Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו

doi: 10.3791/53624 Published: March 10, 2016

Abstract

הקמנו מודל תרבית תאים endodermal אפיתל (EEC) ללימוד פונקציה של אנזימים מסוימים וחלבונים בתיווך ניצול מזין ידי עוברי העופות במהלך הפיתוח. ביצי שליו יפניות מופרות הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים ולאחר מכן חלמון ממברנות צק (YSM) נאספו להקים מערכת התרבות EEC. בודדנו את שכבת endoderm העוברית YSM, וחתכתי את הממברנה לתוך 2 - 3 חתיכות מ"מ ו מעוכל חלקית עם collagenase לפני זריעת צלחות תרבות 24 גם. EECS להתרבות מתוך הרקמה והם מוכנים ללימודי תרבית תאים. מצאנו כי EECS היו מאפיינים טיפוסיים של YSM in vivo, למשל, הצטברות של טיפות השומנים, ביטוי sterol O-acyltransferase וטריפז השומנים בדם. טיפול עיכול חלקי גדיל משמעותי את השיעור המוצלח של תרבות EEC. ניצול EECS, הראינו כי הביטוי של SOAT1 הוסדר על ידי ד cAMPחלבון ependent kinase מסלול רציף קשור. מערכת תרבות EEC שליו היפנית העיקרית זהו כלים שימושיים ללמוד תחבורת שומנים עוברית להבהיר את התפקיד של גני המעורבים בתיווך ניצול מזין YSM במהלך התפתחות עוברית עופות.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המשאב התזונתי העיקרי של עובר העופות הוא חלמון, מורכב 33 שומני%, 17% חלבון, ו -1% אפר. 1 במהלך התפתחות עוברית, קרום צק חלמון (YSM) גדל מתוך חלל הבטן העוברי ובהדרגה מכסה את החלמון משטח. החל ביום עוברי 2, ביטוי גנים הקשורים לחילוף חומרי אנגיוגנזה שומנים הוא גדל בהדרגת YSM, ואת YSM מתפתחת לאט תחזיות סיסיות דמויות. 8,9 תחזיות אלו להגדיל ספיגת מזון בגוף חלמון לתמוך התפתחות עוברית. YSM הוא רקמת extraembryonic המכיל שלוש שכבות הנבט, האנדודרם, והמזודרם ו האאקטודרם. 14 האאקטודרם שק חלמון פונה חלבון וקישורים עם קרום vitelline כדי לכסות את שק החלמון בעדינות. לתאי האפיתל endodermal מתמודדים ישירות לעבר חלמון ביצה ולשמש פורטלים ניצול מזין. 6 ככל YSM מתרחב, תא אפיתל endodermal (EECS) ניתן לחלק ידי shapדואר ופונקציונלי לשתי קבוצות, vitelline האזור והאזור vasculosa. 7

vitelline פינת מורכב של תאים endodermal והוא רחוק מן העובר; vasculosa באזור מורכב של תאי mesodermal ומכסה EECS בדיל עם כלי דם ורקמות חיבור. על ידי עוברי יום 5, החלמון מכוסה לחלוטין על ידי האאקטודרם ו endoderm של YSM ואזור וסקולרית גדל בקצב מהיר. YSM סופג, גורם לבנייה מחדש ומשחרר שומנים (כמו החלמון נגזר ליפופרוטאין בצפיפות נמוך מאוד) וחלבונים לתוך מערכת הדם העוברית. 9, 2 לכן, הקימו מערכת תרבית תאי אפיתל endodermal עוברית שליו יפנית עיקרית, כדי לחקור את המנגנונים של שומנים הנצילות YSM במהלך ההתפתחות העוברית העופות.

ליפידים כגון triacylglycerol, לציטין, פוספוליפידים ואסתר כולסטרול (CE) הם מקורות האנרגיה העיקריים עוברות עופות. בשלבים המוקדמים של פיתוח, שומני חלמון הם גomposed של CE 1.3% בלבד והוא עולה ל 10-15% ב אמצע הקדנציה של פיתוח 3 עובריים העופות, 11. אסתר כולסטרול הוא מסונתז מכולסטרול על ידי 1-acyltransferase O sterol (SOAT1) ב YSM העובר העופות. 4

צורת האחסון של כולסטרול היא CE, CE מתבצעת ליפופרוטאינים, ו ליפופרוטאינים מועברים על ידי מחזור דם לרקמות. 13 שבוע לפני הצוהר יש צמיחה מהירה של עוברי עופות. כ -68% מתוכן השומנים שנותר חלמון נספגים בשלב זה. 10 המנגנון שבאמצעותו חלמון שומנים מנוצלים ניתן לברר באמצעות מודל מחקר EEC. פרוטוקול תרבות עוף EEC הוקם כדי להשיג את מטרה במחקר זה. 2, 9 עם זאת, עקב שיעור ההצלחה הנמוך של explants רקמות, הליך תרבית תאים משופר EEC נדרש כדי ללמוד את הפונקציה של אנזימים מסוימים וחלבונים בתיווך ניצול מזין ידי עוברי עופות במהלך פיתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: הליך זה הוא שינוי של פרוטוקול תרבות מודל עוף שפותחה על ידי באואר ואח '2013 Nakazawa ואח', 2011. 2,9..

1. הכין בריא עוברי יום 5 עובר מן השליו יפני

  1. מקום 1 זכר ונקבה 3 שליו יפני בוגרים מינית יחד באותו כלוב. Feed היצע כרצונך מים. התאם את האור בחדר חיה ל -14 שעות של אור ו -10 שעות חושך.
  2. איסוף ביצים מופרות בשקיות פלסטיק בכל יום בשעות אחר הצהריים ולשמור אותם במקרר 16 ° C לעכב את קצב הצמיחה של עוברים.
  3. לאחר איסוף מספר מספיק של ביצים בתוך תקופה של שבועיים, לדגור על הביצים המופרות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם אוורור טוב במשך חמישה ימים.

2. כן בסל בינוני לשטוף פתרונות

  1. השתמש DMEM / F-12 בינוני (מותאם pH 7.2) כמדיום הצמיחה, ומשלימים זהעם 10 סרום חדש נולד% עגל (NBCS) ו -1% פן-סטרפטוקוקוס Ampho. פתרון (PSA; פניצילין, 10 5 יחידות / L; סטרפטומיצין, 100 מ"ג / L; Amphotericin B, 0.25 מ"ג / ליטר).
  2. כן בופר פוספט פתרון (PBS) בריכוז 10x לאחסון; לשימוש פתרון PBS 1x (המכיל NaCl, 137.93 מ"מ; KCl, 2.667 מ"מ; KH 2 4 PO, 1.471 מ"מ; Na 2 HPO 4 -7 ש 2 O, 8.06 מ"מ; להסתגל 7.2 pH) כדי לשטוף להרטיב אותו זמן קרום שק החלמון הפרדת endoderm מן החלמון אלבומין ביצה.
  3. השתמש בינוני DMEM (מותאם pH 7.2) מחדש להשעות כדורי האנדודרם.

אוסף 3. EECS ראשית ממנהל YSMs יפני שליו

  1. לדגור על הביצים שנאספו במשך 5 ימים (שלב 1.3). בדוק את הביצים על ידי בודק ביצים כדי לאשר התפתחות עוברית נורמלית.
    הערה: ביום עוברי יום 5, הגבול של mesoderm YSM הוא מאוד ברורה ואת 3 השכבות העובריות הן פחות בחוזקה צמודות זו לזו, כך קל OBendoderm טיין. השתמש רק את הביצים מראות פיתוח זרימת נימים נורמלי אוספים YSM.
  2. נקה את קליפת הביצה באמצעות מים מתוקים בזהירות אתנול 75%. פתח את קליפת הביצה מעמדת תא אוויר על ידי זוג מספריים, לקלף בעדינות החוצה לאסוף את כל YSM ידי מלקחיים ומניחים בצלחת תרבות 10 ס"מ מלא 37 ° C 1x PBS.
  3. בעזרת זוג מספריים להסיר את העובר, חלמון ביצה-לבן, לשטוף בעדינות את YSM עם 1x PBS שלוש פעמים ומניחים YSM בתמיסה PBS בצלחת תרבות 10 ס"מ.
  4. שימוש במלקחיים וזוג מספריים כדי להסיר את האאקטודרם מ YSM. שימוש 2 מלקחיים, אחד להחזיק את שכבת תאי endodermal בתקיפות, ושני להחזיק את המזודרם נימי.
  5. תחת מיקרוסקופ לנתח, לפרק ולהפריד את endoderm מהקצה של mesoderm בכיוון כלפי העובר. אסוף את endoderm אור צהוב 50 מ"ל צינורות צנטריפוגות באמצעות טפטפת ומניחים 15 מ"ל של מדיום הגידול בתוך וואט 37 ° Cאה באמבטיה עד כל אוספי הרקמות הושלמו.

4. עיכול של פרוסות endoderm ידי Collagenase עיכול

  1. טרי לפזר 6.5 יחידות של collagenase מסוג IV ב 10 מ"ל של DMEM.
  2. צנטריפוגה 50 מ"ל צינורות (3.4) ב 130 XG 3 דקות ב RT. לשאוב את המדיום ולמקם כל endoderm בצלחת תרבות 6 ס"מ בעזרת פיפטה. הוסף פתרון collagenase 1 מ"ל ל צלחת תרבות זו.
  3. פורסים את endoderm שנאספו 2 עוברים שליו עם זוג מספריים מעוקל עד לגודל של כל פרוסה הוא כ 2 עד 3 מ"מ. השתמש טפטף, לאסוף את כל הפרוסות לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר יחד עם 9 מיליליטר של תמיסת collagenase הטריה.
  4. לעכל את הרקמה עם collagenase למשך 30 דקות באמבט מים רועד 37 מעלות צלזיוס ב 175 סל"ד. עיכול חלקי זה עם collagenase משמש כדי לשפר את התפשטות תאי explant.
  5. צנטריפוגה ב 130 XG 3 דקות ב RT בעדינות להסיר את החלק היחסי supernatant בעזרת פיפטה. שטפו את הכדור על ידי השעיית ב 20 מ"ל DMEM ולהסיר את החלק היחסי supernatant לאחר צנטריפוגה 130 XG במשך 3 דקות.
  6. Re- להשעות את גלולה עם 12 מ"ל של מדיום הגידול (DMEM / F12 עם 10% ו -1% NBCS PSA) וזרעי בעדינות שווה לתוך צלחת 24 גם (כל טוב עם 500 פתרון התא μl).
  7. דגירה explants רקמות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באוויר במשך 2 ימים כדי לאפשר לתאים להתרבות מתוך הרקמות.
  8. דגירה תאים עבור 2 ימים נוספים ולאפיין עבור כדאיות התא על ידי פרוטוקול assay כדאיות התא. 15
    הערה: תאי חיים לשמור על סביבת הפחתה בתוך cytosol. Resazurin, המרכיב הפעיל, הוא תרכובת חדירה רעילה, תא זה כחול בצבע הלא ניאון כמעט. כאשר נוספו בתרביות תאים, resazurin מצטמצם resorufin ב cytosol על ידי אנזימים המיטוכונדריה. Resorufin הוא בצבע אדום ניאון מאוד. תאים חיים להמיר ברציפות resazurin כדי resorufin, increasing הקרינה והצבע הכולל של מדיום תרבות תאים הסובבים.
  9. בצע בידוד RNA הכולל תא אפיתל endoderm, הפוכה שעתוק בזמן אמת PCR כמותי של ביטוי mRNA הגן סמן כמתואר. 16,17
    1. השתמש PCR transcriptase הפוך לזהות SOAT1 mRNA (במובן: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; antisense: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; PCR מוצר = 168 נ"ב) כסמן ספציפי עבור תאי EEC. השתמש β-תקטין mRNA (במובן: 5'- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '; antisense: 5'- GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; מוצר PCR = 151 נ"ב) כמו גן משק ובקרה פנימית.
    2. השתמש ג'ל אלקטרופורזה כדי לזהות את גודל המוצר של RT-qPCR. כן 1% ג'ל agarose, ומערבב 10 μl מוצר qPCR עם צבע טעינה 2 μl. תערובת טען 10 μl היטב לתוך כל אחד בתוך הג'ל agarose 1%, ולהפעיל את הג'ל על ידי 100V במשך 30 דקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

על מנת להשיג את המטרה של הקמת מודל תא עקבי ושימושי, אנחנו צריכים להרחיב ולייצב את קצב ההתפשטות וביצועים של EECS עופות. השווינו דגירה ישירה של endoderm ללא עיכול אנזים עם endoderm מעוכל חלקית עם אנזימים פרוטאוליטים, כגון collagenase או collagenase בתוספת 0.6 U של dispase. Dispase הוא-endopeptidase אמינו hydrolyzes אג"ח פפטיד N- מסוף של שאריות חומצת אמינו לא-קוטביות. בעוד טיפולי עיכול פרוטאז גדלו התפשטות תאים בהשוואה להעדר עיכול (איור 1), צמיחת תאים לא הייתה שונה במידה ניכרת בין שני טיפולי האנזים לאחר דגירת חמש ימים (איור 2). עם זאת, טיפול collagenase הביא עקומת צמיחה טובה והראה כי EECS התרבה ​​בהתמדה במשך 6-9 ימים (איור 2). לכן, עיכול collagenase חלקית שיפור צמיחה של EECS מןלשעבר vivo explants והוא מומלץ להשיג EEC מספיק ופונקציונלי.

לאחר דגירה 4 ימים, היה EECS הופעה adipocyte דמוי זוהה לאחר קיבוע בפורמלין שמן-האדום מכתים O (איור 3), מה שמרמז על מאפיינים פיזיולוגיים הנכון של תאים בתרבית.

החוקרים שיערו כי monophosphate אדנוזין מחזורית (cAMP) הוא סוכן רגולטוריות שעתוק, מעכב phosphodiesterase cAMP, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX; להפחית השפלה של cAMP) ואת activator cyclase adenyl, forskolin (להגדיל סינתזה של cAMP) הן מגורה ביטוי mRNA SOAT1 לאחר 24 טיפול שע '(איור 4). טיפולים אלה גם הגדילו את הביטוי של SREBP2, גורם שעתוק רגולטוריות יצור כולסטרול, ואת forskolin משופר הבעת perilipin-2 (PLIN2), O את סמן חלבון המשטחטיפות שומני f (איור 5). פרופילי mRNA EEC עבור גני lipogenic לכמת ידי PCR בזמן האמת דומים adipocytes (איור 5).

איור 1
איור 1. השפעת עיכול Collagenase חלקית על תאי אפיתל Endodermal. Explants רקמות הודגרו במשך 2 ימים כדי לאפשר לתאים להתרבות מתוך הרקמה. צפינו וחשבנו את המספרים של EECS גדל בהצלחה. מספרים חושבו עבור תאים ללא עיכול ותאי מעוכלים חלקית עם collagenase; הן גדלו ב 24 גם הצלחות. ציר Y הוא מספר גם של EECS התרבו בהצלחה בצלחת תרבית תאים של היטב 24. נתונים הוצגו כממוצע ± SEM. ניתוח נקבע על ידי מבחן t מזווג. P <0.0001. אנא לחץ כאןכדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. ביצועי צמיחת תאים של EECS לאחר עיכול אנזים חלקי. שיעור התפשטות זוהה על ידי assay כדאיות התא. את assay הכלול resazurin, תרכובת כחולה כי יש קרינה חלשה resazurin מצטמצם resorufin בכניסת תאים. תאים חיים ברציפות להמיר resazurin כדי resorufin, הגדלת הקרינה ואת הצבע הכללי של התקשורתי סביב התאים. תאי חיים התגלו על ידי ספיגה ב 570 ננומטר עם נורמליזציה ב 600 ננומטר. נתונים הוצגו כממוצע ± SEM. ניתוח נקבעו על ידי דו כיוונית ANOVA עם Bonferroni שלאחר הבדיקה (קבוצת collagenase n = 10; collagenase + dispase קבוצת n = 11). * P <0.05, ** P <0.01, *** p <0.001. אנא CLICK כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. מורפולוגיה של מתורבתות EECS. לאחר דגירה 4 ימים, היה EECS הופעה adipocyte דמוי זוהה לאחר קיבוע בפורמלין שמן-אדום O מכתים. משמאל לימין: EEC של בתחום בהיר עם הגדלה 100X, בתחום בהיר עם הגדלה 200X ו בהגדלה 200X לאחר צביעה עם O ו hematoxylin שמן-אדום. הכתם הכהה בצד שמאל של הדמות השמאל הקיצוני הוא endoderm מעוכל חלקית (ממברנה). סרגל קנה מידה מייצג 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. טרנס SOAT1cription של EECS נידון cAMP מטהרים. התייחסו EECS עם ריכוז גדל והולך של IBMX או forskolin ביום 5 למשך 24 שעות. שחילצנו mRNAs מתאי שטופלו והמיר את RNA לתוך cDNA על ידי שעתוק לאחור PCR. ניתחנו רמות שעתוק על ידי PCR כמותי בזמן אמת. β-תקטין שמש גן המשק. נתונים הוצגו כממוצע ± SEM. ניתוח היו ידי ANOVA חד כיווני עם שלאחר הבדיקה של Tukey (n = 6) (* 0.05 P≤, ** 0.01 P≤). IBMX הוא מעכב phosphodiesterase nonselective תחרותי אשר מעלה cAMP תאיים, מפעיל PKA, מעכב TNF-Alpha וסינתזה leukotriene, מפחית דלקת חסינות מולדת והוא אנטגוניסט לקולטן לאדנוזין לא סלקטיבי. Forskolin הוא מפעיל בכל מקום של cyclase adenylyl איקריוטיים, נפוץ להעלות רמות של cAMP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של figu זהמִחָדָשׁ.

איור 5
איור 5. ביטויי mRNA של Grown של EEC במשך חמישה ימים, ואז טפלו עם cAMP מטהרים למשך 24 שעות. את cDNA של באיור 4 שמשו לנתח רמות ביטוי גנים על ידי בזמן אמת PCR כמוני. β-יקטין שמש גן המשק ושמש הבקרה הפנימית. נתונים הוצגו כממוצע ± SEM. ניתוח היו ידי ANOVA חד כיווני עם שלאחר הבדיקה של Tukey (n≤ 6) כדי להשוות טיפולים לשליטה. SREBP2, אלמנט מחייב רגולטוריות sterol חלבון 2; LPL, lipase ליפופרוטאין; PLIN2, perilipin-2. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כיוון שמערכת התרבות הקודמת יש הצלחה מוגבלת בלבד, מערכת התרבות טוב יותר הוא זקוק. Endoderm YSM שליו יפני נזקק לטיפול אנזימים מפרקי חלבונים כגון collagenase כדי לשחרר את הצמתים תאים תאים כדי להשיג ביצועים לצמיחה טובה יותר של explants-vivo לשעבר. הנתונים שלנו מראים כי מספרים סלולריים מטיפול עיכול חלקית היו גדולים יותר מן תרבות רקמות המעוכלת לאחר זריעת 2 ימים (איור 1). לכן, עיכול פרוטאוליטים חלקית הוא שלב קריטי כדי לשפר את תשואת תא מן YSM.

השינוי הקריטי פרוטוקול התרבות הנוכחי הוא אכול פרוטאוליטים חלקית. טיפול זה משופר תשואת התא מאוד והשיעור המוצלח של קבלת EECS החי. שעת העיכול היא קריטית מאוד כי יתר עיכול יפריד תאים מהרקמות ותאים לא לצרף צלחת, בעוד שלפי עיכול הביא תשואת תא פחות מןexplants רקמות. מצאנו כי 30 עד 40 עיכול דקות באמצעות התנאים שתוארו לעיל הוא אופטימלי.

הפרוטוקול הנוכחי דורש הכשרה טכנית גבוהה כדי להשיג EECS. נקודת הזמן של איסוף EECS מוגבלת, למשל, אנחנו רק לאסוף EECS ביום עוברי 5. הסיבה לכך היא כמו עוברי עופות גדלים, הקשרים בין שכבות בקרום צק חלמון מורכבים יותר זה מקטין את השיעור המוצלח של איסוף EECS. הפרוטוקול יכול לשמש כדי להשיג EECS של בעוברים בראשית התפתחותם, אך לא עוברים שלב מאוחר. זה מגביל את האפשרות של מחקר הישיר על EECS בשלב מאוחר.

הביטוי של SOAT1 וטריפז ליפופרוטאין, וצבירת שומנים הם מאפיינים מהותיים של 4,5,11 YSM, ובמיוחד EECS. במחקר הנוכחי, SOAT1, LPL, ו perilipin 2 (PLN2) mRNA התבטאו ביותר ב EECS, דבר המצביע על מערכת התרבות יכול לייצר תאים עם charact הפיזיולוגי הנכוןeristics. הטכניקה הנוכחית פיק כמות גדולה של EECS העיקרי. כאשר השתמשנו ההליך המתואר הקודם 9, שיעור ההצלחה של תרבות EEC עמד על כ -60% צלחות תרבית תאים של 24 גם, ואילו הפרוטוקול הנוכחי שנוצר EECS כמעט 100% אחוזי הצלחה.

קרום שק החלמון הוא הרקמה העיקרית לקלוט חלבונים, שומנים, כולסטרול מן החלמון, ובכך לתפקד להעביר חומרים מזינים מן החלמון עוברי במהלך הפיתוח. האנזים העיקרי להיווצרות אסתר כולסטרול הוא SOAT1. 11 בגלל SOAT1 מגדיל באופן דרמטי בשלבים המאוחרים של ההתפתחות העוברית העופות כאשר esterification כולסטרול מאסיבי מתרחש 4, השתמשנו בביטוי mRNA SOAT1 כמו הגן סמן להערכת מאפייני EECS תרבותי. הראינו כי מערכת התרבות EEC הראשוני הזה הופק צפוי מאפיינים פיזיולוגיים. לכן, מערכת תרבות EEC יכולה להיות כלי רב ערך כדי ללמוד embryonתחבורה השומנים ic ולהבהיר את התפקיד של גנים המעורבים בתיווך ניצול מזין YSM במהלך ההתפתחות העוברית העופות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

מימון לפיתוח הפרוטוקול הנוכחי נתמך בעיקר על ידי "לשאוף תוכנית Top אוניברסיטת" של האוניברסיטה הלאומית של טייוואן, טייוואן (מענק ID-104R350144), כמו גם את משרד המדע והטכנולוגיה של טייוואן (ID מענק: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). תודה מיוחדת במרכז לביוטכנולוגיה של הלאומית טייוואן אוניברסיטת למתן חדר חיה ומרחב מעבדה לחקר הנוכחי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by Life technologies 12800-017 10 X 1 L For wash the EECs pellets
D-MEM/F-12 Gibco by Life technologies 12400-024 10 X 1 L As the basal medium in culturing EECs
NBCS Gibco by Life technologies 16010-159 As the supplyment serum in culturing EECs
Pen-Strep Ampho. Solution BI (Biological Industries) 03-033-1B 100 ml For attenuating the possible infection 
Collagenase Type IV Gibco by Life technologies 17104-019 1 g  Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue.
24-well plate FALCON® REF-353047 For EECs to attach and extension
50 ml PP centrifuge tubes Corning® CentriStarTM 430829 For transportion of membranes and enzyme digestion
50 ml Conical bottomed Tube with Cap PRO TECH CT-50-PL-TW For transportion of membranes and enzyme digestion
Reciprocal shaking bath DEAGLE SB302 For better enzymatic digestion on membranes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review. Poult Sci. 92, (12), 3292-3299 (2013).
  2. Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288, (2), 1088-1098 (2013).
  3. Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74, (2), 374-382 (1995).
  4. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79, (10), 1460-1464 (2000).
  5. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81, (7), 1065-1070 (2002).
  6. Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35, (4), 340-348 (1996).
  7. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155, (3), 287-309 (1979).
  8. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160, (3), 285-308 (1981).
  9. Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240, (8), 2002-2010 (2011).
  10. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29, (2), 107-140 (1990).
  11. Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28, (7), 621-625 (1993).
  12. Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91, (8), 1941-1949 (2012).
  13. Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129, (2), 467S-472S (1999).
  14. Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46, (3), 229-238 (2004).
  15. alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
  16. Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014, (1), 310981 (2014).
  17. Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).
הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, H. J., Wang, S. H., Pan, Y. H., Ding, S. T. Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53624, doi:10.3791/53624 (2016).More

Lin, H. J., Wang, S. H., Pan, Y. H., Ding, S. T. Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53624, doi:10.3791/53624 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter