Abstract
Мы установили энтодермальную эпителиальной модель клеточной культуры (EEC) для изучения функции некоторых ферментов и белков в опосредовании использование пищевых веществ эмбрионов птиц в процессе разработки. Оплодотворенные Японские перепелиные яйца инкубировали при 37 ° С в течение 5 дней, а затем желток собирали мешка мембраны (YSM) установить ЕЭС систему культуры. Мы выделили эмбриональную энтодермы слой из YSM, и разрезали мембрану в 2 - 3 мм кусочки и частично переваривают коллагеназы перед посевом в 24-луночные культуральные планшеты. ОЦОД пролиферируют из ткани и готовы для проведения исследований на клеточных культурах. Мы обнаружили , что ОЦОД имели типичные характеристики YSM в естественных условиях, например, накопление липидных капель, экспрессия стерол O-ацилтрансферазы и липазы липопротеинов. Частичное лечение пищеварение значительно увеличило успешную ставку ЕЕС культуры. Используя EECS, мы показали, что экспрессия SOAT1 регулируется цАМФ гependent протеинкиназы связанный путь. Эта первичная японская система перепела ЕЕС культура является полезным инструментом для изучения эмбриональных липидный транспортировки и уточнить роль генов, участвующих в опосредовании использования питательных веществ в YSM во время эмбрионального развития птиц.
Introduction
Основной питательный ресурс птичьего эмбриона желток, состоящий из 33% липидов, 17% белка, и 1% золы. 1 Во время эмбрионального развития желточный мешок мембрана (YSM) растет изнутри эмбриональном брюшной полости и постепенно охватывает желток поверхность. Начиная со 2 -й день эмбрионального, экспрессия генов , связанные с липидного обмена и ангиогенеза постепенно увеличивается в YSM и YSM развивается медленно ворсинок выступы. 8,9 Эти прогнозы увеличивают всасывание питательных веществ желтка для поддержки эмбрионального развития. YSM является внезародышевый ткани , которая содержит три зародышевых листка, энтодермы, мезодермы и эктодермы. 14 желточный мешок эктодерма лица белке и связи с желточной оболочки , чтобы мягко покрыть желтка. Энтодермальные эпителиальные клетки сталкиваются непосредственно к яичным желтком и служат в качестве питательных порталов утилизации. 6 По мере расширения YSM, энтодермальную эпителиальной клетки (EECS) можно разделить на Шапе и функциональность на две группы, площадь желточными и площадь vasculosa. 7
Площадь желточная состоит из клеток эндодермы и отстоит от эмбриона; Площадь vasculosa состоит из клеток мезодермы и охватывает дифференцированные EECS с кровеносных сосудов и соединительной ткани. Эмбриональным 5-й день, желток полностью покрыта эктодермы и энтодермы из YSM и сосудистый площадь быстро растет. YSM поглощает, recomposes и освобождает липиды (как желток происхождения липопротеинов очень низкой плотности) и белков в эмбриональном кровеносную систему. 9, 2 Таким образом, мы установили первичный японский перепел эмбриональных энтодермальную эпителиальной системы культивирования клеток, чтобы изучить механизмы липида использование в YSM во время эмбрионального развития птиц.
Липиды, такие как триацилглицерина, лецитина, фосфолипидов и эфиров холестерина (СЕ) являются основными источниками энергии для эмбрионов птиц. На ранних стадиях развития, желток липиды сomposed из всего лишь 1,3% CE и повышается до 10-15% в среднесрочной перспективе птичьего эмбрионального развития 3, 11 Сложный эфир холестерина. синтезируется из холестерина стерол O-ацилтрансферазы 1 (SOAT1) в области птичьего эмбриона YSM. 4
Форма хранения холестерина CE, CE осуществляется в липопротеинов и липопротеины транспортируется циркуляционной к тканям. 13 За неделю до люка происходит быстрый рост эмбрионов птиц. Примерно 68% из оставшихся содержание липидов в желтке всасываются во время этой стадии. 10 Механизм , посредством которого желток липиды используются могут быть уточнены с помощью ЕЕС исследовательской модели. Протокол культура курица ЕЕС была создана для достижения этой цели исследования. 2, 9 Тем не менее, из - за низкой вероятностью успеха эксплантов ткани усовершенствованную процедуру ЕЕС культивирования клеток необходима для изучения функции некоторых ферментов и белков в опосредовании использование питательных веществ путем эмбрионов птиц в процессе разработки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Эта процедура представляет собой модификацию протокола культуры куриной модели , разработанной Бауэром и др 2013 и Наказава др 2011. 2,9..
1. Подготовить здоровый эмбриональном 5-й день эмбрионы из японского перепела
- 1-е место мужского и женского пола 3 половозрелых японского перепела вместе в одной клетке. Подача питания и воды вволю. Отрегулировать свет в животном помещении до 14 ч света и 10 ч темноты.
- Соберите оплодотворенную икру в пластиковых мешках каждый день во второй половине дня и держать их в 16 ° C холодильник, чтобы замедлить скорость роста эмбрионов.
- После сбора достаточного количества яиц в течение двух недель, инкубировать оплодотворенные яйца в 37 ° C инкубаторе с хорошей вентиляцией в течение пяти дней.
2. Подготовка базальной среды и промывные растворы
- С помощью DMEM / F-12 среду (рН доводили до 7,2) в качестве среды для роста, и дополнить его10% новорожденный телячьей сыворотки (NBCs) и 1% Пен-Strep Ampho. Раствор (ПСА; пенициллина, 10 5 ед / л стрептомицина, 100 мг / л, амфотерицин В, 0,25 мг / л).
- Готовят раствор фосфатно-буферный раствор (PBS), на 10-кратным концентрации для хранения; использовать 1x раствор PBS (содержащий NaCl, 137.93 мМ; KCl, 2,667 мМ, KH 2 PO 4, 1.471 мм, Na 2 HPO 4 -7Н 2 O, 8,06 мМ, доведения рН до 7,2) помыть и увлажнить желтка мембраны время отделение энтодермы от яичного желтка и альбумина.
- Используйте DMEM среду (рН доводили до 7,2), чтобы вновь приостановить энтодермы гранул.
3. Сбор первичных EECS от японского перепела YSMs
- Выдержите собранные яйца в течение 5 дней (этап 1.3). Осмотрите яйца от яйца Кандлер, чтобы подтвердить нормальное эмбриональное развитие.
Примечание: На 5-й день эмбрионального, граница YSM мезодермы очень ясно и 3 эмбриональные слои менее плотно связаны друг с другом, так что легко ОбьТайн эндодермы. Используйте только яйца, показывающие нормальное развитие капиллярного кровообращения для коллекций YSM. - Очистите скорлупу тщательно с использованием пресной воды и 75% этанола. Откройте скорлупу из положения воздушной камеры с помощью пары ножниц, мягко кожуры и собрать всю YSM пинцетом и поместить в 10 см блюдо культуры, наполненную 37 ° C 1x PBS.
- С помощью пары ножниц удаления эмбриона, желток и белок яичный, и осторожно промыть YSM с 1x PBS три раза и поместите YSM в растворе PBS в культуральной чашке 10 см.
- Используйте пинцет и ножницы, чтобы удалить эктодерму из YSM. Используйте 2 щипцов, один, чтобы прочно удерживать слой эндодермы клетки, а другой держать капиллярную мезодермы.
- Под микроскопом рассекает, растащить и отделить энтодерму от края мезодермы в направлении эмбриона. Собирают светло-желтый энтодермы в 50 мл центрифужные пробирки с помощью пипетки и место в 15 мл ростовой среды в 37 ° C Ватаэр ванны, пока все коллекции тканей не будут завершены.
4. Расщепление энтодермы Ломтики по коллагеназы
- Свежеиспеченный раствориться 6,5 единиц IV коллагеназы типа в 10 мл DMEM.
- Центрифуга 50 мл трубки (3.4) при 130 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Аспирируйте среды и поместить все энтодерму в культуральной чашке 6 см с помощью пипетки. Добавить раствор коллагеназы 1 мл к этой культуре блюдо.
- Нарезать энтодерму собранную из 2-х эмбрионов перепела с парой изогнутых ножниц до размера каждого среза составляет примерно от 2 до 3 мм. Используйте капельницы, собрать все кусочки в 50 мл центрифужные пробирки вместе с 9 мл раствора коллагеназы свежего.
- Дайджест ткани с коллагеназой в течение 30 мин в ванне 37 ° C встряхивания воды при 175 оборотах в минуту. Это частичное расщепление коллагеназой используется для улучшения пролиферации клеток эксплантов.
- Центрифуга при 130 х г в течение 3 мин при комнатной температуре и осторожно удалить фракцию супернатанта с помощью пипетки, Промывают осадок опусканием в 20 мл DMEM и удалить фракцию супернатанта после 130 XG центрифугированием в течение 3 мин.
- Повторно приостанавливать осадок с 12 мл ростовой среды (DMEM / F12 с добавлением 10% NBCS и 1% PSA) и семена мягко и равномерно в 24-луночный планшет (каждый раствор хорошо с 500 мкл клеток).
- Выдержите эксплантов ткани при температуре 37 ° С в 5% CO 2 в воздухе в течение 2 дней , чтобы позволить клеткам пролиферировать из тканей.
- Инкубируйте клетки в течение еще 2 -х дней и характеризуют для жизнеспособности клеток с помощью протокола жизнеспособности клеток для анализа. 15
Примечание: Живые клетки поддерживать восстановительную среду внутри цитоплазмы. Ресазурин, активный ингредиент, является нетоксичным, клетка проницаема соединение, которое имеет голубой цвет и практически не флуоресцентный. При добавлении в клеточных культурах, ресазурина сводится к резоруфином в цитозоль по митохондриальных ферментов. Резоруфином имеет красный цвет и сильно флуоресцирующие. Жизнеспособные клетки непрерывно преобразовывать ресазурин в резоруфином, растет в ценеasing общую флуоресценцию и цвет культуральной среды, окружающей клетки. - Выполните энтодермы эпителиальных клеток изоляции тотальной РНК, обратной транскрипции и количественной ПЦР в реальном времени экспрессии мРНК гена - маркера , как описано. 16,17
- Используйте обратную ПЦР транскриптазы для обнаружения SOAT1 мРНК (смысл: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; антисмысловой: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; ПЦР-продукта = 168 пар оснований) в качестве специфического маркера ЕЭС клеток. Используйте бета-актина мРНК (смысл: 5'- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '; антисмысловой: 5'- GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; ПЦР продукт = 151 п.н.) в качестве гена домашнего хозяйства и внутреннего контроля.
- С помощью гель-электрофореза для определения размера продукта РТ-КПЦР. Готовят 1% агарозном геле и смешайте 10 мкл КПЦР продукта с 2 мкл красителем. Нагрузка 10 мкл смеси в каждую лунку в агарозном геле в 1%, и запустить гель путем 100В в течение 30 мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для достижения цели создания последовательной и полезной модели клеток, нам нужно расширить и стабилизировать скорость пролиферации и производительность птиц EECS. Мы сравнили прямой инкубацию эндодермы, без ферментативного расщепления с эндодермы частично переваренной протеолитическими ферментами, такими как коллагеназы или коллагеназы плюс 0,6 ед диспаза. Диспазу представляет собой амино-эндопептидазы, что гидролизует N-концевые пептидные связи неполярных аминокислотных остатков. В то время как протеазы лечения пищеварения увеличилась пролиферации клеток по сравнению с отсутствием пищеварения (рис 1), рост клеток не было заметно отличается между двумя методами лечения фермента после пяти дней инкубации (Рисунок 2). Однако лечение коллагеназы приводит к лучшей кривой роста и показал , что ОЦОД пролиферируют устойчиво в течение 6-9 дней (рисунок 2). Таким образом, частичная коллагеназы улучшается рост EECS отэкс-естественных условиях эксплантов и рекомендуется, чтобы получить достаточную и функциональную ЕЕС.
После 4 дней инкубации ОЦОД был адипоцитов, как внешний вид обнаружен после фиксации формалином и окрашивания масла-красный O (рисунок 3), что указывает правильные физиологические характеристики культивируемых клеток.
Мы предположили, что циклический аденозин монофосфата (цАМФ) является транскрипцией регулирующий агент, ингибитор фосфодиэстеразы цАМФ, 3-изобутил-1-метилксантина (ИБМК, чтобы уменьшить деградацию цАМФ) и аденилатциклазу активатор, форсколин (увеличить синтез цАМФ) и стимулировали экспрессию мРНК SOAT1 после 24 ч лечения (рисунок 4). Эти процедуры также повышал экспрессию Srebp2, синтез-холестерина регуляторного фактора транскрипции, и форсколин усиливал экспрессию perilipin-2 (PLIN2), поверхностный белок-маркер Oкапельки F липидов (рисунок 5). Профили ЕЕС мРНК для липогенных генов количественно с помощью ПЦР в реальном времени похожи на адипоциты (рисунок 5).
Рисунок 1. Влияние частичного коллагеназы на энтодермальная эпителиальных клеток. Тканевые эксплантаты инкубировали в течение 2 -х дней , чтобы позволить клеткам пролиферировать из ткани. Мы наблюдали и вычислили чисел успешно выращенных EECS. Числа были рассчитаны для клеток, не имеющих переваривания и клеток частично переваривают коллагеназы; и выращивали в 24-луночных планшетах. Y-ось и число успешно пролиферирующих ОЦОД в клеточной культуре тарелкой 24-луночных. Данные были представлены в виде среднего значения ± SEM. Анализ определяли с помощью парного критерия Стьюдента. P <0,0001. Пожалуйста , нажмите здесьдля просмотра увеличенной версии этой фигуры.
Рисунок 2. роста клеток Выполнение EECS после частичного ферментативного расщепления. Скорость пролиферации определяли с помощью анализа жизнеспособности клеток. Анализ содержал ресазурин, синее соединение, которое имеет слабую флуоресценцию и резазурин сводится к резоруфином при входе в клетки. Жизнеспособные клетки непрерывно преобразовывать резазурин в резоруфином, увеличивая общую флуоресценцию и цвет окружающих сред клеток. Жизнеспособные клетки были обнаружены по оптической плотности при 570 нм с нормализацией при 600 нм. Данные были представлены в виде среднего значения ± SEM. Анализ определялись двухсторонним ANOVA с Бонферрони послетестовом (коллагеназы группы п = 10; коллагеназы + диспазу группы п = 11). * Р <0,05, ** Р <0,01, *** Р <0,001. Пожалуйста , клиск здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Морфология культивированный EECS. После 4 дней инкубации ОЦОД был адипоцитов, как внешний вид обнаружен после фиксации формалином и масло-красный O окрашивания. Слева направо: ЭЭГ в светлом поле с увеличением 100X, в светлом поле с увеличением 200X и 200X увеличении после окрашивания масляными красным O и гематоксилином. Темное пятно на левом крайнем левом рисунке является частично переваривают эндодермы (мембрана). Шкала бар представляет собой 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. SOAT1 Трансcription из EECS Обработанные с цАМФ активаторов. Мы обрабатывали EECS с увеличением концентрации IBMX или форсколина на 5 -й день в течение 24 часов. Отбирали из мРНК клеток, обработанных и превращают РНК в кДНК с помощью обратной транскрипции ПЦР. Мы проанализировали уровни транскрипции в реальном времени количественной ПЦР. β-актина, использовали в качестве гена домашнего хозяйства. Данные были представлены в виде среднего значения ± SEM. Анализы были односторонним ANOVA с послетестовом Тьюки (п = 6) (* Р ≤ 0,05, ** Р ≤ 0,01). IBMX является конкурентным неселективным ингибитором фосфодиэстеразы, который повышает внутриклеточный цАМФ, активирует PKA, ингибирует TNF-альфа и синтез лейкотриенов, снижает воспаление и врожденный иммунитет и представляет собой антагонист рецептора аденозина неселективный. Forskolin является повсеместным активатор эукариотической аденилатциклазы, обычно используется для повышения уровня цАМФ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого FIGUчисло рейнольдса
Рисунок 5. Выражения мРНК выращенного ЕЕС в течение пяти дней, затем обрабатывали цАМФ активаторов в течение 24 ч. КДНК на рисунке 4 были использованы для анализа уровней экспрессии генов в режиме реального времени количественный ПЦР. β-актина, использовали в качестве гена домашнего хозяйства и служила в качестве внутреннего контроля. Данные были представлены в виде среднего значения ± SEM. Анализы были односторонним ANOVA с послетестовом Тьюки (n≤ 6) для сравнения лечения с контролем. Srebp2, стеринов регуляторный элемент-связывающий белок 2; ЛПЛ, липопротеинлипазы; PLIN2, perilipin-2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Поскольку предыдущая система культура имеет лишь ограниченный успех, необходима лучшая система культуры. Японский перепел YSM эндодермы требует лечения протеолитических ферментов, таких как коллагеназы, чтобы ослабить межклеточных соединений для достижения более высокой производительности роста в эксплантов экс-естественных условиях. Наши данные показывают , что число клеток с частичной обработки переваривания были больше , чем от культуры непереваренной ткани после посева в течение 2 -х дней (рисунок 1). Таким образом, частичная протеолитического расщепления является важным шагом для повышения выхода клеток из YSM.
Критическое изменение в текущем протоколе культуры является частичным протеолитическим расщеплением. Это лечение значительно повысило выход клеток и успешную скорость получения живых EECS. Время переваривания имеет очень важное значение, так как чрезмерное переваривание отделит клеток из ткани и клетки, не будет присоединять к пластине, в то время как при переваривания привело к меньшему выхода клеток изткани эксплантов. Мы обнаружили, что от 30 до 40 мин переваривание с использованием условий, описанных выше, является оптимальным.
Текущий протокол требует высокой технической подготовки для получения EECS. Время точка сбора ОЦОД ограничена, например, мы собираем только ОЦОД в эмбриональный день 5. Причина заключается в том, что по мере роста эмбрионов птиц, соединения между слоями в желточного мешка мембраны являются более сложными, и уменьшает успешную ставку сбора ОЦОД. Протокол может быть использован для получения EECS ранних эмбрионов стадии, но не поздно эмбрионов стадии. Это ограничивает возможность непосредственного исследования на поздних стадиях EECS.
Выражение SOAT1 и липопротеинлипазы и накоплением липидов являются важнейшими характеристиками YSM 4,5,11, особенно ОЦОД. В текущем исследовании, SOAT1, LPL и perilipin 2 (PLN2) мРНК были выражены расположившееся в EECS, предлагая систему культуры может генерировать клетки с правильной физиологической CHARACTeristics. В настоящее время техника производила большое количество первичных EECS. Когда мы использовали предыдущую описанную методику 9, показатель успешности ЕЕС культуры составляла около 60% в культуре клеток пластин 24-а, в то время как текущий протокол генерируется EECS при частоте успеха почти 100%.
Желток НКК мембрана является основной ткани, чтобы поглотить белки, липиды и холестерин из желтка, таким образом, функционирует для передачи питательных веществ из желтка для эмбрионов в процессе разработки. Основной фермент для образования эфира холестерина является SOAT1. 11 Поскольку SOAT1 резко возрастает в поздних стадиях эмбрионального развития птиц , когда массивная этерификацию холестерина происходит 4, мы использовали выражение SOAT1 мРНК в качестве гена - маркера для оценки характеристик культивируемых EECS. Мы показали, что эта первичная система ЕЕС культуры Произведенный ожидается физиологические характеристики. Таким образом, система ЕЕС культура может быть ценным инструментом для изучения эмбрионаIC липидного транспорта и уточнить роль генов, участвующих в опосредовании использования питательных веществ в YSM во время эмбрионального развития птиц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Финансирование разработки текущего протокола, в частности, при поддержке "Цель для плана Top университет" Национального университета Тайваня, Тайвань (грант ID-104R350144), а также Министерства науки и технологий Тайваня (грант ID: НАИБОЛЕЕ 104 -2313-B-002-039-MY3). Мы особенно благодарим центр биотехнологии Национального университета Тайваня за предоставление комнаты животных и лабораторных помещений для текущего исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100 ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1 g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24-well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ml PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50 ml Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
- Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
- Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
- Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
- Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
- Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
- Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
- Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
- Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
- Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
- Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
- alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
- Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).
- Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).
