lipides restant dans le jaune sont absorbés au cours de cette étape. 10 Le mécanisme par lequel les lipides sont utilisés jaune d' oeuf peut être clarifiée par un modèle de recherche CEE. Un protocole de culture CEE du poulet a été mis en place pour atteindre cet objectif de recherche. 2, 9 Toutefois, en raison du faible taux de réussite des explants de tissus, une procédure de culture cellulaire CEE améliorée est nécessaire pour étudier la fonction de certaines enzymes et des protéines dans la médiation de l' utilisation des nutriments par embryons d'oiseaux au cours du développement.
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Protocol
NOTE: Cette procédure est une modification d'un modèle de poulet protocole de culture développé par Bauer et al 2013 et Nakazawa et al, 2011. 2,9..
1. Préparer sain Embryonic Jour 5 Embryons de Quail japonaise
- Placer 1 mâle et 3 femelles sexuellement matures caille japonaise ensemble dans la même cage. Aliments pour animaux d'approvisionnement et de l' eau ad libitum. Ajustez la lumière dans la salle des animaux à 14 h de lumière et 10 heures d'obscurité.
- Collecter les œufs fécondés dans des sacs en plastique chaque jour dans l'après-midi et les garder dans un 16 ° C réfrigérateur pour retarder le taux d'embryons de croissance.
- Après avoir recueilli un nombre suffisant d'oeufs dans un délai de deux semaines, incuber les oeufs fécondés dans un incubateur à 37 ° avec une bonne ventilation pendant cinq jours.
2. Préparer Basal Medium et Wash Solutions
- Utiliser DMEM / F-12 (ajusté à pH 7,2) comme milieu de croissance, et la compléteravec 10% de nouveau sérum de veau né (NBCS) et 1% Pen-Strep Ampho. Solution (PSA; Pénicilline, 10 5 unités / L; streptomycine, 100 mg / L; amphotéricine B, 0,25 mg / L).
- Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration 10 fois pour le stockage; utiliser la solution 1x PBS (contenant du NaCl, 137,93 mM, KCl, 2,667 mM, KH 2 PO 4, 1.471 mM, Na 2 HPO 4 7H 2 O, 8,06 mM; ajuster le pH à 7,2) pour laver et humidifier le jaune sac membrane tout séparer l'endoderme du jaune d'oeuf et de l'albumine.
- Utiliser un milieu DMEM (ajusté à pH 7,2) afin de remettre en suspension les granulés de l'endoderme.
3. Collection de CPE primaire de YSMs Quail japonais
- Incuber les œufs récoltés pendant 5 jours (étape 1.3). Examinez les oeufs par un candler d'oeuf pour confirmer le développement embryonnaire normal.
NOTE: Le jour embryonnaire 5, la limite de YSM mésoderme est très clair et les couches embryonnaires 3 sont moins étroitement liés entre eux, de sorte qu'il est facile d'obendoderme tain. Utilisez uniquement les oeufs montrant le développement de la circulation capillaire normale pour les collections YSM. - Nettoyez la coquille soigneusement à l'aide d'eau douce et 75% d'éthanol. Ouvrez la coquille de la position de la cellule de l'air par une paire de ciseaux, retirez délicatement sur et recueillir la totalité YSM par des pinces et les placer dans une boîte de culture de 10 cm rempli de 37 ° C 1x PBS.
- En utilisant une paire de ciseaux supprimer l'embryon, le jaune et le blanc d'oeuf, et doucement laver le YSM avec 1x PBS trois fois et placer YSM en solution PBS dans une boîte de culture de 10 cm.
- Utilisez une pince et une paire de ciseaux pour enlever l'ectoderme de YSM. Utiliser 2 forceps, une pour maintenir fermement la couche de cellules d'origine endodermique, et l'autre pour maintenir le mésoderme capillaire.
- Sous un microscope à dissection, séparer et on sépare l'endoderme du bord du mésoderme dans la direction vers l'embryon. Collecter l'endoderme jaune clair dans 50 ml tubes de centrifugation en utilisant un compte-gouttes et dans 15 ml de milieu de croissance dans un C wat 37 °bain er jusqu'à ce que toutes les collections de tissus sont terminés.
4. Digestion de l'endoderme tranches par collagénase Digestion
- Fraîchement dissoudre 6,5 unités de collagénase de type IV dans 10 ml de DMEM.
- Centrifuger les tubes de 50 ml (3,4) à 130 g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le milieu et placer tous les endoderme dans une boîte de culture de 6 cm à l'aide d'une pipette. Ajouter une solution de collagénase 1 ml à cette boîte de culture.
- Trancher l'endoderme recueillies à partir de 2 embryons de caille avec une paire de ciseaux courbes jusqu'à ce que la taille de chaque tranche est d'environ 2 à 3 mm. Utilisez un compte-gouttes, de collecter toutes les tranches dans un tube centrifuge de 50 ml le long avec 9 ml de solution de collagénase fraîche.
- Digest le tissu avec de la collagénase pendant 30 min dans un bain-marie agitateur 37 ° C à 175 tours par minute. Cette digestion partielle avec de la collagénase est utilisée pour améliorer la prolifération des cellules des explants.
- Centrifuger à 130 g pendant 3 min à température ambiante et retirez délicatement la fraction de surnageant à l'aide d'une pipette. Laver le culot en suspension dans 20 ml de DMEM et de retirer la fraction de surnageant après centrifugation à 130 x g pendant 3 min.
- Remettre en suspension le culot avec 12 ml de milieu de croissance (DMEM / F12 avec 10% de NBCS et 1% de PSA) et des semences doucement et également dans une plaque à 24 puits (chaque solution de cellules bien avec 500 ul).
- Incuber des explants de tissu à 37 ° C dans 5% de CO2 dans l' air pendant 2 jours pour permettre aux cellules de proliférer sur des tissus.
- Laisser incuber les cellules pendant 2 jours et caractériser la viabilité des cellules par un protocole de dosage de la viabilité cellulaire. 15
NOTE: les cellules vivantes maintiennent un environnement réducteur dans le cytosol. Résazurine, l'ingrédient actif, est un composé perméable aux cellules non-toxique qui est de couleur bleue et pratiquement non-fluorescent. Lorsqu'ils sont ajoutés à des cultures de cellules, la résazurine est réduite à la résorufine dans le cytosol par les enzymes mitochondriales. Résorufine est de couleur rouge et très fluorescent. Les cellules viables convertissent de façon continue à la résazurine résorufine, increAsing la fluorescence globale et la couleur du milieu de culture des cellules environnantes. - Effectuer endoderme cellules épithéliales isolement de l' ARN total, la transcription inverse et quantitative PCR en temps réel du gène marqueur expression de l' ARNm comme décrit. 16,17
- Utiliser la PCR transcriptase inverse pour détecter SOAT1 ARNm (sens: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; anti-sens: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; produit PCR = 168 pb) comme marqueur spécifique des cellules CEE. Utilisez β-actine ARNm (sens: 5'TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '; antisens: 5'GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; produit PCR = 151 pb) comme un gène de ménage et de contrôle interne.
- Utiliser une électrophorèse sur gel pour détecter la taille du produit de la RT-PCR quantitative. Préparer 1% de gel d'agarose, et mélanger 10 ul produit qPCR avec 2 ul colorant de chargement. Charge 10 mélange ul dans chaque puits dans le gel d'agarose à 1%, et exécuter le gel par 100V pendant 30 min.
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Representative Results
Afin d'atteindre l'objectif d'établir un modèle cellulaire cohérente et utile, nous devons développer et stabiliser le taux et le rendement des CPE aviaires prolifération. Nous avons comparé l'incubation directe de l'endoderme sans digestion enzymatique avec l'endoderme partiellement digéré avec des enzymes protéolytiques, telles que la collagénase ou collagénase plus 0,6 U de dispase. Dispase est un groupe amino-endopeptidase qui hydrolyse les liaisons peptidiques N-terminales des résidus d'acides aminés non polaires. Alors que les traitements de digestion par la protéase prolifération cellulaire accrue comparativement à aucune digestion (figure 1), la croissance cellulaire n'a pas été nettement différente entre les deux traitements enzymatiques , après cinq jours d' incubation (Figure 2). Cependant, le traitement à la collagénase a donné lieu à une courbe de croissance et de mieux montré que les CPE ont proliféré de façon constante pendant 6-9 jours (figure 2). Ainsi, la digestion partielle de collagénase amélioré la croissance des CPE de laexplants ex vivo et il est recommandé d'obtenir CEE suffisante et fonctionnelle.
Après 4 jours d' incubation, les CPE avait une apparence adipocytaire comme détectée après fixation au formol et d' huile rouge O coloration (figure 3), ce qui suggère des caractéristiques physiologiques correctes des cellules cultivées.
Nous émettons l'hypothèse que l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) est un agent de transcription réglementaire, l'inhibiteur de la phosphodiestérase de l'AMPc, 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX, pour diminuer la dégradation de l'AMPc) et l'activateur de l'adényl cyclase, la forskoline (pour augmenter la synthèse de l'AMPc) à la fois stimulé l' expression de l' ARNm après le traitement SOAT1 h 24 (figure 4). Ces traitements ont également augmenté l'expression de SREBP2, de régulation d'un facteur de transcription de la synthèse du cholestérol et de la forskoline amélioré l'expression de périlipine-2 (PLIN2), la surface marqueur protéique of gouttelettes lipidiques (figure 5). Les profils CEE ARNm pour les gènes de la lipogenèse quantifiées par PCR en temps réel sont similaires à adipocytes (Figure 5).
Figure 1. Effet de la digestion partielle de la collagénase sur les cellules endodermique épithélium. Des explants de tissus ont été mis en incubation pendant 2 jours pour permettre aux cellules de proliférer sur le tissu. Nous avons observé et calculé le nombre des CPE cultivés avec succès. Les nombres ont été calculés pour les cellules sans digestion et les cellules partiellement digérés avec de la collagénase; les deux ont été cultivées dans des plaques à 24 puits. L'axe des Y est le nombre bien des CEE proliféré avec succès dans la cellule plaque de culture de 24 puits. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± SEM. Analyse ont été déterminées par le test t apparié. P <0,0001. S'il vous plaît , cliquez icipour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. La performance de croissance cellulaire de CPE Après partielle Digestion enzymatique. Le taux de prolifération a été détectée par un test de viabilité cellulaire. Le dosage contenu résazurine, un composé bleu qui a une faible fluorescence et résazurine est réduite à résorufine à pénétrer dans les cellules. Les cellules viables convertissent en continu résazurine à résorufine, l'augmentation de la fluorescence globale et la couleur des médias cellules environnantes. Les cellules viables ont été détectées par absorbance à 570 nm avec une normalisation à 600 nm. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± SEM. L'analyse a été déterminée par deux voies ANOVA avec post-test de Bonferroni (groupe collagénase n = 10; collagénase + dispase groupe n = 11). * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001. S'il vous plaît click ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. La Morphologie de Cultured CPE. Après 4 jours d' incubation, les CPE avait une apparence adipocytaire comme détectée après fixation au formol et d' huile rouge O coloration. De gauche à droite: CEE de dans le champ lumineux avec un grossissement de 100X, dans le champ lumineux avec un grossissement de 200X et 200X après coloration avec O huile-rouge et hématoxyline. La tache sombre sur la gauche de la figure extrême gauche est l'endoderme partiellement digérés (membrane). La barre d'échelle représente 200 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. SOAT1 Transcription de CPE traités avec AMPc activateurs. Nous avons traité les CPE avec des concentrations croissantes de IBMX ou forskoline au jour 5 pendant 24 heures. Nous avons extrait les ARNm de cellules traitées et converti l'ARN en ADNc par transcription inverse PCR. Nous avons analysé les niveaux de transcription par PCR quantitative en temps réel. β-actine a été utilisé comme gène domestique. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± SEM. Les analyses ont été par une ANOVA avec post-test de Tukey (n = 6) (* P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01). IBMX est un inhibiteur non sélectif de la phosphodiestérase compétitif qui augmente l'AMPc intracellulaire, active PKA, inhibe le TNF-alpha et la synthèse des leucotriènes, réduit l'inflammation et l'immunité innée et est un antagoniste du récepteur de l'adénosine non sélectif. La forskoline est un activateur omniprésent de eucaryote adénylcyclase, couramment utilisé pour augmenter les niveaux d'AMPc. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figuré.
Figure 5. L'ARNm Expressions de Grown de CEE pendant cinq jours, puis traité avec de l' AMPc activateurs pendant 24 heures. Les ADNc de la figure 4 ont été utilisés pour analyser les niveaux d'expression génique par PCR en temps réel quantitative. β-actine a été utilisé comme gène domestique et a servi de contrôle interne. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± SEM. Les analyses ont été par une ANOVA avec post-test de Tukey (n≤ 6) pour comparer les traitements à la commande. SREBP2, stérol élément-binding protein 2 réglementaire; LPL, lipoprotéine lipase; PLIN2, perilipin-2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Parce que le système de culture précédente a qu'un succès limité, un meilleur système de culture est nécessaire. La caille YSM endoderme japonaise nécessite un traitement avec des enzymes protéolytiques telles que la collagénase pour desserrer les jonctions cellule-cellule pour obtenir une meilleure performance de la croissance dans les explants ex-vivo. Nos données montrent que le nombre de cellules provenant du traitement de digestion partielle ont été supérieures à partir de la culture de tissu non digéré après l' ensemencement pendant 2 jours (figure 1). Par conséquent, la digestion protéolytique partielle est une étape cruciale pour améliorer le rendement des cellules de la YSM.
La modification essentielle dans le protocole de culture en cours est la digestion protéolytique partielle. Ce traitement a considérablement amélioré le rendement de la cellule et le taux de succès de l'obtention CPE direct. Le temps de digestion est très critique, car plus-digestion va séparer les cellules du tissu et des cellules ne se fixe pas à la plaque, alors que la sous-digestion conduit à un rendement moindre des cellules de laDes explants de tissus. Nous avons constaté que 30 à 40 min en utilisant une digestion les conditions décrites ci-dessus est optimale.
Le protocole actuel exige une formation technique élevée pour obtenir les CPE. Le point de collecte des CPE de temps est limité, par exemple, nous ne recueillons que les CPE au jour embryonnaire 5. La raison en est que les embryons d'oiseaux grandissent, les connexions entre les couches de la membrane du sac vitellin sont plus complexes et il diminue le taux de réussite de la collecte CPE. Le protocole peut être utilisé pour obtenir des CPE embryons à un stade précoce, mais pas des embryons à un stade avancé. Elle limite la possibilité de la recherche directe sur les CPE à un stade avancé.
L'expression de la lipoprotéine lipase et SOAT1 et l' accumulation des lipides sont des caractéristiques essentielles de la YSM 4,5,11, en particulier le CPE. Dans l'étude actuelle, SOAT1, LPL et Perilipin 2 (PLN2) ARNm ont été exprimées fortement dans les CPE, ce qui suggère le système de culture peut générer des cellules avec le charact physiologique correctéristique. La technique actuelle a produit une grande quantité de CPE primaire. Lorsque nous avons utilisé la procédure décrite précédente 9, le taux de la culture CEE succès a été d' environ 60% dans des plaques de culture cellulaire de 24 puits, alors que le protocole actuel généré au CPE taux de réussite de près de 100%.
une membrane en forme de sac vitellin est le tissu principal pour absorber les protéines, les lipides et le cholestérol du jaune d'oeuf, fonctionnant ainsi de transférer des nutriments à partir du jaune au cours du développement des embryons. L'enzyme principale pour la formation des esters de cholestérol est SOAT1. 11 Parce que SOAT1 augmente considérablement dans les derniers stades du développement embryonnaire aviaire lorsque massif estérification du cholestérol se produit 4, nous avons utilisé l' expression SOAT1 ARNm du gène marqueur pour évaluer les caractéristiques de SIGE cultivées. Nous avons démontré que ce système de culture CEE primaire produit attendu des caractéristiques physiologiques. Par conséquent, le système de culture CEE peut être un outil précieux pour étudier embryonle transport des lipides ic et de clarifier le rôle des gènes impliqués dans la médiation de l'utilisation des nutriments dans YSM pendant le développement embryonnaire aviaire.
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Acknowledgments
Le financement pour le développement du protocole actuel est particulièrement soutenue par "But du Plan Université Top" de l'Université nationale de Taiwan, Taiwan (subvention ID-104R350144), ainsi que le Ministère de la science et de la technologie de Taiwan (subvention ID: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). Nous remercions tout particulièrement le Centre de biotechnologie de l'Université nationale de Taiwan pour fournir une salle d'animaux et de l'espace de laboratoire pour l'étude en cours.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100 ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1 g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24-well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ml PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50 ml Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
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