Abstract
Vi har etablert en endodermal epitelial cellekulturmodell (EEC) for å studere funksjonen av visse enzymer og proteiner i mediering av næringsutnyttelse av avian embryo under utvikling. Befruktede japansk vaktel egg ble inkubert ved 37 ° C i 5 dager og deretter plommesekken membraner (YSM) ble samlet for å etablere EEC kultursystemet. Vi isolert embryonale endoderm lag fra YSM, og skiver membranen inn i 2 - 3 mm stykker og delvis fordøyd med kollagenase før seeding i 24-brønners kulturplater. Den EECS sprer ut av vevet og er klar for cellekulturstudier. Vi fant at den hadde EECS typiske kjennetegn ved YSM in vivo, for eksempel, akkumulering av lipid-dråper, ekspresjon av sterol O-acyltransferase og lipoprotein lipase. Den delvise fordøyelse behandling økt betydelig den vellykkede frekvensen av EEC kultur. Ved anvendelse av EECS, demonstrerte vi at ekspresjon av SOAT1 ble regulert av cAMP dependent protein kinase En beslektet veien. Denne primære japansk vaktel EEC kultur systemet er et nyttig verktøy for å studere embryonale lipid transport og å avklare rollen til gener som er involvert i formidling næringsutnyttelse i YSM under avian embryonal utvikling.
Introduction
Den store næringskilde av avian embryo er eggeplomme, som består av 33% lipider, 17% protein, og 1% aske. 1 Under embryoutvikling, plommesekken membran (YSM) vokser fra innenfor den embryoniske bukhulen og gradvis dekker eggeplomme flate. Begynnelsen på embryonale dag 2, genekspresjon assosiert med lipidmetabolisme og angiogenese gradvis økt i YSM, og YSM utvikler seg langsomt villus-lignende anslag. 8,9 Disse anslagene øke opptaket av plomme næringsstoffer for å støtte embryonal utvikling. Den YSM er en extraembryonic vev som inneholder tre bakterie lag, endoderm, mesoderm og ektoderm. 14 plommesekken ektoderm ansikter albumen og lenker med vitelline membran for å dekke forsiktig plommesekken. De endodermal epitelceller står overfor direkte mot eggeplomme og tjene som næringsutnyttelse portaler. 6 Som YSM utvides, endodermal epitelceller (EECS) kan deles med shape og funksjonalitet inn i to grupper, areal vitelline og området vasculosa. 7
Området vitelline består av endodermal celler og er fjernt fra fosteret; Området vasculosa består av mesodermal celler og dekker differensierte EECS med blodårer og bindevev. Ved embryonale dag 5 er plommen helt dekket av ektoderm og endoderm av YSM og vaskulær området har vokst raskt. Den YSM absorberer, lages på nytt og frigjør lipider (som eggeplomme-avledet meget lav tetthet lipoprotein) og proteiner i den embryoniske sirkulasjonssystemet. 9, 2 derfor etablert en primær japansk vaktel embryonal endodermal epitelial cellekultursystem, for å studere mekanismene for lipid utnyttelse i YSM under avian embryonal utvikling.
Lipider så som triacylglyserol, lecitin, fosfolipider og kolesterolester (CE) er de primære energikilder til avian embryo. På de tidlige stadier av utviklingen, plomme lipider er composed på bare 1,3% CE, og det stiger til 10-15% på mellomlang sikt av aviær embryoutvikling 3, 11. Kolesterol ester syntetiseres fra kolesterol av sterol O-acyltransferase 1 (SOAT1) i avian embryo YSM. 4
Lagring form av kolesterol er CE er CE gjennomført i lipoproteiner, og lipoproteiner transporteres med blodsirkulasjonen til vevet. 13 En uke før klekkes det er raske veksten av avian embryoer. Omtrent 68% av de gjenværende lipid innholdet i eggeplomme blir absorbert under dette trinn. 10 Mekanismen ved hvilken plomme lipider blir benyttet kan avklares av en EEC forskningsmodell. En kylling EEC kultur protokoll ble etablert for å oppnå denne forskningen målet. 2, 9 Men på grunn av den lave suksessrate på vev eksplantater, en forbedret EEC cellekultur prosedyre er nødvendig for å studere funksjonen av visse enzymer og proteiner i mediering av næringsutnyttelse avian embryoer under utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne prosedyren er en modifikasjon av en kylling modell kultur protokoll utviklet av Bauer et al 2013 og Nakazawa et al, 2011. 2,9..
1. Forbered Sunn Embryonic Dag 5 Embryoet fra japansk Quail
- Plasser en mann og tre kvinnelige kjønnsmoden japansk vaktel sammen i samme bur. Forsynings fôr og vann ad libitum. Juster lyset i dyrerom til 14 timer lys og 10 timer mørke.
- Samle befruktede egg i plastposer hver dag på ettermiddagen og holde dem i en 16 ° C kjøleskapet for å forsinke veksten av embryo.
- Etter å samle et tilstrekkelig antall egg i løpet av en to-ukers periode, inkuber befruktede egg i en 37 ° C inkubator med god ventilasjon i fem dager.
2. Forbered Basal Medium og Wash Solutions
- Bruk DMEM / F-12 medium (justert til pH 7,2) i vekstmediet, og supplerermed 10% nyfødt kalveserum (NBCS) og 1% Pen-Strep Ampho. Solution (PSA, Penicillin, 10 5 enheter / L, streptomycin, 100 mg / l; Amphotericin B, 0,25 mg / L).
- Forbered fosfatbufret saltvann (PBS) oppløsning ved en 10 gangers konsentrasjon for lagring; bruke 1x PBS-løsning (som inneholder NaCl, 137,93 mm, KCl, 2,667 mm, KH 2 PO 4, 1.471 mm, Na 2 HPO 4 7H 2 O, 8,06 mm, juster til pH 7,2) for å vaske og fukte plommesekken membranen mens separering av endoderm fra eggeplomme og albumin.
- Bruk DMEM-medium (innstilt til pH 7,2) for å resuspendere endoderm pellets.
3. Innsamling av primær EECS fra japanske Quail YSMs
- Inkuber de oppsamlede egg til 5 dager (trinn 1.3). Undersøk egg av et egg Candler å bekrefte normal embryoutvikling.
MERK: På embryonale dag 5, grensen for YSM mesoderm er veldig klar og de 3 embryonale lagene er mindre tett knyttet sammen, så det er lett å obholde endoderm. Bruk bare eggene som viser normal kapillær opplagsutvikling for YSM samlinger. - Rengjør eggeskallet forsiktig med friskt vann og 75% etanol. Åpne eggeskall fra luften cellen stilling ved en saks, forsiktig skrelle ut og samle hele YSM av tang og legg dem i en 10 cm kultur tallerken fylt med 37 ° C 1x PBS.
- Ved hjelp av en saks fjerne fosteret, eggeplomme og eggehvite, og forsiktig vaske YSM med 1x PBS tre ganger og plasserer YSM i PBS-løsning i en 10 cm kultur parabolen.
- Bruk pinsett og en saks for å fjerne ektoderm fra YSM. Bruk 2 tang, en til å holde fast endodermal celle laget, og den andre for å holde kapillær mesoderm.
- Under et disseksjonsmikroskop, trekke fra hverandre og separere endoderm fra kanten av mesoderm i retning mot embryo. Samle lysegul endoderm i 50 ml sentrifugerør ved hjelp av en dråpeteller og sted i 15 ml vekstmedium i en 37 ° C water bad til alle vev samlinger er fullført.
4. Fordøyelse av endoderm Slices av Collage Fordøyelse
- Ferskt oppløse 6,5 enheter av type IV kollagenase i 10 ml DMEM.
- Sentrifuger 50 ml rør (3.4) ved 130 x g i 3 minutter ved romtemperatur. Aspirer medium og plassere alle endoderm i en 6 cm kultur parabolen ved hjelp av en pipette. Tilsett 1 ml kollagenase løsning på denne kulturen parabolen.
- Skjær endoderm samlet inn fra 2 vaktel embryo med et par av buede saks til størrelsen på hver skive er ca 2 til 3 mm. Bruk en dråpeteller, samle alle skivene i et 50 ml sentrifugerør sammen med 9 ml frisk kollagenaseoppløsning.
- Fordøye vev med collagenase i 30 minutter i et 37 ° C ristende vannbad ved 175 rpm. Denne delvise spaltning med kollagenase brukes til å forbedre eksplantatet celleproliferasjon.
- Sentrifuger ved 130 x g i 3 minutter ved romtemperatur og fjern forsiktig supernatantfraksjonen ved hjelp av en pipette. Vask pelleten ved suspensjon i 20 ml DMEM og fjern supernatanten fraksjonen etter 130 x g sentrifugering i 3 min.
- Re-suspendere pelleten med 12 ml vekstmedium (DMEM / F12 med 10% NBCS og 1% PSA) og frø forsiktig og jevnt i en 24-brønns plate (hver brønn med 500 ul celleløsning).
- Inkuber vev eksplantater ved 37 ° C i 5% CO2 i luft i 2 dager for å tillate celler å formere seg ut av vevet.
- Inkuber cellene i ytterligere 2 dager og karakterisere for cellenes levedyktighet med en cellelevedyktighet analyseprotokollen. 15
MERK: Living celler opprettholde et reduserende miljø i cytosol. Resazurin, den aktive bestanddel, er et ikke-toksisk, cellepermeabel forbindelse som er blå i farge og praktisk talt ikke-fluorescerende. Da lagt til cellekulturer, er resazurin redusert til resorufin i cytosol ved mitokondrielle enzymer. Resorufin er rød i fargen og svært fluorescerende. Levedyktige celler kontinuerlig konvertere resazurin til resorufin, IncreAsing den totale fluorescens og farge av kulturmediet som omgir cellene. - Utfør endoderm epitelcelledifferensiering total RNA isolering, revers transkripsjon og kvantitativ real-time PCR av markørgenet mRNA uttrykk som beskrevet. 16,17
- Bruke revers transkriptase PCR for å påvise SOAT1 mRNA (sense: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 ', antisense: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3', PCR-produkt = 168 bp) som en spesifikk markør for EEC cellene. Bruk β-Actin mRNA (sense: 5'TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '; anti: 5'GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; PCR produkt = 151 bp) som en husholdningsgenet og intern kontroll.
- Bruke gelelektroforese for å detektere størrelsen av RT-qPCR. Forbered 1% agarosegel, og bland 10 mL qPCR produkt med 2 ul lasting fargestoff. Belastning 10 ul blanding i hver brønn i 1% agarosegel, og drives gelen ved 100 V i 30 minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å oppnå målet om å etablere en konsistent og nyttig celle modell, må vi utvide og stabilisere spredning hastighet og ytelse av aviær EECS. Vi sammenlignet direkte inkubasjon av endoderm uten enzymbehandling med endoderm delvis fordøyd med proteolytiske enzymer, så som kollagenase eller kollagenase pluss 0,6 U av dispase. Dispase er en amino-endopeptidase som hydrolyserer de N-terminale peptid-bindinger av ikke-polare aminosyrerester. Mens proteasenedbrytning behandlinger øket celleproliferasjon sammenlignet med ingen fordøyelse (figur 1), cellevekst var ikke merkbart forskjellig mellom de to enzymbehandlinger etter fem dagers inkubasjon (figur 2). Imidlertid kollagenase behandling resulterte i en bedre vekstkurve og viste at EECS profilerte jevnt i 6-9 dager (figur 2). Dermed delvis collagenase fordøyelsen bedret vekst av EECS fraex-vivo explants og anbefales å innhente tilstrekkelig og funksjonell EEC.
Etter 4 dagers inkubering, EECS hadde en adipocytt-lignende utseende detektert etter formalinfiksering og Oil Red O-farging (figur 3), noe som tyder på riktige fysiologiske egenskapene til de dyrkede celler.
Vi antok at cyklisk adenosin monofosfat (cAMP) er en transkripsjonsregulerende middel, cAMP fosfodiesterase-inhibitor, 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX, for å redusere nedbrytning av cAMP) og adenyl cyclase-aktivator, forskolin (for å øke syntesen av cAMP) begge stimulert SOAT1 mRNA-ekspresjon etter 24 timers behandling (figur 4). Disse behandlinger økte også ekspresjon av SREBP2, en kolesterolsyntese regulerende transkripsjonsfaktor, og forskolin forbedret ekspresjon av perilipin-2 (PLIN2), overflateproteinet markør of lipid dråper (figur 5). De EEC mRNA-profiler for lipogenic gener kvantifisert ved sanntids-PCR er lik adipocytter (figur 5).
Figur 1. Effekt av Delvis Kollagenase Fordøyelse på endodermal epitelceller. Tissue eksplantater ble inkubert i 2 dager for å tillate celler å formere seg ut av vevet. Vi observerte og beregnede tallene på hell vokst EECS. Tall ble beregnet for celler uten fordøyelsen og cellene delvis fordøyd med kollagenase; begge ble dyrket i 24-brønners plater. Y-aksen er vel antallet prolifererte hell EECS i cellekulturplate av 24-brønn. Data ble presentert som gjennomsnitt ± SEM. Analyse ble bestemt ved paret t-test. P <0,0001. Klikk herfor å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Cell vekst ytelse av EECS Etter Delvis Enzyme Fordøyelse. Formeringshastigheten ble påvist ved analyse av cellenes levedyktighet. Analysen inneholdt resazurin, en blå forbindelse som har svak fluorescens og resazurin er redusert til resorufin ved å skrive inn celler. Levedyktige celler konvertere kontinuerlig resazurin til resorufin, noe som øker den totale fluorescens og farge av mediet som omgir cellene. Levedyktige celler ble detektert ved absorpsjon ved 570 nm med normalisering ved 600 nm. Data ble presentert som gjennomsnitt ± SEM. Analyse ble bestemt av to-veis ANOVA med Bonferroni post-test (collage gruppe n = 10; collage + dispase gruppe n = 11). * P <0,05, ** p <0.01, *** p <0,001. Vennligst click her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Morfologi av Cultured EECS. Etter 4 dager inkubasjon EECS hadde en adipocyte-lignende utseende oppdaget etter formalinfiksering og Olje-Red O farging. Fra venstre til høyre: EEC er i sterkt felt med 100X forstørrelse, i sterkt felt med 200X forstørrelse og i 200X forstørrelse etter farging med Olje-rød O og hematoxylin. Den mørk flekk på venstre side av figuren til venstre er den delvis fordøyd endoderm (membran). Scale bar representerer 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. SOAT1 Transbeskrivelsene av EECS Behandlet med cAMP-aktivatorer. Vi behandlet EECS med økende konsentrasjoner av IBMX eller forskolin på dag 5 i 24 timer. Vi ekstrahert mRNA fra behandlede celler og omdannet RNA til cDNA ved revers transkripsjon PCR. Vi analyserte transkripsjons nivåer av sanntids kvantitativ PCR. β-aktin ble benyttet som husholdningsgenet. Data ble presentert som gjennomsnitt ± SEM. Analyser var ved enveis ANOVA med Tukey post-test (n = 6) (* P≤ 0,05, ** P≤ 0,01). IBMX er en kompetitiv ikke-selektivt fosfodiesterase-inhibitor som øker intracellulært cAMP, aktiverer PKA, hemmer TNF-alfa og leukotriensyntese, reduserer inflammasjon og medfødt immunitet og er et ikke-selektivt adenosinreseptorantagonist. Forskolin er en allestedsnærværende aktivator av eukaryote adenylylcyklase, som vanligvis brukes til å heve nivået av cAMP. Klikk her for å se en større versjon av denne Figure.
Figur 5. mRNA Uttrykk av EEC er vokst i fem dager, og deretter behandlet med cAMP-aktivatorer i 24 timer. CDNA-er i figur 4 ble brukt til å analysere genekspresjon nivåer ved sanntids-kvantitativ PCR. β-aktin ble benyttet som husholdningsgenet og tjente som indre kontroll. Data ble presentert som gjennomsnitt ± SEM. Analyser ble ved en-veis ANOVA med Tukey post-test (n≤ 6) for å sammenligne behandling med kontrollen. SREBP2, sterol regulatorisk element-bindende protein 2; LPL, lipoprotein lipase; PLIN2, perilipin-2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordi den foregående kultur systemet har kun begrenset suksess, er et bedre dyrkingssystem er nødvendig. Den japanske vaktel YSM endoderm krever behandling med proteolytiske enzymer som kollagenase å løsne celle-celle veikryss for å oppnå bedre vekst ytelse i ex-vivo explants. Våre data viser at celleantall fra en delvis spalting behandling var større enn fra ufordøyd vevskultur etter utsåing i 2 dager (figur 1). Derfor er det delvis proteolytisk fordøyelse et kritisk trinn for å forbedre celle utbytte fra YSM.
Den kritiske endring i den aktuelle kultur protokoll er et delvis proteolytisk fordøyelse. Denne behandlingen kraftig forbedret celleytelse og den vellykkede sats på å skaffe levende EECS. Fordøyelsen tid er svært viktig, fordi over-fordøyelsen vil skille celler fra vev og celler vil ikke feste til platen, mens under-fordøyelse resulterte i mindre celle yield fravev explants. Vi fant at 30 til 40 min fordøyelse ved hjelp av de betingelser som er beskrevet ovenfor er optimal.
Den nåværende protokollen krever høy teknisk opplæring for å få EECS. Tidspunktet for innsamling EECS er begrenset, for eksempel, vi bare samle EECS på embryonale dag 5. Grunnen er at så avian embryoer vokser, forbindelsene mellom lagene i plommesekken membranen er mer komplekse, og det reduserer vellykket sats på å samle EECS. Protokollen kan brukes for å oppnå EECS av tidlig stadium embryoer, men ikke sent stadium embryoer. Det begrenser muligheten for direkte forskning på slutten av scenen EECS.
Uttrykket av SOAT1 og lipoprotein lipase, og lipid akkumulering er viktige kjennetegn ved YSM 4,5,11, spesielt EECS. I denne studien, SOAT1, LPL, og perilipin 2 (PLN2) mRNA ble uttrykt høyt i EECS, noe som tyder kulturen systemet kan generere celler med riktig fysiologiske characteristics. Den nåværende teknikk produsert en stor mengde av primær EECS. Da vi brukte tidligere beskrevet prosedyre 9, suksessrate på EEC kultur var ca. 60% i cellekulturplater av 24-brønnen, mens den gjeldende protokollen generert EECS på nesten 100% suksess rate.
Plommesekken membran er den viktigste vev for å absorbere proteiner, lipider og kolesterol fra eggeplomme, og dermed fungerer for å overføre næringsstoffer fra eggeplomme til embryoer under utvikling. Den viktigste enzymet for kolesterol ester dannelse er SOAT1. 11 Fordi SOAT1 øker dramatisk i de sene stadier av aviær embryoutvikling når massive kolesterol forestringen oppstår 4, brukte vi SOAT1 mRNA uttrykk som markør genet for å vurdere hva som kjennetegner kultur EECS. Vi viste at dette primært EEC kultur system produsert forventet fysiologiske egenskaper. Derfor kan EEC kultursystemet være et verdifullt verktøy for å studere embryonic lipid transport og å avklare rollen til gener som er involvert i formidling næringsutnyttelse i YSM under avian embryonal utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Midler til utvikling av nåværende protokollen er spesielt støttet av "Aim for Top Universitetet Plan" av National Taiwan University, Taiwan (tilskudd ID-104R350144), samt departementet for vitenskap og teknologi i Taiwan (tilskudd ID: MOST 104 -2313-B-002-039-My3). Vi vil spesielt takke Senter for Bioteknologi av National Taiwan University for å gi en dyrerom og laboratorieplass for denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100 ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1 g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24-well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ml PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50 ml Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
- Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
- Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
- Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
- Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
- Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
- Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
- Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
- Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
- Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
- Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
- alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
- Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).
- Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).
