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Developmental Biology

Primäre Endodermal Epithelial Cell Culture aus dem Dottersack-Membran der japanischen Wachtel Embry

doi: 10.3791/53624 Published: March 10, 2016

Abstract

Wir gründeten eine endodermaler epithelialen Zellkulturmodell (EWG) für die Funktion bestimmter Enzyme zu studieren und Proteine, die in Nährstoffverwertung von Vogelembryonen während der Entwicklung zu vermitteln. Befruchtete japanischen Wachteleier wurden für 5 Tage bei 37 ° C inkubiert und dann Dottersackmembranen (YSM) gesammelt wurden die EWG-Kultursystem zu etablieren. Wir isolierten die embryonale Endoderm Schicht aus YSM und in Scheiben geschnitten, die Membran in 2 - 3 mm Stücke und teilweise mit Kollagenase verdaut, bevor sie in 24-Well-Kulturplatten mit Animpfen. Die EECs proliferieren aus dem Gewebe und sind für die Zellkultur-Studien bereit. Wir fanden , dass die EECs typischen Eigenschaften YSM in vivo hatten, beispielsweise Akkumulation von Lipidtröpfchen, die Expression von Sterol O-Acyltransferase und Lipoprotein - Lipase. Die partielle Verdauung Behandlung signifikant erhöht die erfolgreiche Rate der EWG Kultur. Verwendung der EECs haben wir gezeigt, dass die Expression von SOAT1 durch die cAMP d reguliert wurdeependent Protein-A-verwandten Weg Kinase. Diese primäre japanische Wachtel EWG Kultursystem ist ein nützliches Werkzeug embryonale Lipidtransport zu untersuchen und die Rolle der Gene bei der Vermittlung der Nährstoffverwertung in YSM während avian Embryonalentwicklung beteiligt zu klären.

Introduction

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Der Hauptnahrungsressource des Vogelembryo yolk ist, bestehend aus 33% Lipiden, 17% Protein und 1% Asche. 1 Während der embryonalen Entwicklung, der Dottersack - Membran (YSM) wächst aus der embryonalen Bauchhöhle und erstreckt sich allmählich das Eigelb Oberfläche. Beginnend am embryonalen Tag 2, die Genexpression , die mit Lipid - Metabolismus und die Angiogenese wird in YSM allmählich erhöht, und die YSM entwickelt sich langsam villus artige Vorsprünge. 8,9 Diese Vorsprünge erhöhen die Absorption von Nährstoffen yolk embryonalen Entwicklung zu unterstützen. Die YSM ist ein extraembryonic Gewebe , das drei Keimblätter, Endoderm, Mesoderm und Ektoderm enthält. 14 Der Dottersack ectoderm steht das Eiweiss und Verbindungen mit der Dotterhaut vorsichtig auf die Dottersack abzudecken. Die endodermaler Epithelzellen direkt auf das Eigelb und dienen als Nährstoffverwertung Portale konfrontiert. 6 Wie der YSM erweitert, endodermaler Epithelzelle (EECs) durch shap unterteilt werdene und Funktionalität in zwei Gruppen, Bereich Dotter und Bereich vasculosa. 7

Gebiet vitelline besteht aus Entodermzellen und ist weit entfernt von dem Embryo; Bereich vasculosa aus mesodermalen Zellen zusammengesetzt und umfasst differenzierte EECs mit Blutgefäßen und Bindegewebe. Durch die embryonale Tag 5 wird das Eigelb vollständig von Ektoderm und Entoderm von YSM bedeckt und das Gefäßbereich ist schnell gewachsen. Die YSM absorbiert, neu zusammensetzt und gibt Lipiden (wie Eigelb abgeleitetes Lipoprotein sehr niedriger Dichte) und Proteine ​​in die embryonalen Kreislaufsystem. 9, 2 Daher wir eine primäre japanischen Wachteln embryonalen endodermalen epithelialen Zellkultur - System, die Mechanismen von Lipid zu studieren Nutzung in YSM während aviären embryonalen Entwicklung.

Lipids wie Triacylglycerol, Lecithin, Phospholipid und Cholesterinester (CE) sind die primären Energiequellen für Vogelembryonen. In den frühen Stadien der Entwicklung, yolk Lipide sind Cin Vogelembryo YSM omposed von nur 1,3% CE und es steigt auf 10-15% bei Halbzeit der aviären Embryonalentwicklung 3, 11. Cholesterinester wird aus Cholesterin durch Sterin O-Acyltransferase 1 (SOAT1) synthetisiert. 4

Die Speicherform von Cholesterin ist CE, CE in Lipoproteinen getragen wird, und Lipoproteine ​​durch Zirkulation zu den Geweben transportiert werden. 13 Eine Woche vor Luke dort schnelle Wachstum von Vogelembryonen ist. Etwa 68% der verbleibenden Lipidgehalte in Eigelb werden in dieser Phase absorbiert. 10 Der Mechanismus , mit dem Eigelb Lipide verwendet werden , können durch eine EWG - Forschungsmodell geklärt werden. Ein Huhn EWG Kulturprotokoll wurde festgestellt , diese Forschungsziel zu erreichen. 2, 9 jedoch aufgrund der geringen Erfolgsrate von Gewebeexplantaten wird eine verbesserte EWG Zellkulturverfahren benötigt , um die Funktion bestimmter Enzyme und Proteine ​​, die in der Vermittlung Nährstoffausnutzung zu untersuchen , indem Vogelembryos während der Entwicklung.

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Protocol

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Hinweis: Dieses Verfahren ist eine Modifikation eines Huhns Modellkulturprotokoll von Bauer entwickelte et al 2013 und Nakazawa et al, 2011. 2,9..

1. Bereiten Sie gesunde embryonale Tag 5 Embryonen aus der japanischen Wachtel

  1. Platz 1 männliche und 3 weibliche geschlechtsreif japanischen Wachtel zusammen im selben Käfig. Versorgung Futter und Wasser ad libitum. Stellen Sie die Licht im Tierraum bis 14 h Licht und 10 h Dunkelheit.
  2. Sammeln Sie befruchtete Eier in Plastiktüten jeden Tag am Nachmittag und halten sie in einem 16 ° C Kühl die Wachstumsrate von Embryonen zu verzögern.
  3. eine ausreichende Anzahl von Eiern in einem Zeitraum von zwei Wochen, brüten die befruchteten Eier in einem 37 ° C Inkubator mit guter Belüftung für fünf Tage Nach dem Sammeln.

2. Bereiten Sie Basal Medium und Waschlösungen

  1. Verwenden DMEM / F-12-Medium (eingestellt auf pH 7,2) als Wachstumsmedium und ergänzen esmit 10% Neugeborenen Kälberserum (NBCS) und 1% Pen-Strep Ampho. Lösung (PSA; Penicillin, 10 5 Einheiten / L; Streptomycin, 100 mg / L; Amphotericin B, 0,25 mg / L).
  2. Bereiten phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Lösung bei einer 10-fach-Konzentration für die Lagerung; verwenden 1x PBS - Lösung (enthaltend NaCl, 137,93 mM; KCl, 2,667 mM; KH 2 PO 4, 1,471 mM; Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 8,06 mM; einstellen auf pH 7,2) , um den Dottersack Membran , während zu waschen und zu befeuchten Trennen des Endoderm aus Eigelb und Albumin.
  3. Verwenden DMEM-Medium (eingestellt auf pH 7,2) auf Endoderm Pellets resuspendieren.

3. Erhebung von Primär EECs aus der japanischen Wachtel YSMs

  1. Inkubieren Sie die gesammelten Eier für 5 Tage (Schritt 1.3). Untersuchen Sie die Eier von einem Ei candler zur normalen embryonalen Entwicklung bestätigen.
    HINWEIS: Bei den embryonalen Tag 5, ist die Grenze von YSM Mesoderm sehr klar, und die drei embryonalen Schichten sind weniger eng miteinander verbunden sind, so ist es leicht zu OBTain endoderm. Verwenden Sie nur die Eier normalen Kapillarzirkulation Entwicklung für YSM Sammlungen zeigen.
  2. Reinigen Sie die Eischale sorgfältig frisches Wasser und 75% Ethanol. Öffnen Sie die Eischale aus der Luftzelle Position durch eine Schere, sanft schälen heraus und das gesamte YSM mit einer Pinzette und in eine 10 cm Kulturschale gefüllt mit 37 ° C 1x PBS.
  3. Mit Schere den Embryo, Eigelb und Eiweiß, zu entfernen und vorsichtig die YSM mit 1x PBS dreimal waschen und legen YSM in PBS-Lösung in einer 10 cm Kulturschale.
  4. Verwenden einer Pinzette und eine Schere das Ektoderm von YSM zu entfernen. Verwenden Sie zwei Zangen, ein fest halten Sie die endodermaler Zellschicht, und die andere die Kapillare Mesoderm zu halten.
  5. Unter einem Binokular, auseinanderziehen und die endoderm vom Rand des Mesoderms in Richtung auf den Embryo zu trennen. Sammeln Sie die hellgelbe endoderm in 50 ml Zentrifugenröhrchen eine Pipette und in 15 ml Wachstumsmedium in einem 37 ° C wat miter Bad, bis alle Gewebesammlungen sind abgeschlossen.

4. Die Verdauung des Endoderm Scheiben von Collagenaseverdau

  1. auflösen frisch 6,5 Einheiten vom Typ IV-Kollagenase in 10 ml DMEM.
  2. Zentrifugieren der 50-ml-Röhrchen (3.4) bei 130 × g für 3 min bei RT. Saugen Sie das Medium und legen alle endoderm in einer 6 cm Kulturschale mit einer Pipette. 1 ml Kollagenase-Lösung dieses Kulturschale.
  3. Schneiden Sie sammelte die endoderm von 2 Wachteln Embryonen mit einem Paar von gebogenen Schere, bis die Größe jeder Scheibe beträgt ca. 2 bis 3 mm. Verwenden Sie eine Pipette, sammeln Sie alle Scheiben in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 9 ml frischem Kollagenase-Lösung.
  4. Digest des Gewebes mit Kollagenase für 30 min in einem 37 ° C Schüttelwasserbad bei 175 Umdrehungen pro Minute. Diese partielle Digestion mit Kollagenase wird verwendet, um das Explantat-Zellproliferation zu verbessern.
  5. Zentrifuge bei 130 × g für 3 min bei RT und entfernen leicht die Überstandsfraktion mit einer Pipette. Waschen Sie das Pellet durch Suspension in 20 ml DMEM und entfernen Sie die überstehenden Fraktion nach 130 xg Zentrifugation für 3 min.
  6. Re-suspend das Pellet mit 12 ml Wachstumsmedium (DMEM / F12 mit 10% NBCS und 1% PSA) und sanft und gleichmäßig in einer 24-Well-Platte (jeweils gut mit 500 ul Zelllösung) Samen.
  7. Inkubieren Gewebeexplantaten bei 37 ° C in 5% CO 2 in Luft für 2 Tage Zellen zu ermöglichen aus dem Gewebe zu vermehren.
  8. Inkubiere Zellen für weitere 2 Tage und Charakterisierung von für die Lebensfähigkeit der Zellen durch eine Assayprotokoll die Zellebensfähigkeit. 15
    HINWEIS: Lebende Zellen pflegen eine reduzierende Umgebung im Cytosol. Resazurin, der Wirkstoff, ein nicht-toxisches, zellpermeablen Verbindung, die in der Farbe blau ist und praktisch nicht fluoreszierend. Wenn zu Zellkulturen gegeben, ist Resazurin reduzierte durch mitochondriale Enzyme im Cytosol zu Resorufin. Resorufin ist in der Farbe rot und stark fluoreszierend. Lebensfähige Zellen kontinuierlich konvertieren Resazurin zu Resorufin, increAsing die Gesamtfluoreszenz und die Farbe des Kulturmediums umgebenden Zellen.
  9. Führen Sie endoderm Epithelzelle Gesamt - RNA Isolierung, reverse Transkription und quantitative Echtzeit - PCR von Marker - Gen - mRNA - Expression , wie beschrieben. 16,17
    1. Verwendung der PCR-Reverse-Transkriptase-SOAT1 mRNA zu detektieren (sense: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; Antisense: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; PCR product = 168 bp) als ein spezifischer Marker für den EWG-Zellen. Verwenden β-Actin-mRNA (Sense: 5 'TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3'; Antisense: 5 'GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; PCR-Produkt = 151 bp) als Housekeeping-Gen und die interne Kontrolle.
    2. Verwenden Sie Gel-Elektrophorese die Produktgröße von RT-qPCR zu erkennen. Bereiten Sie 1% Agarose-Gel und mischen 10 ul qPCR-Produkt mit 2 & mgr; l Lade Farbstoff. Last 10 ul Gemisch in jede Vertiefung in der 1% Agarose-Gel, und führen Sie das Gel durch 100V für 30 min.

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Representative Results

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Um das Ziel der Schaffung eines konsistenten und nützliche Zellmodell zu erreichen, müssen wir die Proliferationsrate und Leistung der aviären EECs zu erweitern und zu stabilisieren. Wir verglichen direkte Inkubation der Endoderm ohne Enzymverdauung mit Endoderm teilweise mit proteolytischen Enzymen wie Kollagenase oder Kollagenase und 0,6 U von Dispase verdaut. Dispase ist ein amino-Endopeptidase, die die N-terminalen Peptidbindungen von nicht-polaren Aminosäureresten hydrolysiert. Während Proteaseverdau Behandlungen erhöhten Zellproliferation im Vergleich ohne Verdauung (Abbildung 1), war das Zellwachstum nicht deutlich verschieden zwischen den beiden Enzymbehandlungen nach fünf Tagen Inkubation (Abbildung 2). Jedoch führte die Kollagenase - Behandlung in einer besseren Wachstumskurve und zeigte , dass EECs 6-9 Tage stetig proliferierten (Abbildung 2). Somit Teil Collagenaseverdau verbessert Wachstum von EECs aus derex-vivo-Explantate und wird empfohlen EWG ausreichende und funktionsfähig zu erhalten.

Nach 4 Tagen Inkubation hatte EECs eine Adipozyten-ähnliche Aussehen nach Formalinfixierung erkannt und Oil-Red - O - Färbung (Abbildung 3), korrekte physiologischen Eigenschaften der kultivierten Zellen hindeutet.

Wir vermuten, dass zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) ein Transkriptionsregulationsmittel, die cAMP-Phosphodiesterase-Inhibitor, 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX; Abbau von cAMP zu verringern) und die Adenylzyklase Aktivator Forskolin (Synthese von cAMP zu erhöhen) sowohl stimuliert SOAT1 mRNA - Expression nach 24 Stunden Behandlung (Abbildung 4). Diese Behandlungen erhöht auch die Expression von Srebp2, einem Cholesterinsynthese regulatorischen Transkriptionsfaktor, und Forskolin verstärkt die Expression von perilipin-2 (PLIN2), der Oberflächenproteinmarker of Lipidtröpfchen (Abbildung 5). Die EWG - mRNA - Profile für lipogenic Gene quantifiziert durch real-time PCR sind ähnlich wie Adipozyten (Abbildung 5).

Abbildung 1
Figur 1. Wirkung von Teil Kollagenaseverdau auf Endodermal Epithelzellen. Tissue Explantate wurden für 2 Tage inkubiert Zellen zu ermöglichen aus dem Gewebe zu vermehren. Wir haben beobachtet, und die Anzahl der erfolgreich gezüchtet EECs berechnet. Zahlen wurden für Zellen ohne Verdauung und Zellen mit Kollagenase verdaut teilweise berechnet wird; beide wurden in Platten mit 24 Vertiefungen gezüchtet. Die Y-Achse wird Anzahl der erfolgreich proliferierten EECs in Zellkulturplatte mit 24 Vertiefungen. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Analyse wurden durch gepaarte t-Test bestimmt. P <0,0001. Bitte klicken Sie hiereine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Die Zellwachstumsleistung von EECs Nach Teil Enzym Verdauung. Die Proliferationsrate wurde durch Zelllebensfähigkeitstest nachgewiesen. Der Test enthielt Resazurin, eine blaue Verbindung, die schwache Fluoreszenz und Resazurin hat reduziert beim Eintritt in Zellen zu Resorufin. Lebensfähige Zellen kontinuierlich wandeln Resazurin zu Resorufin, die Gesamtfluoreszenz und der Farbe der Medien zunehmende umgebenden Zellen. Lebensfähige Zellen wurden durch Absorption bei 570 nm mit einer Normalisierung bei 600 nm detektiert. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Analyse wurden von Zwei-Wege-ANOVA mit Bonferroni Post-Test (Kollagenase Gruppe n = 10; Kollagenase + Dispase Gruppe n = 11) bestimmt. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Bitte click hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Die Morphologie der Cultured EECs. Nach 4 Tagen Inkubation hatte EECs eine Adipozyten-ähnliches Aussehen erkannt , nachdem Formalinfixierung und Oil-Red - O - Färbung. Von links nach rechts: EWG des in Hellfeld mit 100-facher Vergrößerung, in Hellfeld mit 200-facher Vergrößerung und in 200-facher Vergrößerung, nachdem sie mit Öl-roten O und Hämatoxylin-Färbung. Der dunkle Fleck auf der linken Seite von ganz links Figur ist die teilweise verdaute endoderm (Membran). Maßstabsbalken entspricht 200 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Der SOAT1 Transschreibung von EECs mit cAMP Activators behandelt. Wir behandelten EECs mit Konzentrationen von IBMX oder Forskolin am Tag 5 für 24 Stunden zu erhöhen. Wir extrahierten mRNAs von behandelten Zellen und umgewandelt, um die RNA in cDNA durch reverse Transkription PCR. Wir analysierten die Transkription Ebenen durch quantitative Echtzeit-PCR. β-Actin wurde als Housekeeping-Gen verwendet. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Analysen wurden durch Einweg-ANOVA mit Tukey-post-Test (n = 6) (* P≤ 0,05, ** P≤ 0,01). IBMX ist ein kompetitiver nicht-selektiven Phosphodiesterase-Hemmer, die intrazellulären cAMP erhöht, aktiviert PKA inhibiert TNF-alpha und Leukotrien-Synthese, reduziert Entzündungen und angeborene Immunität und ist ein nicht-selektiven Adenosin-Rezeptor-Antagonist. Forskolin ist ein allgegenwärtiges Aktivator von eukaryotischen Adenylylcyclase, häufig cAMP - Spiegel zu erhöhen verwendet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieses figu anzuzeigenRe.

Abbildung 5
Abbildung 5. Die mRNA Expressions of Grown der EWG für fünf Tage, dann 24 Stunden lang mit cAMP Activators behandelt. Die cDNA in Abbildung 4 wurden verwendet , um Genexpressionsniveaus durch quantitative Echtzeit - PCR - Analyse. β-Actin wurde als Housekeeping-Gen und diente als interne Kontrolle verwendet. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Analysen wurden durch Einweg-ANOVA mit Tukey-post-Test (n ≤ 6) Behandlungen zur Kontrolle zu vergleichen. Srebp2, Srebp 2; LPL, Lipoprotein-Lipase; PLIN2, perilipin-2. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Da die vorherige Kultursystem nur begrenzten Erfolg hat, wird eine bessere Kultursystem erforderlich. Die japanische Wachtel YSM endoderm erfordert eine Behandlung mit proteolytischen Enzymen wie Kollagenase, die Zell-Zell-Verbindungen zu lösen bessere Wachstumsleistung in den ex-vivo-Explantate zu erreichen. Unsere Daten zeigen , dass die Zellzahlen von partiellen Verdau Behandlung waren größer als der unverdauten Gewebekultur nach 2 Tagen nach der Aussaat (Abbildung 1). Daher ist die partielle proteolytische Verdauung ein kritischer Schritt Zellausbeute aus dem YSM zu verbessern.

Die kritische Änderung in der aktuellen Kultur-Protokoll ist das partielle proteolytische Verdauung. Diese Behandlung stark verbessert die Zellausbeute und die erfolgreiche Rate Live EECs zu erhalten. Die Verdauungszeit ist sehr wichtig, da über Verdauung Zellen aus dem Gewebe getrennt werden und Zellen nicht an der Platte befestigen, während unter Verdauung in weniger Zellausbeute aus der resultierendeGewebeexplantaten. Wir fanden, dass 30 bis 40 min Verdau die Bedingungen unter Verwendung von oben beschriebenen optimal ist.

Das aktuelle Protokoll erfordert eine hohe technische Ausbildung EECs zu erhalten. Der Zeitpunkt des Sammelns EECs beschränkt ist, haben wir beispielsweise nur sammeln EECs an embryonalen Tag 5. Der Grund ist, dass als Vogelembryos zu wachsen, die Verbindungen zwischen den Schichten in den Dottersack Membran komplexer sind, und es verringert die erfolgreiche Rate des Sammelns EECs. Das Protokoll kann verwendet werden EECs von Embryonen im Frühstadium zu erhalten, aber nicht spät Embryonen. Er begrenzt die Möglichkeit der direkten Forschung über die späten Stadium EECs.

Die Expression von SOAT1 und Lipoprotein - Lipase und Lipidakkumulation sind wesentliche Merkmale des YSM 4,5,11, insbesondere die EECs. In der aktuellen Studie, SOAT1, LPL und perilipin 2 (PLN2) mRNA wurden hoch in den EECs ausgedrückt, das Kultursystem darauf hindeutet, können die Zellen mit der richtigen physiologischen charact erzeugenEristik. Die aktuelle Technik erzeugt eine große Menge an Primär EECs. Wenn wir den vorherigen beschriebenen Verfahren 9 verwendet wird , war die Erfolgsquote der EWG Kultur etwa 60% in Zellkulturplatten von 24-Well, während das aktuelle Protokoll EECs bei fast 100% Erfolgsquote erzielt.

Dottersack Membran ist das Hauptgewebe zu absorbieren, Proteine, Lipide und Cholesterin aus Eigelb, dadurch funktionierende Nährstoffe zu übertragen aus Eigelb zu Embryonen während der Entwicklung. Das Hauptenzym für die Cholesterin - Ester - Bildung ist SOAT1. 11 Da SOAT1 dramatisch in den späten Stadien der aviären embryonalen Entwicklung erhöht , wenn massiven Cholesterinveresterungs 4 auftritt, haben wir SOAT1 mRNA - Expression als Marker - Gen für die Eigenschaften von kultivierten EECs auszuwerten. Wir haben gezeigt, dass diese primäre EWG Kultursystem physiologischen Eigenschaften erwartet produziert. Daher kann die EWG-Kultursystem ein wertvolles Werkzeug sein embryon zu studierenic Lipid-Transport und die Rolle der Gene bei der Vermittlung der Nährstoffverwertung in YSM während avian Embryonalentwicklung beteiligt zu klären.

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Acknowledgments

Die Finanzierung für die Entwicklung des aktuellen Protokolls ist vor allem durch "Ziel für die Top-Universität Plan" von der National Taiwan University, Taiwan (Zuschuss ID-104R350144) sowie das Ministerium für Wissenschaft und Technologie von Taiwan (Erteilungs ID unterstützt: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). Wir danken vor allem das Zentrum für Biotechnologie der National Taiwan University zur Bereitstellung eines Tierraum und Laborflächen für die aktuelle Studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by Life technologies 12800-017 10 X 1 L For wash the EECs pellets
D-MEM/F-12 Gibco by Life technologies 12400-024 10 X 1 L As the basal medium in culturing EECs
NBCS Gibco by Life technologies 16010-159 As the supplyment serum in culturing EECs
Pen-Strep Ampho. Solution BI (Biological Industries) 03-033-1B 100 ml For attenuating the possible infection 
Collagenase Type IV Gibco by Life technologies 17104-019 1 g  Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue.
24-well plate FALCON® REF-353047 For EECs to attach and extension
50 ml PP centrifuge tubes Corning® CentriStarTM 430829 For transportion of membranes and enzyme digestion
50 ml Conical bottomed Tube with Cap PRO TECH CT-50-PL-TW For transportion of membranes and enzyme digestion
Reciprocal shaking bath DEAGLE SB302 For better enzymatic digestion on membranes

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References

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Primäre Endodermal Epithelial Cell Culture aus dem Dottersack-Membran der japanischen Wachtel Embry
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Lin, H. J., Wang, S. H., Pan, Y. H., Ding, S. T. Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53624, doi:10.3791/53624 (2016).More

Lin, H. J., Wang, S. H., Pan, Y. H., Ding, S. T. Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53624, doi:10.3791/53624 (2016).

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