Abstract
우리는 개발 과정에서 조류 배아에 의해 영양소 이용률을 매개하는 특정 효소와 단백질의 기능을 연구하는 내배엽 상피 세포 배양 모델 (EEC)를 설립했다. 수정 된 일본어 메추라기 계란 5 일 동안 37 ° C에서 배양 한 다음 골목 막 (YSM)는 EEC 문화 시스템을 구축하기 위해 수집 노른자 하였다. 우리 YSM에서 배아 내배엽 층을 단리하고, (2) 내에 막 분리 - MM 3 개의 부분적으로 24 웰 배양 플레이트에 파종 전에게나로 분해. EECS는 조직에서 증식 및 세포 배양 연구를위한 준비가되어 있습니다. 우리는 EECS 예를 들어 생체 내에서 YSM의 일반적인 특성, 지질 방울의 축적, 스테롤 O-아실 트란스 퍼과 지단백 리파제의 발현을 한 것으로 나타났습니다. 부분 소화 치료는 크게 EEC 문화의 성공적인 속도를 증가했다. EECS을 활용, 우리는 SOAT1의 발현이 캠프 D에 의해 규제 것을 증명ependent 단백질은 관련 경로를 키나아제. 이 차 일본어 메추라기 EEC 문화 시스템은 배아 지질 수송을 연구하고 조류 배아 개발하는 동안 YSM 영양소 이용률을 매개에 관여하는 유전자의 역할을 명확히하기 위해 유용한 도구입니다.
Introduction
조류 배아의 주요 영양 자원이 33 % 지질, 17 %의 단백질로 구성 노른자, 1 % 재. 1 배아 개발 중입니다, 난황 막 (YSM)는 배아 복강 내에서 성장하고 점차적으로 노른자를 커버 표면. 배아 2 일에 시작하여, 지질 대사 및 혈관 신생과 관련된 유전자의 발현이 점차 YSM 증가되고 YSM 천천히 융모와 같은 돌기를 발생한다. -8,9- 이러한 돌기는 배아 발달을 지원하기 노른자 영양소의 흡수를 증가시킨다. YSM 세 가지 배엽, 내배엽, 중배엽과 외배엽을 포함하는 배외 (extraembryonic) 조직이다. (14) 난황 외배엽 부드럽게 난황을 포함하는 난황 막과 알부민 및 링크에 직면 해있다. 내배엽 상피 세포는 shap로 나눌 수있다 달걀 노른자를 향해 직접 직면하고 영양 활용 포털의 역할을한다. 6 YSM이 확장하면서, 내배엽 상피 세포 (EECS)를하고 있습니다두 그룹, 지역 난황 및 지역 vasculosa에 전자 및 기능을 제공합니다. (7)
영역 난황는 내배엽 세포로 구성되며 배아로부터 떨어진되고 영역 vasculosa는 중배엽 세포로 구성되고, 혈관 결합 조직으로 분화 EECS을 덮는다. 배아 5 일까지, 노른자는 완전히 YSM의 외배엽과 내배엽이 적용되고, 혈관 영역은 빠른 속도로 성장하고있다. YSM은 배아 순환 시스템으로 (노른자 유래 매우 저밀도 지질 단백질 등)과 단백질. 9, 2 따라서, 우리는 지질의 메커니즘을 연구하기 위해, 기본 일본어 메추라기 배아 내배엽 상피 세포 배양 시스템을 구축 recomposes 해제 지질 흡수 조류 배아 개발하는 동안 YSM에 활용.
예컨대 중성 지방, 레시틴, 인지질 및 콜레스테롤 에스테르 (CE)와 같은 지질 조류 배아의 주 에너지 원이다. 개발의 초기 단계에서, 난황 지질 C는1.3 %의 CE의 omposed하고 조류 배아 발달 (3)의 중간 10-15 %로 상승, 11. 콜레스테롤 에스테르 조류 배아 YSM에 스테롤 O-아실 트랜스퍼 라제 1 (SOAT1)에 의해 콜레스테롤로부터 합성된다. (4)
콜레스테롤의 저장 형태는 CE, CE는 지질 단백질에 실시하고, 지질 단백질은 조직에 혈액 순환에 의해 수송된다. 13 주 해치 전에 조류 배아의 급속한 성장이있다. 약 노른자의 나머지 지질 함량의 68 %는이 단계에서 흡수된다. 10 지질 EEC 연구 모델로 정화 할 수있다 이용된다 노른자하는 메커니즘. 닭 EEC 배양 프로토콜은 본 연구의 목표를 달성하기 위해 설립되었다. 2, 9, 그러나, 향상된 EEC 세포 배양 방법에 의해 영양분 활용도를 매개 특정 효소와 단백질의 기능을 연구하는데 필요한 조직 이식편의 낮은 성공률로 개발하는 동안 조류 배아.
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Protocol
참고 :..이 절차는 등 바우어 등 2013 나카자와 등, 2011 년 2,9에 의해 개발 된 치킨 모델 문화 프로토콜의 수정입니다
1. 건강한 배아 5 일 태아 일본어 메추라기에서 준비
- 같은 케이지에서 함께 한 남자와 세 여성의 성적으로 성숙한 일본어 메추라기를 놓습니다. 전원 공급 및 임의 량의 물. 빛의 14 시간과 어둠의 10 시간에 동물 방에 빛을 조정합니다.
- 오후에 매일 비닐 봉지에 수정 된 알을 수집하고 태아의 성장 속도를 지연하기 위해 16 ° C 냉장고에 보관하십시오.
- 2 주 기간 내에 계란의 충분한 수를 수집 한 후, 5 일 동안 통풍이 잘되는 37 ° C 배양기에서 수정 된 알을 품어.
2. 기초 배지 및 세척 솔루션을 준비
- 성장 배지로 (pH를 7.2로 조정) DMEM / F-12 배지를 사용하고, 그것을 보충10 % 새로 태어난 송아지 혈청 (NBCS), 1 % 펜 연쇄상 구균 Ampho와. 솔루션 (PSA; 페니실린, 105 단위 / L, 스트렙토 마이신, 100 ㎎ / ℓ, 암포 테리 신 B, 0.25 ㎎ / ℓ).
- 저장을위한 10 배 농도의 인산 완충 식염수 (PBS) 용액을 제조; 씻어 (pH를 7.2로 조정;의 KCl, 2.667 밀리미터, KH 2 PO 4, 1.471 밀리미터; 나 2 HPO 4 -7H- 피 2 O, 8.06 mM의 NaCl을, 137.93 밀리미터 포함)과 난황 막 동안 축축하게 1X PBS 솔루션을 사용 계란 노른자와 알부민에서 내배엽을 분리.
- 내배엽 펠렛을 다시 중단 (pH를 7.2로 조정) DMEM 배지를 사용합니다.
일본어 메추라기 YSMs에서 차 EECS 3. 컬렉션
- 오일 (단계 1.3)에 대한 수집 한 알을 품어. 정상 배아 발달을 확인 달걀 캔 들러에 의해 계란을 검사합니다.
참고 : 배아 일 5 일 YSM의 중배엽의 경계는 매우 명확하고 3 배아 층은 덜 함께 밀접하게 연결되어있다, 그래서 OB하기 쉬운주석 박의 내배엽. 만 YSM 컬렉션 정상적인 모세 혈관 순환 개발을 보여주는 계란을 사용합니다. - 주의 깊게 신선한 물과 75 % 에탄올을 사용하여 껍질을 청소합니다. 부드럽게, 가위로 공기 셀 위치에서 달걀 껍질을 열고 밖으로 껍질, 37 ° C 1X PBS로 가득 10cm 배양 접시에 집게와 장소에 의해 전체 YSM를 수집합니다.
- 가위는 배아, 난황과 난백을 분리하고 부드럽게 1X PBS로 세척 YSM 세 번 및 10cm 배양 접시에 PBS 용액 YSM 배치하여.
- YSM에서 외배엽을 제거하기 위해 집게와 가위를 사용합니다. 집게를 사용하여 2 번 단단히 내배엽 세포 층을 보유하고, 다른 하나는 모세관 중배엽을 잡아.
- 해부 현미경에서 떨어져 당겨 배아를 향한 방향으로 중배엽의 가장자리에서 내배엽를 구분합니다. 37 ° C 와트 성장 배지 15 ㎖ 중의 적기 장소를 이용하여, 50 ml 원심 분리 튜브 내에서 담황색 내배엽 모아서어 목욕 모든 조직 모음이 완료 될 때까지.
콜라게나 소화에 의해 내배엽 조각 4. 소화
- 갓 DMEM 10 ml의 유형 IV 콜라게나 6.5 단위를 녹인다.
- RT에서 3 분 동안 130 XG에 50 ㎖ 튜브 (3.4)을 원심 분리기. 매체를 기음과 피펫을 사용하여 6cm 배양 접시에 모든 내배엽을 배치합니다. 이 배양 접시에 1 ml의 콜라게나 솔루션을 추가합니다.
- 각 조각의 크기까지 곡선 가위 2 메추라기 배아에서 수집 내배엽 슬라이스 대략 2-3mm이다. , 적기를 사용하여 신선한 콜라게나 솔루션의 9 ml의와 함께 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 모든 조각을 수집합니다.
- 175 rpm에서 37 ° C 진탕 수조에서 30 분 동안 콜라게나 조직 다이제스트. 콜라겐이 부분 소화 이식편의 세포 증식을 향상시키는 데 사용된다.
- RT에서 3 분 동안 130 XG에 원심 분리기 부드럽게 피펫을 사용하여 상층 액의 일부를 제거. 20 ㎖ DMEM에 현탁하여 펠렛을 씻고 3 분 130 XG에 원심 분리 후 상층 부분을 제거합니다.
- 다시 중단 성장 매체 (10 % NBCS 1 %의 PSA와 DMEM / F12)의 12 ml의와 펠렛을, 24 웰 플레이트에 부드럽게와 동일 (각 웰에 500 ㎕의 세포 솔루션을) 시드.
- 세포 조직에서 증식 할 수 있도록 2 일 동안 공기 중에서 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 조직 이식편 부화.
- 추가 2 일 동안 세포를 인큐베이션하고 세포 생존 분석 프로토콜에 의해 세포 생존율에 대한 특성화. 15
주 : 살아있는 세포는 세포질 내에서 환원 환경을 유지한다. 레사 주린, 활성 성분은 푸른 색과 거의 비 형광 비 독성 세포 투과성 화합물이다. 세포 배양에 첨가 될 때, 레사 주린은 미토콘드리아 효소에 의해 세포질로 레조 루핀 (resorufin)로 감소된다. 레조 루핀 (resorufin)는 붉은 색과 높은 형광입니다. 실행 가능한 세포가 지속적으로 레사 주린은 레조 루핀 (resorufin)로 변환, incre주변 세포 배양 배지의 전체 형광 색 asing. - 한 바와 같이 전사 및 PCR 마커 유전자의 mRNA 발현의 정량적 실시간 역 내배엽 상피 세포의 총 RNA 분리를 수행한다. (16, 17)을
- SOAT1 mRNA를 검출하는 역전사 효소를 사용하여 PCR (센스 : 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '안티센스 : 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; PCR 생성물을 BP = 168) EEC 세포 특이 마커로. 하우스 키핑 유전자 및 내부 통제로 β-굴지의 mRNA (PCR 제품 = 151 bp의 : '; 5' GTGATGGACTCTGGTGATGG-3 안티센스'5'- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 감각)를 사용합니다.
- RT-qPCR에 제품의 크기를 검출하는 겔 전기 영동을 사용한다. 1 % 아가 로스 젤을 준비, 2 μL 로딩 염료 10 μl의 qPCR에 제품을 혼합한다. 로드 10 μL 웰을 1 % 아가 로스 겔에서 각 혼합물에, 30 분 동안 100V로 겔을 실행.
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Representative Results
일관성 있고 유용한 셀 모델을 설정하는 목표를 달성하기 위해, 우리는 확장 증식 속도 및 조류 EECS의 성능을 안정화 할 필요가있다. 우리는 부분적 콜라겐 또는 콜라겐 플러스 디스 파제 0.6 U와 같은 단백질 분해 효소로 분해 내배엽 아니 효소 소화와 내배엽의 직접 배양을 비교 하였다. 디스 파제는 비극성 아미노산 잔기의 N 말단 펩티드 결합을 가수 분해 아미노 - 엔도 펩 티다 제이다. 단백질 분해 효소 소화 처리없이 소화 (그림 1)에 비해 세포 증식을 증가하는 반면, 세포 성장은 오일 배양 (그림 2) 이후 두 효소 처리와 현저하게 차이가 없었다. 그러나, 콜라게나 제 처리는 더 성장 곡선 귀착 EECS가 6~9일 (도 2)에 대해 안정적으로 증식 것으로 나타났다. 따라서, 부분 콜라게나 소화에서 EECS의 성장을 향상전 생체 내 외식과 충분한 및 기능 EEC를 획득하는 것이 좋습니다.
사일 배양 한 후, EECS은 배양 된 세포의 정확한 생리 학적 특성을 제안, 포르말린 고정 및 오일 레드 O 염색 (그림 3) 후 검출 된 지방 세포와 같은 모양을했다.
(IBMX]의 cAMP의 분해를 감소시키는) 우리는 환상 아데노신 모노 포스페이트 (캠프) 전사 조절 에이전트의 cAMP 포스 포 디에스 테라 제 억제제, 3- 이소 부틸 -1- 메틸 크라고 가정 및 아데 닐 레이트 시클 라제 활성화 제, 포스 콜린 (된 cAMP 합성을 증가시키는) 모두 24 시간 처리 (그림 4) 후 SOAT1 mRNA 발현을 자극. 표면 단백질 마커 O 이러한 치료는 또한 SREBP2, 콜레스테롤 합성 조절 전사 인자의 발현을 증가 및 포스 콜린은 perilipin -2- (PLIN2)의 발현을 강화F 지질 방울 (그림 5). 실시간 PCR에 의해 정량화 지방을 생성하는 유전자에 대한 EEC mRNA의 프로파일 (그림 5) 지방 세포와 유사하다.
도 1 내배엽 상피 세포 부분 콜라게나 제 소화 효과. 조직 이식편은 세포 조직에서 증식 할 수 있도록하기 위해 2 일 동안 배양 하였다. 우리는 관찰 성공적으로 성장 EECS의 수를 계산합니다. 숫자는 부분적으로 콜라게나로 분해없이 소화와 세포와 세포를 계산 하였다; 모두 24 웰 플레이트에서 배양 하였다. Y 축은 24 웰의 세포 배양 플레이트에 정상적으로 증식 EECS 잘 수있다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시 하였다. 분석 쌍 t 시험으로 측정 하였다. P <0.0001. 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
일부 효소 소화 한 후 EECS의 세포 성장 실적 2. 그림. 확산 속도는 세포 생존 분석에 의해 발견되었습니다. 분석 들어 레사 주린 약한 레사 주린 형광을 갖는 화합물은 청색 셀 들어가면 레조 루핀 (resorufin) 감소된다. 생세포 연속적 셀 주변 매체의 전체 형광 색을 증가 할 레조 루핀 (resorufin) 레사 주린 변환한다. 실행 가능한 세포는 600 nm에서 정상화와 570 nm에서 흡광도에 의해 검출되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시 하였다. 분석 페로 니 사후 테스트 (; 콜라게나 + 디스 파제 그룹 N = 11 콜라게나 그룹 N = 10)와 양방향 ANOVA에 의해 결정되었다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. 하십시오 CLI이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 (CK).
그림 3. 배양 EECS의 형태는. 사일 배양 한 후, EECS는 포르말린 고정 및 오일 레드 O 염색 후 검출 된 지방 세포와 같은 모양을했다. 에서 왼쪽에서 오른쪽으로 : EEC의를 시야에 100X 확대와 함께, 200X 배율 시야와 200X 확대에 오일 레드 O와 헤 마톡 실린 염색 후. 맨 왼쪽 그림의 왼쪽에있는 검은 반점은 부분적으로 소화 내배엽 (막)입니다. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. SOAT1 트랜스캠프 활성제로 처리 EECS의 해독에 기반한 대사 과정 중에 전사. 우리는 24 시간 동안 하루 5에서 IBMX의 농도 또는 포스 콜린의 증가에 EECS을 처리 하였다. 우리는 처리 된 세포에서의 mRNA를 추출하여 역전사 PCR에 의해 cDNA를에 RNA를 변환. 우리는 실시간 정량적 PCR에 의해 전사 수준을 분석 하였다. β 액틴는 하우스 키핑 유전자로 사용되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시 하였다. 분석은 Tukey에의 사후 테스트와 편도 ANOVA로했다 (N = 6) (* P≤ 0.05, ** P≤ 0.01). IBMX는 세포 내 cAMP를 제기 PKA를 활성화, TNF 알파 및 류코트리엔 합성 억제, 염증과 선천성 면역을 줄이고 비 선택적 아데노신 수용체 길항제 인 경쟁력 비 선택적 포스 포 디에스 테라 제 억제제이다. 포스 콜린은 일반적으로 캠프의 수준을 높이기 위해 사용되는 진핵 아데 닐 레이트 사이 클라의 유비쿼터스 활성화입니다. 이 figu의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오레.
도 5는 5 일간의 EEC로운의 mRNA의 표현은, 그럼. 24 시간 동안 처리 된 cAMP 활성제도 4의 cDNA의 정량적 실시간 PCR에 의해 유전자 발현 수준을 분석하는데 사용 하였다. β - 굴지는 하우스 키핑 유전자로 사용하고 내부 통제를 역임했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시 하였다. 분석은 컨트롤에 치료를 비교하는 Tukey에의 사후 테스트 (n≤ 6)와 편도 ANOVA로했다. SREBP2, 스테롤 조절 요소 결합 단백질 (2); LPL, 지단백 리파제; PLIN2, perilipin-2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
전 배양 시스템은 제한된 성공을 갖기 때문에, 더 배양 시스템이 필요하다. 일본 메추라기 YSM의 내배엽은 전 생체 내 외식의 더 나은 성장 성능을 달성하기 위해 세포 - 세포 접합을 완화하기 위해 콜라겐 등의 단백질 분해 효소와 치료가 필요합니다. 우리의 데이터는 부분 소화 처리에서 세포 수는 이일 (그림 1)에 대한 시딩 후 소화되지 않은 조직 문화에서보다 더 컸다 것으로 나타났다. 따라서, 부분적인 단백질 분해 소화 YSM 셀에서의 수율을 향상시키는 중요한 단계이다.
현재 문화 프로토콜의 중요한 수정 부분 단백질 분해 소화합니다. 이 처리는 크게 셀 수율 라이브 EECS를 얻는 성공률을 향상. 오버 소화가 조직에서 세포를 분리하고 세포, 판에 부착되지 않기 때문에 아래 - 소화의 적은 세포 수율 결과 반면 소화 시간이 매우 중요하다조직 이식편. 우리는 위에서 설명한 조건을 사용하여 30 ~ 40 분 소화 최적 것으로 나타났습니다.
현재의 프로토콜은 EECS를 얻기 위해 높은 기술 교육을 필요로한다. EECS 수집 시점은, 예를 들어, 우리는 배아 일 5에서 EECS를 수집 제한되는 이유는 조류 배아 성장, 난황 막에 층간 접속이 더 복잡하고 수집 성공률 저하 있다는 EECS. 프로토콜은 초기 단계 배아 EECS 아니라 후기 배아를 수득하기 위해 사용될 수있다. 그것은 후기의 EECS에 직접 조사의 가능성을 제한한다.
SOAT1 및 지단백질 리파제 및 지질 축적의 발현 YSM 4,5,11 특히 EECS의 본질적인 특성이다. 현재의 연구, SOAT1, LPL, 2 (PLN2)의 mRNA를 perilipin에서 올바른 생리에 문자를 가진 세포를 생성 할 수 있습니다 배양 시스템을 제안, EECS에 높은 표현했다eristics. 현재의 기술은 기본 EECS 대량 생산. 우리는 이전에 설명 된 절차 9를 사용하면, EEC 배양 성공률은 24 음, 현재 프로토콜 EECS 생성 반면, 거의 100 %의 성공율의 세포 배양 접시에 약 60 %였다.
난황 막 따라서 개발 단계 배아 노른자 영양분을 전송하는 기능, 단백질, 지질 및 난황에서 콜레스테롤을 흡수하는 주요 조직이다. 콜레스테롤 에스테르 형성을위한 주요 효소 인 SOAT1. 11 대규모 콜레스테롤 에스테르 4 발생시 SOAT1는 조류 배아 발달의 후기 단계에서 급격히 증가하기 때문에, 우리는 배양 EECS의 특성을 평가하기위한 마커 유전자로 SOAT1 mRNA 발현을 사용했다. 우리는이 차 EEC 문화 시스템이 생리 학적 특성을 예상 생산 된 것을 보여 주었다. 따라서, EEC 문화 시스템은 embryon을 연구하는 귀중한 도구가 될 수 있습니다IC에서 지질 교통 조류 배아 개발하는 동안 YSM 영양소 이용률을 매개에 관여하는 유전자의 역할을 명확히하고.
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Acknowledgments
현재 프로토콜의 개발을위한 자금 조달은 특히 국립 대만 대학, 대만 (부여 ID-104R350144)뿐만 아니라 대만의 과학 기술부 (부여 ID "상위 대학 계획에 대한 목표"에 의해 지원됩니다 MOST (104) -2313-B-002-039-MY3). 우리는 특히 현재의 연구를위한 동물 실 및 실험실 공간을 제공하기 위해 국립 대만 대학의 생명 공학 센터 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100 ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1 g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24-well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ml PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50 ml Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
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