Summary
光遗传学方法被广泛地用于操纵神经活动和评估大脑功能的后果。在这里，技术概述了在光激活Channelrhodopsin 在体内表达，允许在恐惧相关的电路体外特定的远程及本地的神经连接的突触性质的分析。
Abstract
光遗传学方法现在广泛使用的通过光组合光活化的蛋白和神经活动的后续处理的靶向表达研究神经种群和电路的功能。 Channelrhodopsins（CHRS）是光门控阳离子通道，当融合于荧光蛋白的表达可用于可视化和特定细胞类型的并行激活和在脑的限定的区域其轴突突起。通过病毒载体的立体定向注射，CHR融合蛋白可被组成性或有条件地限定的脑区域的特定细胞中表达，并且它们的轴突突起随后可以通过在脑切片的体外光遗传学活化解剖和功能的研究。旨在明白无法与传统的电刺激的方法来解决的连接突触性质时，这是特别重要的，或在确定新颖AFFE租金而被理解很差先前传出的连接。这里，有几个实施例说明此技术如何可以应用于调查这些问题，在杏仁核阐明恐惧相关的电路。杏仁核是恐惧和情绪记忆获取和恐惧的表情，和存储的重点地区。证据许多线表明，内侧前额叶皮质（内侧前额叶皮质）参与恐惧采集和灭绝的不同方面，但其与杏仁核精确连通刚刚开始被理解。首先，示出如何体外光遗传学激活可以用来研究mPFC的传入和靶细胞间的突触通信的各方面在基底外侧杏仁核（BLA）。此外，它示出本体外光遗传学方法如何可以适用于评估使用一组GABA能神经元中的杏仁核改进的连接图案，所述paracapsular闰细胞簇（mpITC），作为一个例子。
Introduction
可视化和脑区和特定类型的神经元之间的特定连接的同时激活精密工具正在成为了解功能连接基本健康的大脑功能和疾病状态更重要。理想情况下，这需要与鉴定神经元沟通精确突触性生理研究。这是不能在一个单一的急性脑切片保存脑区之间的连接，尤其如此。在过去，这已经在很大程度上在单独的实验取得。一方面，神经示踪剂注入体内已采用结合随后的光或前和突触后伙伴的电子显微镜分析。另一方面，当从原点的区域中纤维束被保留，并在切片准备访问的，电刺激已经被用于评估在所述目标区域的细胞突触通信机制。
与光遗传学的出现，的光门控阳离子通道，诸如Channelrhodopsins（CHRS）融合于荧光蛋白的靶向表达，现在使神经元和它们的轴突轨迹的活化，同时允许其可视化和事后解剖分析1- 4。因为从父胞体5切断时CHR表达轴突甚至可以刺激，有可能在脑切片于：1）评估从那些不与传统的电刺激可访问的大脑区域的输入，因为纤维束是不可分离或特定的轨迹不知道; 2）明确标识产地为进行推测，但不完全了解具体投入的区域; 3）调查定义的细胞类型之间的功能连接，包括本地和长期预测。因为许多优点的，电路的脑切片这个光遗传学映射已成为广LY在过去几年中使用，以及各种用于荧光标记CHRS表达病毒载体的可容易地从商业供应商获得。比传统的电刺激光遗传学激活一些关键的优势是对组织无损伤，由于刺激电极，纤维刺激特异性的位置，因为电刺激也可以招募通道或其他附近的细胞，和同样快速，时间精确刺激纤维。此外，病毒载体的立体定向注射可以很容易地针对特定脑区6和条件或细胞类型特异性表达可以通过依赖于Cre的表达和/或特异性启动子7来实现。这里，这种技术被应用于远距离映射和局部电路中的恐惧系统。
杏仁核是恐惧和情绪记忆8,9购置和恐惧的表情，和存储的重点地区。除了来回m为杏仁核，内侧前额叶皮质（mPFC的）和海马（HC）被相互连接到杏仁核的结构，有牵连的恐惧和消光存储器10,11采集，固结和检索的各个方面。在内侧前额叶皮质的活动细分出现在控制高和低的恐惧发挥双重作用状态12,13。这可以部分由内侧前额叶皮质，以将控制杏仁核活动和产出的杏仁核的直接连接介导的。因此，在过去的几年中，一些研究离体切片实验开始调查在杏仁核14-17 mPFC的传入和特定的靶细胞间的突触相互作用。
在恐惧学习，关于空调，无条件刺激的感觉信息到达通过特定丘脑和皮层区域的预测杏仁核。这些投入可塑性在basol外侧部（LA）神经元ateral杏仁核（BLA）是恐惧条件9,18潜在的重要机制。越来越多的证据表明，在杏仁核并行塑料方法涉及抑制元件以控制恐惧存储器19。 A组集群抑制性神经元是GABA能内侧paracapsular闰细胞（mpITCs），但其确切的连通性和功能还没有完全搞清楚20-22。这里，光遗传学电路映射用于评估这些细胞的传入和传出连接以及它们在杏仁核上目标神经元的影响，这表明mpITCs接收来自丘脑和大脑皮层的中继站23直接感觉输入。在mpITCs或BLA神经元CHR的特异性表达使得局部相互作用的映射，揭示mpITCs抑制，但也相互通过，BLA主要的神经元激活，将它们放置在该有效控制BLA活性的新的前馈和反馈抑制电路23。
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Protocol
伦理学声明：所有实验程序均符合有关研究使用动物的欧盟指令和当地动物护理和使用委员会批准（Regierungspräsidium蒂宾根，巴登 - 符腾堡州，德国的状态）负责图宾根大学。
1.立体定向注射过程
- 准备使用消毒器无菌工具（剪刀，手术刀，夹具，钻头，针，缝合材料）。安排无菌工具和其他所需的解决方案和手术用品如无菌棉互换，消毒，无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4）中，和H 2 O 2上的无菌手术盖布。
- 根据制造商的说明在水平微电极拉出器拉出使用3毫米宽框灯丝注射玻璃微（ 图1A，插入图）。
注意：对于深注入，电极锥度应足够长达到最腹侧坐标（约5毫米;。为坐标，见1.10）。 - 预混物的病毒溶液1微升和0.2微升在无菌PBS中的0.1％快速绿色溶液（对于在玻璃吸管溶液更好的可视性）。填补玻璃吸管与病毒解决方案和快速的绿色使用带细尖（ 图1A，插图）微升移液管混合物。
注：重组腺相关病毒载体（腺相关病毒）工作被认为是生物安全等级1（BSL 1）工作，并需要在BSL 1实验室进行。在这项研究中（ 图1C）使用rAAVs是：1）mPFC的：重组腺相关病毒-hSyn-的ChR2（H134R）-eYFP（血清型2/9）16; 2）米高梅/ PIN：腺相关病毒CAGh-的ChR2（H134R）-mCherry（血清型2/9）23; 3）mpITC / BLA：腺相关病毒EF1A-DIOhChR2（H134R）-YFP（血清型2/1）23 - 麻醉用小动物麻醉机（异氟烷：在氧诱导3％）鼠标。
注意：在本研究中使用的小鼠为4 -7周龄下列菌株和基因型和：C57BL6 / J野生型（实验在图2A和图3A-D）; GAD67-GFP 24（在图2B和3E-H实验）; TAC2-Cre的25（在图2C和3I-J实验）。 - 耳朵和眼睛之间剃光头。应用的消毒剂（基于providone碘）用棉签剃光头。
- 应用眼药膏，以防止在麻醉过程中眼睛干燥。皮下注入小鼠具有止痛（基于美洛昔康-，0.1毫升5毫克/毫升溶液）。
- 放置在立体定位框架（ 图1A）小鼠和经由气体麻醉面罩维持麻醉（异氟烷：2％的氧气用于维护）。检查麻醉深度使用肢体撤回反射，然后再继续。
注：保持整个外科手术过程中在无菌条件以及可能的;戴一次性口罩，手术去WN和手套。 - 就用剪刀头顶皮肤切口。轻轻拉动皮肤使用钝钳一边，用夹子固定修复，露出颅骨表面，清洁头骨与H 2 O 2。
- 用细尖记号笔和钻孔的两个半球（ 图1B）上骷髅标记注射部位。坐标在这项研究中的注射是（距离前囟（毫米））：mPFC的：前1.9，横向±0.3腹面2.1;米高梅/ PIN：3.0后，横向±1.8，腹3.8; mpITC / BLA：1.45后，横向±3.35和4.75腹。
- 装入填充玻璃吸管上连接到压力注射装置立体定位框架，并把吸移管到前囟的位置。
- 断绝用细直尖镊子玻璃吸管的尖端。轻轻地这样做是为了防止气溶胶的产生的病毒解决方案。确保枪头是开放通过应用一些压力脉冲，并观察维鲁滴挤出的解决。
- 转至所需的注射坐标和使用注射压力注射设备上进行以下设置移液器的内容（约0.5微升）的一半：压力：20磅，平均脉冲宽度：30毫秒，脉冲的平均数：50。
- 离开吸管到位慢（1mm /分钟）之前缩回它〜1分钟。
注意：请不堵塞吸管肯定重复步骤与其他同一半球前吸管。在封锁尖端情况下，清洁或再次折断尖端和零吸管位置前囟门。 - 用PBS（pH值7.4）清洁头盖骨，取出夹子，轻轻地拉在一起的皮肤，缝合个别按钮缝合切口（3 - 4节）。伤口周围施加消毒剂（基于providone碘）。
- 停止麻醉，不要将鼠标无人看管，直到它完全清醒。保持单一一栋或返回到其他动物的公司，只有当完全恢复。术后继续监测健康状况，并adminis之三镇痛药，如果必要的。根据当地的动物护理和使用委员会提出的规则遵循的程序。
2.急性片的制备
- 准备学联，切削液，工具（剪刀，手术刀，镊子，压舌板，巴斯德吸管），和琼脂块。
注：1升人工脑脊髓液（ACSF）的每个实验是必需的，并且是由双蒸H 2 O作为以前发表16,23溶解化学品制备。切削溶液通过补充200毫升ACSF与0.87毫升2M的硫酸镁原液制备。 - 含氧ACSF和整个用95％ 的 O 2和5％的CO 2在实验切削溶液。
- 使用异氟醚使用小动物麻醉机（氧气3％）深深地麻醉鼠标。检查麻醉深度使用肢体撤回反射，然后再继续。
- 使用大剪刀杀头鼠标，立即冷却头在冰冷的切割溶液。
- 从尾部到延髓和一个中线切口开放性颅骨轻轻推头骨碎片向两侧使用镊子。迅速被轻轻提起它使用一个小的圆形锅铲颅骨取出大脑。切断与小脑手术刀。将脑在冰冷的裁剪解决方案。
- 对于mPFC的注射部位：切断脑部使用解剖刀（含有mPFC的）的前部，并把在冰冷的切割溶液直到切片。
- 除去用滤纸过量切削溶液和脑的后部粘合到vibratome阶段。
- 为倾斜杏仁片，胶上的琼脂块（4％）切大脑在一个35°角（ 图1D，中间）。对于冠状杏仁核切片，MGM / PIN注射部位和注射内侧前额叶皮质部位，直接粘上大脑在舞台上（ 图1D，左和右）。位，仅次于脑额外琼脂块的稳定性，同时切片。
- 的Plac在切割室与使用冷却单元保持在4℃下冰冷含氧切削溶液E的阶段。准备使用蓝宝石刀片杏仁核（320微米）的急性切片。放置切片与在RT含氧ACSF提供的界面室。
- 制备急性扁桃体切片后，放置在接口室在水浴在36℃以回收切片35 - 45分钟。接着，返回界面室至室温。从这些片记录，请继续执行步骤3.2。
- 开始的步骤2.10的过程中，切注射部位切片作为急性扁桃腺切片（步骤2.8 - 2.9）前所述。在水浴片恢复这里不需要。可选：要快速估算注射部位的位置，在装有荧光灯和适当的过滤器集的体视镜观察切片。
- 由两个滤纸和submer夹着他们修复包含事后分析注射部位切片吉宁他们在PBS液O / N 4％多聚甲醛（PFA）。对于注射部位的分析继续执行步骤4.1。
突触前纤维3.可视化和刺激
- 准备纤维和细胞的光遗传学激活补丁显微镜：
- 居中安装的发光二极管（LED）到光传送通路。
- 测量在后焦面并且在每个目标的输出与功率计选择的470纳米的合适的波长的LED的光强度。
- 计算毫瓦/毫米2的光强度，并创建一个校准曲线（LED强度（％）与光输出（毫瓦/毫米2）），用于为470纳米的波长测量值的每一个目标。
- 检索来自于安装到配备有荧光灯的直立式显微镜的堰板腔的界面室和地点的急性扁桃体切片。小心定位片使得SLIC在界面室朝上E面也面临着向上的录音室。以1:1的速率灌注以新鲜的含氧ASCF切片 - 2毫升/分钟在〜31℃的温度。
- 观察使用与适当的过滤器集表示的特定荧光蛋白组合荧光灯在切片突触前纤维。使用5倍物镜获取的概要（ 图1E），和60倍的目标为在目标区域内的纤维密度的评估。
注：对于GFP和YFP，使用过滤设置“绿色”（激励二十○分之四百七十二，分束器495，发射490 LP）为mCherry使用过滤器设置“红”（激励四十零分之五百六十，分束器585，发射七十分之六百三十零）作为指定在材料/设备表。 - 打开或根据需要在实验（ 图2D）限制显微镜的光路的孔径。
- 要获取修补程序记录，填补内部解决方案补丁吸管和我装N极持有人。申请正压补丁吸管，慢慢先入沐浴液，然后放低视觉控制到使用显微切片。
- 接近的从侧面和顶部的膜片吸管感兴趣的神经元。释放正压力时，吸移管是细胞（在细胞表面上的凹坑中可见）的表面上，将获得一个“千兆欧密封”通过施加负压。
- 应用进一步吸破裂膜补片，以获得全细胞记录。接着，使用适当的波长为激活CHR（470纳米），同时记录从细胞电响应刺激与连接的发光二极管标记的纤维。
- 突触刺激开始以低LED强度和增加，直到达到所需的突触电流幅度。触发器由在数据采集软件配置的数字输出控制的定时和脉冲长度（在图示例中的LED3）。
可以使用的其他软件和/或TTL-产生装置到触发LED：音符。
- 在根据需要对下一个记录的细胞和/或在特定的药物存在下的显微镜光路打开或限流孔（步骤3.4）重复刺激。
- 录制完毕后，由两个滤纸夹着他们在4％PFA O / N淹没他们的修为事后分析切片。
- 分析电生理数据。
注意：使用适当的软件可视化记录的扫频数据为每个单独的刺激下线。当分析的特效药物，使用峰值检测程序，以获取有关突触电流幅值为所有个人的扫描药物作用时间过程。确定何时药效达到稳定状态。要为数字代表准备响应平均，使用的软件为每个实验条件下平均≥10单独扫描（参见图3B-D，FH，J右图）。
注意：几个备选软件包可用于数据分析。
注射部位4.事后分析
- 洗注射部位（从步骤2.12），并在PBS中的记录位点（如果重新映像是理想的，从步骤3.7）三次的切片。这是通过用新鲜的PBS在旋转摇动器反复更换溶液三次10分钟完成。
- 准备在PBS 2％琼脂溶液中，并让它冷却到〜65℃。切片放置在小直径30毫米的培养皿底部平坦，嵌入琼脂片，让它冷却下来，直到固体。
- 胶嵌入式片或切片的琼脂块到vibratome阶段，并放置在舞台破碎腔用PBS。
- 切除嵌入片70微米厚。可选：切除后，切片可染色， 即 ，具有Neurotrace揭示细胞结构（ 图3A中的C），和/或b为YFP或mCherryŸ免疫荧光染色，以提高从CHR融合蛋白的信号。
- 在幻灯片和盖玻片与安装介质安装片。图像注射部位，如果需要，包含使用荧光显微镜或共焦激光扫描显微镜（ 图2A-C）中的投射区的纤维也图像切片。
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Representative Results
这部分显示了体外光遗传学方法，并从不同的实验策略代表结果的工作流程进行调查感觉和调节的长期预测到BLA和mpITC神经元以及mpITC和BLA之间的本地连接属性的生理特性。
在所需的坐标到小鼠脑所选病毒载体的立体定向注射后（ 图1A-C中 ，病毒表达时间：2 - 6周，这取决于实验），在杏仁核注射部位和投射区的急性脑切片制备在用于膜片钳实验，并从注入大脑区域的注射位点（ 图1D）的事后分析的适当的角度。开始录音和光遗传学刺激下，荧光标记的细胞或轴突亲前在目标区域（扁桃体）jections应该对膜片钳记录的直立显微镜通过使用附荧光灯（ 图1E）进行检查。在获得一个膜片钳从切片的投影区域推定的靶细胞记录，而时间点，间隔，和脉冲长度是通过触发发光二极管（LED）的补丁软件控制光刺激被启动。取决于实验策略（ 图2A-C，右）中的荧光光路中的孔要么完全打开或限制（ 图2D）。同时保持脉冲宽度恒定，并尽可能地短（最好≤1毫秒），LED输出强度缓慢增加，以评估其强度是必需的，以实现特定的实验中（ 图2E）的突触响应的所需的幅度。记录后，扁桃体切片后固定。在后方交会和可选染色，注射和记录点的成像在激光共聚焦显微镜检查注射位置并排除错位注射的数据。注射部位的图像和在杏仁核相关联的轴突突起的三个实验策略（mPFC的输入BLA，丘脑输入mpITCs和本地mpITC活化）示于图 2A-C。
图3示出了说明的光诱发反应对所使用的不同的实验策略的属性（ 图3A，E，I）从BLA主要的神经元得到的代表记录的结果，本地BLA的interneurons和mpITC神经元。要定位记录GABA能神经元（本地的interneurons和mpITCs），GAD67-GFP记者小鼠用于24。为mPFC的和感官丘脑突起，突触传递的若干方面进行研究。交流的时间精度释放等，并在此研究中使用的CHRS的动力学特性能够与在50毫秒间刺激间隔成对脉冲可靠刺激。这允许突触后电流（的PSCs），它可以是取决于突起和靶细胞类型便利或压抑，并作为突触前释放概率的指标（ 图3B，F，H）的双脉冲的比率（PPR）的分析。此外，突触延迟的分析，可以为不同的突触后反应元件的清扫。
在本实施例中，抑制PSC（IPSC）与兴奋PSC（EPSC）成分的较长潜伏期指示disynaptic和突触输入，分别为（ 图3C）。在其他实例中，可能需要的附加EPSC性能如反应抖动或响应尺寸的变化系数进行更彻底的分析，以利用其单 - 或disyna结论普天自然17,23。此外，应用的药理学阻断剂的特定受体可以识别的PSCs的性质（ 即 ，谷氨酸EPSC和GABA能IPSC， 图3C-D）。正如所料，mPFC的输入的早期成分为谷氨酸，而后期成分是GABA能。无论EPSC和IPSC与谷氨酸受体阻断剂CNQX的完整模块进一步支持了IPSC是disynaptic。为了研究在optogenetically激活纤维突触传递的调制，激动剂和拮抗剂代谢型受体的振幅和PPR的影响（这里GABA B受体）进行评估，以评估前和突触后网站的影响。在这个例子中，振幅的与增加的PPR伴随减少指示光活化纤维（3G，H）的突触前调制。最后，在杏仁核细胞的局部相互作用可以评估，例如，当表达下TAC2子25的控制CRE小鼠注射双两侧装接loxP CHR表达的病毒载体（ 图1C）。因为TAC2因此，CHR在mpITC和中央杏仁核（ 图2C）表示，光活化通过关闭荧光灯光路孔（ 图2D）限制在mpITC。在这些条件下，光诱发动作电位可以在感染mpITCs被引出。在BLA短潜伏期抑制性突触反应表明mpITC和BLA主要神经元之间的功能抑制连接的存在。
图1.立体定向注射，急性脑片的制备和突触前纤维的可视化。（A，B）立体定向病毒注射液。 A）放置在一个立体框架头骨麻醉鼠标的图片曝光和注射针。插图：放大充满了快速绿色混合病毒液注射针的图片。比例尺：3毫米。鼠标头骨（B）示意图与不同的注射区的钻孔标记的位置。 （C）的方案表示在该研究中使用不同的病毒构建体。深灰色：启动子序列;蓝色：Channelrhodopsin2（的ChR2（H134R））;绿/红：荧光蛋白。表达时间为2周，当地的杏仁核投影和4 - 6周从内侧前额叶皮质和米高梅/ PIN预测。急性脑切片的（D）的制备：流程展示在限幅器级用于从不同的注入和投射区获得切片小鼠大脑的放置。 （ 五 ）从GAD67-GFP鼠标米高梅/ PIN的ChR2-mCherry病毒注射急性脑切片纤维的可视化。照片是与不同的过滤器设置直立贴片显微镜：GAD67-GFP表达，中间;标有三菱商事米高梅/ PIN纤维亨利吧。比例尺：200μm左右。内侧前额叶皮质，内侧前额叶皮质; mpITC，内侧paracapsular闰细胞; BLA，基底杏仁核;米高梅，内侧膝状体，内侧部分; PIN，后板内核丘脑核; LA，外侧杏仁核; BA，基底杏仁核;杏仁，杏仁中央核。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 注射部位，投影区域，和轴突突起的光遗传学刺激。（AC）在BLA代表注射部位和投射区的共聚焦图像，并在实验策略的方案。 （A）左图：内侧前额叶皮质注射部位在C57BL / 6小鼠Neurotrace染色。比例尺：500微米。中间：对应于BLA突起在倾斜扁桃体切片。比例尺：200μm左右。右图：内侧前额叶皮质的预测，并在BLA神经元的记录整场照明示意图。 （B）左：MGM / PIN注射部位在GAD67-GFP鼠标。比例尺：500微米。中东：在冠状杏仁片mpITC和LA相应的预测。比例尺：200μm左右。右：一个mpITC神经米高梅/ PIN预测和记录整场照明示意图。 （C）左图：在TAC2 Cre重组酶鼠标Neurotrace杏仁核染色切片的ChR2 - YFP的局部表现。比例尺：200μm左右。插图：放大表达的ChR2 - YFP mpITCs的。比例尺：20微米。右：一个BLA神经元的mpITC集群和记录限制照明示意图。在急性脑片在GAD67-GFP小鼠神经元的光传输和图像（mpITC簇）开放和限制预习录音室（D）图片TURE。比例尺：30微米。 （E）由不同的LED强度（上）和光功率的积诱发的兴奋性突触后电流（EPSCS）与从代表mpITC神经元在从MGM / PIN纤维光遗传学活化诱发EPSC振幅（底部）。比例尺：100 PA / 10毫秒。
注： 图2A是从参考＃16和图2C修改为从参考＃23 ，请点击此处查看该图的放大版本。
实验的战略图3.长距离和地方预测的光遗传学活化典型的结果。（A）方案（BD）。 （B）从BLA主要神经元记录代表EPSCS和在从内侧前额叶皮质纤维的光遗传学双脉冲刺激（50毫秒间刺激间隔）BLA中间神经元引发配对脉冲便利化和配对脉冲抑郁症，分别。比例尺：100 PA / 25毫秒。 （C）从内侧前额叶皮质纤维光遗传学活化引起前馈抑制。左：代表EPSC（在-70毫伏）和抑制性突触后电流（IPSC，在0毫伏）在BLA主要神经元。的IPSC具有比EPSC更长突触延迟。比例尺：200 PA / 10毫秒和200 PA / 2毫秒。右：光诱发双相EPSC / IPSC序列（在-50毫伏）由AMPA /红藻氨酸盐受体拮抗剂CNQX（10微米）受阻，进一步支持了IPSC的disynaptic性质。比例尺：50 PA / 5毫秒。 EPSC / IPSC序列的后续块（-50毫伏）（ 四 ）影响的Cl -的通道阻断剂印防己毒素（PTX，100μM）和PTX + CNQX。该IPSC由PTX和CNQX其余EPSC受阻。标尺：50 PA / 5毫秒。 （E）实验策略的方案（FH）。 F）从mpITC并在米高梅/ PIN纤维的光遗传学双脉冲刺激一个BLA主要神经元记录代表EPSCS。比例尺：50 PA / 20毫秒。 （G），在另一mpITC神经EPSCS由钠通道阻滞剂河豚毒素（TTX，0.5μM）阻断，表明它们是依赖钠通道的活性。比例尺：50 PA / 20毫秒。 （H）丘脑投入mpITC神经元突触前GABA B受体调节。控制条件下EPSCS的GABA 乙激动剂巴氯芬（2μM）的应用过程中减少EPSC幅度和伴随增加配对脉冲比，和振幅的恢复的，对GABA 乙拮抗剂CGP55845的联合应用初始配对脉冲比（10μM）。这些变化是指示由GABA B受体突触前调制。比例尺：50 PA / 20毫秒。实验策略（ 一 ）方案（J）。 （J）光诱发从的ChR2 - YFP记录动作电位表达mpITC神经元。在不同的保持电位从BLA主要记录神经元光诱发IPSC的（-90，-70，-50，-20和0毫伏）左右反向计算的氯离子平衡电位- 。比例尺：20毫伏/ 100毫秒和10 PA / 10毫秒。注：图3B-D从参考＃16修改，如图3H和J从参考＃23 ，请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
本协议描述了体外 ，可以很容易地在大多数，如果不是全部实行神经回路和本地连接的光遗传学研究的方法，通过用〜470纳米的表面荧光光端口LED装备他们直立片膜片钳记录设置。在切片轴突突起的光遗传学刺激的主要优点是，它允许为特定的激活和不与传统的电刺激可访问连接的性质的调查，因为相应的纤维束没有公知的，没有明确的定义，或在不保留一个单一的脑片。作为相关的恐惧电路的键例如，它是示出了这是如何可以适用于解剖的mPFC的输入属性的杏仁核。
即使在电纤维束的刺激已经过去的研究中被广泛使用的情况下，这些大片经常开展从源头不同地区的纤维。例如，害怕学习相关电路，从不同的感官丘脑核或皮层区域的预测贯穿内部和外部的胶囊分别混合。光遗传学刺激的优点是，它使从一个已定义区域的纤维的一个子集的选择性激活。这说明从PIN和米高梅闰细胞，外侧杏仁核主细胞特定丘脑的输入。此外，电刺激， 即在刺激电极可在目标区域使本地连接的附近通道或细胞的其它纤维的活化所引起的问题可以被克服。然而，虽然光遗传学刺激是电刺激同样迅速，可以存在关于能够可靠地施加刺激频率的限制。这取决于灭活和deinactivation动力学和正在使用CHR的变型中，4以及expressio施氮水平和方法，光刺激方法26。
当使用安装在荧光端口光刺激的LED，典型的视图的给定目标的整个领域被照亮，从而在现场的所有纤维或细胞的活化和一定深度内。这只能部分被限制在一个较小的区域或一组标记的细胞（在本例中，mpITC），使用在荧光光路23,27的孔。随着LED的光功率是不是一个问题，因为高功率蓝光LED现在可以从许多制造商。然而，发射光谱具有几十纳米的全宽度半最大值。因此，当任一用于连接和/或单色刺激亚细胞映射空间上精确的刺激期望的LED构成限制。既可以通过使用蓝色激光作为光源，典型地结合更复杂的设置，使焦油加以改进歌厅和/或在小区域的光束的扫描，并限定组织深度（ 例如 ，见28）。
与这里所描述的体外光遗传学方法，突触传递的几个属性可以研究。为了评估早期突触响应分量，延迟的彻底分析和他们的抖动monosynapticity，以及响应振幅方差应该记录的神经元（ 例如 ，见16,17,23）的有代表性的样品中使用。在的情况下的网络活动的激活可以发挥作用，选择的方法是通过施加河豚毒素阻断动作电位与K +通道阻断剂的4-氨基吡啶组合的组合来直接突触成分分离（4- AP），以防止复极14,28,29。中介投入一元和disynaptic组件受体可以采用药理阻滞剂来识别。 Furthermor即，有可能研究optogenetically激活输入突触前调制的各方面中的杏仁核23,30。一个潜在的警告是的ChR2具有一定的钙渗透性1,4和其在突触前纤维和终端激活已建议改变通过各种机制26,31释放概率。尽管如此，一些研究显示，包括这里成功采用的ChR2表达来识别输入和靶向双脉冲比率杏仁核和其他脑区16,23,26,32细胞特异性差异的例子，并激活释放的概率进一步证实调制在突触前末梢特定信号传导途径不是由CHR活化23,30排除。进一步支持来自海马和小脑的数据，显示出与相应的CHR表达方法和光刺激技术，生理方面，包括释放和保真邻功效˚F突触传递，可以可靠地研究26。最后，光遗传学纤维激活也被成功地用于应用刺激方案诱导突触可塑性31,33,34。
几个方面是此方法的成功是至关重要的。一个是病毒载体的立体定位的精度。因此，它是非常有用的获取记录之前快速评估注射部位的位置，然后进行更详细的事后分析。除了空间精度，神经元的在注射部位的可行性是一个成功的实验的主要决定因素，并取决于注射技术。所呈现的选项，则使用长和薄的锥形玻璃电极，用于这个目的以及两个浅和更深入的脑区，但可能有缺点，即所述锥形是非常灵活的。另一种方法是使用神经科学（神经-S为立体交付特别是发达国家微升注射器yringes）与更严格的针头，可以免除小卷。定位CHR-表达式定义的细胞类型和区域的特异性可以如图所示为杏仁核闰细胞被进一步使用条件式7改进，例如用Cre的系统。这也使得在依赖于Cre的病毒载体中使用强启动子的。
另一个重要的方面是病毒载体的选择。为了表达CHR，重组腺相关病毒（rAAVs）用于其中有是一个生物安全水平相对于其他流行病毒系统1载体的优势。 rAAVs已经使用了一段时间，并且通常具有良好的神经向性和很少或没有免疫原性的潜在安全可靠的载体，但它们的包装体积是有限的（约4-5 KB）35。在这些特定的实验中，血清型2/9和2/1分别用于无所不在和条件表达式。根据文献，该本身血清型转导的靶区域的细胞，但似乎不被采取由轴突逆行标签的细胞，与血清型2/5和2/6 36,37。然而，最初的实验中应排除有领域CHR标记细胞体投射到注射部位，学习相互连接的大脑区域，例如mPFC的和杏仁核时，这是特别重要的。最近的几项研究相比，大鼠和小鼠36,38,39不同脑区腺相关病毒血清型的功效。一个新兴的主题是新 的血清型（ 例如 ，2/1，2/8和2/9）一般比原来2/2血清型更为有效。还注意到，CHR的重组腺相关病毒介导的表达，相对于其他方法，没有引起对表达细胞或标记的轴突40的不利影响。所需的表达时间，以达到有效纤维活化体外似乎取决于所研究的突起的距离。在这里，并与精简版保持一致叉涂抹，对于在小鼠标记和长程连接的活化（mPFC的和感觉输入），4的表达时间 - 是必要的，而对于在杏仁核研究本地连通性，2的较短的表达倍8周 - 3周是充分14-17,23,30,34。
为在目标区域optogenetically-引起的反应的记录，有两个因素是至关重要的：1）的急性脑切片需要是质量好，2）需要保留可行标记纤维的显着量。切片的质量可以通过使用蓝宝石刀片切片得到改善。轴突保存，因此，尺寸稳定的光响应可以通过如示出了用于mPFC的-杏仁核突起（ 图1D和图2A）16,34以一定的角度切割切片得到改善。然而，这在很大程度上取决于在目标区域传入的取向，将有对投影区域和Ta的每种组合被确定rget区域。在这方面，在目标区域的预测，事后分析可以是有用的。以增强纤维的检测和可能切片刺激过程中时有发生，免疫染色对上可以采用CHR融合蛋白的荧光标签规避漂白。
总体而言，最近不仅被应用于光遗传学电路映射的这种方法害怕的电路，但许多其他系统的大脑。在未来，通过组合的转基因小鼠品系和有条件的病毒载体的增阵列亚核和特定细胞类型的靶向将提供特定的本地和远程电路的功能性突触性质的多样性的一个更为详细的了解。此外，在调查的连接功能的荧光标记CHR的事后免疫标记可以与超微结构分析相结合（ 即使用电子显微镜方法）来提供深入了解精确的铁道部先前激活的突触phological属性。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
| Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
| Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-20938M | |
| rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1) | Penn Vector Core, USA | AV-1-20298P | |
| fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
| Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
| Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectant |
| Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointment |
| Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| Recordings, light stimulation, and analysis | |||
| artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | for composition see references #16 and #23 | ||
| internal patch solutions | for composition see references #16 and #23 | ||
| MagnesiumSulfate Heptahydrate | Roth, Germany | P027.1 | prepare 2M stock solution in purified water |
| Slicer, Microm HM650V | Fisher Scientific, Germany | 920120 | |
| Cooling unit for tissue slicer, CU65 | Fisher Scientific, Germany | 770180 | |
| Sapphire blade | Delaware Diamond Knives | custom order, inquire with company | |
| Stereoscope, SZX2-RFA16 | Olympus, Japan | ||
| Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, Canada | 2012-12699 | |
| Patch microscope, BX51WI | Olympus, Japan | ||
| Multiclamp 700B patch amplifier | Molecular Devices, USA | ||
| Digitdata 1440A | Molecular Devices, USA | ||
| PClamp software, Version 10 | Molecular Devices, USA | used to control data acquisition and stimulation | |
| Bath temperature controler, TC05 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 500 0145 | |
| Three axis micromanipulator Mini 25 | Luigs & Neumann, Germany | 210-100 000 0010 | |
| Micromanipulator controller SM7 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 900 7311 | |
| glass capillaries for patch pipettes | World Precision Instruments, Germany | GB150F-8P | |
| Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber | Satorius Stedim Biotech, Germany | 13006--50----ACN | |
| LED unit, CoolLED pE | CoolLED, UK | 244-1400 | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, UK | pE-ADAPTOR-50E | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| LED unit, USL 70/470 | Rapp Optoelectronic | L70-000 | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| Dual port adapter | Rapp Optoelectronic | inquire with company | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| Filter set red (excitation) | AHF, Germany | F49-560 | Filters can be bought as set F46-008 |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F48-585 | Filters can be bought as set F46-008 |
| (emission) | AHF, Germany | F47-630 | Filters can be bought as set F46-008 |
| Filter set green (excitation) | AHF, Germany | F39-472 | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F43-495W | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| (emission) | AHF, Germany | F76-490 | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| LaserCheck, handheld power meter | Coherent, USA | 1098293 | |
| IgorPro Software, Version 6 | Wavemetrics, USA | for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used | |
| Neuromatic suite of macros for IgorPro | http://www.neuromatic.thinkrandom.com | for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used | |
| Post hoc analysis of injections and projections | |||
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Roth, Germany | 0335.2 | |
| Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain | Invitrogen | N-21479 | |
| agar-agar for embedding and resectioning | Roth, Germany | 5210.3 | |
| 30 x 10 mm petri dishes for embedding | SPL Life Sciences | alternatives can be used | |
| Slides, Super Frost | R. Langenbrinck, Germany | 61303802 | alternatives can be used |
| cover slips | R. Langenbrinck, Germany | 3000302 | alternatives can be used |
| Vecta Shield mounting medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | alternative mounting media can be used |
| cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation | Satorius Stedim Biotech, Germany | 11406--25------N | |
| Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 | Zeiss, Germany | ||
References
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).
- Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).
- Myers, K. M., Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150 (2007).
- Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72 (2008).
- Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).
- Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538 (2011).
- Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80 (6), 1491-1507 (2013).
- Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34 (47), 15601-15609 (2014).
- Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).
- Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10 (9), 1435-1442 (2015).
- Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning. Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).
- Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62 (6), 757-771 (2009).
- Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).
- Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).
- Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234 (2012).
- Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).
- Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467 (1), 60-79 (2003).
- Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, (2012).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).
- Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).
- Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).
- Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), (2013).
- Salegio, E. A., et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).
- Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, (2014).
- McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).
- Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, (2013).
