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Neuroscience

ब्रेन स्लाइस में डर सर्किट के पूर्व vivo optogenetic विच्छेदन

Published: April 5, 2016 doi: 10.3791/53628
Automatic Translation
1, 2, 1
1Hertie Institute for Clinical Brain Research and Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience, University of Tuebingen, 2Max Planck Florida Institute for Neuroscience

Summary

Optogenetic दृष्टिकोण व्यापक रूप से तंत्रिका गतिविधि में हेरफेर और मस्तिष्क समारोह के लिए परिणामों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इधर, एक तकनीक को रेखांकित किया है कि ऑप्टिकल उत्प्रेरक channelrhodopsin के vivo अभिव्यक्ति पर, डर से संबंधित सर्किट में विशिष्ट लंबी दूरी की और स्थानीय तंत्रिका कनेक्शन की synaptic गुण के पूर्व vivo विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।

Abstract

Optogenetic दृष्टिकोण अब व्यापक रूप से प्रकाश से प्रकाश सक्रिय प्रोटीन और तंत्रिका गतिविधि के बाद गड़बड़ी की लक्षित अभिव्यक्ति के संयोजन से तंत्रिका आबादी और सर्किट के समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। Channelrhodopsins (ChRs) प्रकाश-गेटेड केशन-चैनल हैं और जब एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े हुए उनकी अभिव्यक्ति दृश्य और विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं की समवर्ती सक्रियण और मस्तिष्क क्षेत्रों में परिभाषित उनके axonal अनुमानों के लिए अनुमति देता है। वायरल वैक्टर स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के माध्यम से, Chr संलयन प्रोटीन अनिवार्यता से या सशर्त एक परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्र के विशिष्ट कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है, और उनके axonal अनुमानों बाद में मस्तिष्क स्लाइस में पूर्व vivo optogenetic सक्रियण के माध्यम से संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से अध्ययन किया जा सकता है। यह विशेष रूप से महत्व की जब कनेक्शन है कि पारंपरिक बिजली की उत्तेजना के दृष्टिकोण के साथ संबोधित नहीं किया जा सकता है की synaptic गुणों को समझने के लिए लक्ष्य है, या उपन्यास Affe की पहचान करने मेंकिराया और अपवाही कनेक्टिविटी है कि पहले से खराब समझ गया था। इधर, कुछ उदाहरण देकर स्पष्ट है कि कैसे इस तकनीक प्रमस्तिष्कखंड में भय से संबंधित सर्किट elucidating करने के लिए इन सवालों की जांच के लिए लागू किया जा सकता है। प्रमस्तिष्कखंड अधिग्रहण और भय की अभिव्यक्ति है, और डर और भावनात्मक यादें के भंडारण के लिए एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है। सबूत के कई लाइनों का सुझाव है कि औसत दर्जे का प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (mPFC) डर के अधिग्रहण और विलुप्त होने के विभिन्न पहलुओं में भाग लेता है, लेकिन प्रमस्तिष्कखंड के साथ अपने सटीक कनेक्टिविटी सिर्फ समझा जाना शुरू कर रहा है। सबसे पहले, यह कैसे पूर्व vivo optogenetic सक्रियण basolateral प्रमस्तिष्कखंड (बीएलए) में mPFC afferents और लक्ष्य कोशिकाओं के बीच संचार की synaptic पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता दिखाया गया है। इसके अलावा, यह साफ है कि कैसे इस पूर्व vivo optogenetic दृष्टिकोण उपन्यास कनेक्टिविटी प्रमस्तिष्कखंड में GABAergic न्यूरॉन्स के एक समूह का उपयोग कर पैटर्न का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है, paracapsular intercalated सेल क्लस्टर (mpITC), एक उदाहरण के रूप में।

Introduction

दृश्य और मस्तिष्क क्षेत्रों और न्यूरॉन्स के विशिष्ट प्रकार के बीच विशिष्ट कनेक्शन की समवर्ती सक्रियण के लिए सटीक उपकरण कार्यात्मक कनेक्टिविटी अंतर्निहित स्वस्थ मस्तिष्क समारोह और रोग राज्यों को समझने में और अधिक महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं। आदर्श रूप में, यह सटीक synaptic संपत्तियों के साथ की पहचान न्यूरॉन्स संवाद की शारीरिक जांच पर जोर देता। यह मस्तिष्क क्षेत्रों है कि एक भी तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा में संरक्षित नहीं किया जा सकता है के बीच कनेक्शन के लिए विशेष रूप से सच है। अतीत में, यह काफी हद तक अलग प्रयोगों में हासिल किया गया है। एक तरफ, तंत्रिका ट्रेसर इंजेक्शन विवो बाद प्रकाश या पूर्व और postsynaptic भागीदारों की इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म विश्लेषण के साथ संयुक्त नियोजित किया गया है। दूसरी ओर, जब मूल के क्षेत्र से फाइबर इलाकों संरक्षित और टुकड़ा तैयारी में पहुंच रहे हैं, बिजली की उत्तेजना लक्ष्य क्षेत्र में कोशिकाओं के साथ synaptic संचार तंत्र का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

Optogenetics के आगमन के साथ, इस तरह के Channelrhodopsins (ChRs) फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े हुए के रूप में प्रकाश-गेटेड केशन-चैनलों के लक्षित अभिव्यक्ति, अब न्यूरॉन्स और उनके axonal trajectories की सक्रियता के लिए सक्षम बनाता है, जबकि उनके दृश्य और पोस्ट अस्थायी संरचनात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति 1- 4। क्योंकि Chr व्यक्त एक्सोन भी जब माता-पिता somata 5 से कटे प्रेरित किया जा सकता है, यह करने के लिए मस्तिष्क स्लाइस में संभव है: 1) मस्तिष्क क्षेत्रों है कि पारंपरिक बिजली की उत्तेजना के साथ सुलभ नहीं थे से जानकारी का आकलन, क्योंकि फाइबर इलाकों वियोज्य विशिष्ट प्रक्षेपवक्र नहीं हैं या ज्ञात नहीं है; 2) स्पष्ट विशिष्ट जानकारी है कि माने थे, लेकिन पूरी तरह से समझे के लिए मूल के क्षेत्र की पहचान; और 3) में परिभाषित प्रकार की कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी की जांच, दोनों को स्थानीय और लंबी दूरी के अनुमानों में। लाभ के एक नंबर की वजह से, मस्तिष्क स्लाइस में सर्किट के इस optogenetic मानचित्रण विस्तृत हो गया हैLy पिछले वर्षों में इस्तेमाल किया, और fluorescently टैग ChRs की अभिव्यक्ति के लिए वायरल वैक्टर की एक किस्म वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से आसानी से उपलब्ध हैं। बिजली की उत्तेजना भी पारित होने या अन्य आसपास की कोशिकाओं, और एक समान रूप से तेजी से और सटीक अस्थायी उत्तेजना के तंतुओं भर्ती सकता है क्योंकि पारंपरिक बिजली की उत्तेजना खत्म optogenetic सक्रियण के कुछ महत्वपूर्ण लाभ उत्तेजना इलेक्ट्रोड, फाइबर उत्तेजना की विशिष्टता के प्लेसमेंट के कारण ऊतक को कोई नुकसान कर रहे हैं। इसके अलावा, वायरल वैक्टर स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन आसानी से विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों 6 और सशर्त या सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति Cre पर निर्भर अभिव्यक्ति और / या विशिष्ट प्रमोटरों 7 का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता करने के लिए निशाना बनाया जा सकता है। इधर, इस तकनीक का डर प्रणाली में लंबी दूरी की मैपिंग और स्थानीय सर्किट के लिए लागू किया जाता है।

प्रमस्तिष्कखंड अधिग्रहण और भय की अभिव्यक्ति है, और डर और भावनात्मक यादें 8,9 के भंडारण के लिए एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है। इसके अलावा इधर-उधरप्रमस्तिष्कखंड हूँ, औसत दर्जे का प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (mPFC) और हिप्पोकैम्पस (एचसी), संरचनाओं कि आपस में प्रमस्तिष्कखंड से जुड़े हैं, अधिग्रहण, समेकन और भय और विलुप्त होने यादें 10,11 की बहाली के पहलुओं में फंसा रहे हैं। MPFC के उपखंडों में गतिविधि दोनों उच्च और निम्न डर को नियंत्रित करने में एक डबल भूमिका निभाने के लिए प्रकट होता है कहा गया है 12,13। इस भाग में प्रमस्तिष्कखंड कि प्रमस्तिष्कखंड गतिविधि और उत्पादन को नियंत्रित करने के लिए होगा mPFC से सीधे कनेक्शन द्वारा मध्यस्थता जा सकता है। इसलिए, पिछले वर्षों में, कई अध्ययनों से पूर्व vivo टुकड़ा प्रयोगों में प्रमस्तिष्कखंड 14-17 में mPFC afferents और विशिष्ट लक्ष्य कोशिकाओं के बीच synaptic बातचीत की जांच करने के लिए शुरू कर दिया।

डर सीखने के दौरान, वातानुकूलित और असुविधाजनक उत्तेजनाओं के बारे में जानकारी संवेदी विशिष्ट thalamic और cortical क्षेत्रों से अनुमानों के माध्यम से प्रमस्तिष्कखंड तक पहुँचता है। basol के पार्श्व भाग (LA) में न्यूरॉन्स के लिए इन सूचनाओं के plasticityateral प्रमस्तिष्कखंड (बीएलए) अंतर्निहित डर कंडीशनिंग 9,18 एक महत्वपूर्ण तंत्र है। बढ़ती सबूत पता चलता है कि प्रमस्तिष्कखंड में समानांतर प्लास्टिक प्रक्रियाओं डर स्मृति 19 को नियंत्रित करने के निरोधात्मक तत्वों को शामिल करना। संकुल निरोधात्मक न्यूरॉन्स के एक समूह ने GABAergic औसत दर्जे का paracapsular intercalated कोशिकाओं (mpITCs) कर रहे हैं, लेकिन उनकी सटीक कनेक्टिविटी और समारोह अधूरे 20-22 समझा जाता है। इधर, optogenetic सर्किट मानचित्रण प्रदर्शन है कि mpITCs thalamic और cortical रिले स्टेशनों 23 से प्रत्यक्ष संवेदी इनपुट प्राप्त करते हैं, इन कोशिकाओं के अभिवाही और अपवाही कनेक्टिविटी और प्रमस्तिष्कखंड में लक्ष्य न्यूरॉन्स पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। mpITCs या बीएलए न्यूरॉन्स में Chr के विशिष्ट अभिव्यक्ति स्थानीय बातचीत की मैपिंग की अनुमति देता है कि खुलासा, mpITCs रोकती हैं, लेकिन यह भी परस्पर द्वारा, बीएलए प्रिंसिपल न्यूरॉन्स सक्रिय कर रहे हैं, उन्हें प्रभावी ढंग से कि बीएलए गतिविधि को नियंत्रित उपन्यास फ़ीड आगे और प्रतिक्रिया निरोधात्मक सर्किट में रखकर23।

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Protocol

आचार बयान: सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं अनुसंधान के क्षेत्र में जानवरों के इस्तेमाल पर यूरोपीय संघ के निर्देश के अनुसार थे और स्थानीय पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया (Regierungspräsidium Tuebingen, Baden-Württemberg, जर्मनी के राज्य) विश्वविद्यालय के Tübingen के लिए जिम्मेदार है।

1. stereotactic इंजेक्शन प्रक्रिया

  1. बाँझ उपकरण (कैंची, छुरी, अकड़न, ड्रिल, सुई, सिवनी सामग्री) एक अजीवाणु का उपयोग कर तैयार करें। ऐसे बाँझ कपास स्वैप, कीटाणुनाशक, बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, पीएच 7.4), और एच 2 ओ 2 एक बाँझ सर्जिकल कपड़ा पर के रूप में बाँझ उपकरण और अन्य आवश्यक समाधान और शल्य चिकित्सा की आपूर्ति की व्यवस्था।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक क्षैतिज microelectrode खींचने पर इंजेक्शन के लिए कांच micropipettes (चित्रा 1 ए, इनसेट) एक 3 मिमी चौड़े बॉक्स फिलामेंट का उपयोग कर खींचो।
    नोट: गहरी इंजेक्शन के लिए, इलेक्ट्रोड घटना पर्याप्त होना चाहिएलंबे उदर सबसे निर्देशांक तक पहुंचने के लिए (लगभग 5 मिमी;। निर्देशांक के लिए, 1.10 देखें)।
  3. Premix वायरस समाधान के 1 μl और (कांच पिपेट में समाधान के बेहतर दृश्यता के लिए) बाँझ पीबीएस में 0.1% फास्ट ग्रीन समाधान के 0.2 μl। समाधान वायरस और तेजी से हरे रंग के लिए एक अच्छी टिप (चित्रा 1 ए, इनसेट) के साथ एक microliter पिपेट का उपयोग करने का मिश्रण के साथ कांच pipettes भरें।
    नोट: पुनः संयोजक एडिनो जुड़े वायरल वैक्टर (rAAV) के साथ काम जैव सुरक्षा स्तर 1 (बीएसएल 1) काम माना जाता है और एक बीएसएल 1 प्रयोगशाला में प्रदर्शन किए जाने की जरूरत है। इस अध्ययन (चित्रा 1 सी) में इस्तेमाल किया rAAVs थे: 1) mPFC: rAAV-Hsyn-ChR2 (H134R) -eYFP (सीरोटाइप 2/9) 16; 2) एमजीएम / पिन: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (सीरोटाइप 2/9) 23; 3) mpITC / बीएलए: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (सीरोटाइप 2/1) 23
  4. एक माउस एक छोटे जानवर संज्ञाहरण मशीन (: शामिल करने के लिए ऑक्सीजन में 3% isoflurane) का उपयोग कर anesthetize।
    नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल चूहों 4 थे -7 सप्ताह पुरानी है और निम्न तनाव और जीनोटाइप का: C57BL6 / जम्मू जंगली प्रकार (आंकड़े 2A और 3 ए-डी में प्रयोग); GAD67-GFP 24 (आंकड़े 2 बी और 3E-एच में प्रयोग); Tac2-Cre 25 (आंकड़े -2 सी और 3I-जम्मू में प्रयोग)।
  5. कान और आंखों के बीच सिर दाढ़ी। कपास swabs का उपयोग कर सिर मुंडा को कीटाणुनाशक (providone आयोडीन आधारित) लागू करें।
  6. संज्ञाहरण के दौरान आंखों के सूखने को रोकने के लिए एक आंख मरहम लागू करें। Subcutaneously (meloxicam आधारित, 0.1 मिलीलीटर की 5 मिलीग्राम / एमएल समाधान) एनाल्जेसिक के साथ माउस इंजेक्षन।
  7. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम (चित्रा 1 ए) में माउस प्लेस और एक गैस संज्ञाहरण मुखौटा के माध्यम से संज्ञाहरण बनाए रखने (Isoflurane: रखरखाव के लिए ऑक्सीजन में 2%)। आगे बढ़ने से पहले अंग वापसी पलटा का उपयोग कर संज्ञाहरण गहराई की जाँच करें।
    नोट: पूरे शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान बाँझ शर्तों के साथ ही संभव बनाए रखना; डिस्पोजेबल facemask पहनते हैं, शल्य जाओWN, और दस्ताने।
  8. कैंची का उपयोग कर सिर के शीर्ष पर त्वचा चीरा। धीरे कुंद संदंश का उपयोग करने के पक्ष त्वचा खींच, एच 2 ओ 2 के साथ खोपड़ी की सतह, और स्वच्छ खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए clamps के साथ तय कर लो।
  9. खोपड़ी पर मार्क इंजेक्शन साइटों दोनों गोलार्द्धों (चित्रा 1 बी) के लिए एक अच्छी टिप स्थायी मार्कर और छेद ड्रिल का उपयोग कर। निर्देशांक के लिए इस अध्ययन में इंजेक्शन (शीर्षस्थान (मिमी) से) हैं: mPFC: पूर्वकाल 1.9, 0.3 ± पार्श्व, उदर 2.1; एमजीएम / पिन: पीछे 3.0, 1.8 ± पार्श्व, उदर 3.8; mpITC / बीएलए: पीछे 1.45, 3.35 ±, और उदर 4.75 पार्श्व।
  10. एक दबाव इंजेक्शन डिवाइस से जुड़े स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर भरा गिलास पिपेट माउंट और शीर्षस्थान स्थिति के लिए पिपेट लाने के लिए।
  11. ठीक सीधे-टिप संदंश का उपयोग गिलास पिपेट की नोक बंद तोड़। वायरस के समाधान के एयरोसोल पीढ़ी को रोकने के लिए धीरे यह मत करो। यकीन विंदुक टिप में कुछ दबाव दालों को लागू करने और वीरू की बूंदों से बाहर निकालना देख कर खुला हैसमाधान।
  12. वांछित इंजेक्शन निर्देशांक पर जाएं और पिपेट सामग्री (~ 0.5 μl) के दबाव इंजेक्शन डिवाइस पर निम्न सेटिंग्स का उपयोग कर के आधे इंजेक्षन: दबाव: 20 साई, औसत पल्स लंबाई: 30 एमएस, दालों की औसत संख्या: 50।
  13. धीरे-धीरे (1 मिमी / मिनट) से पहले ~ 1 मिनट यह retracting के लिए जगह में पिपेट छोड़ दें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि पिपेट अन्य गोलार्द्ध पर एक ही विंदुक के साथ प्रक्रिया को दोहराने से पहले अवरुद्ध नहीं कर रहा है। या अवरुद्ध टिप के मामले, स्वच्छ में शीर्षस्थान पर टिप और शून्य पिपेट स्थिति दूर तोड़ने के लिए फिर से।
  14. पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ स्वच्छ खोपड़ी, अकड़न को दूर धीरे त्वचा साथ मिलकर काम करना, और व्यक्तिगत बटन सीवन के साथ चीरा सीवन (3 - 4 समुद्री मील)। घाव के आसपास कीटाणुनाशक (providone आयोडीन आधारित) लागू करें।
  15. संज्ञाहरण बंद करो और माउस छोड़ पहुंच से बाहर नहीं है, जब तक यह पूरी तरह से जाग रहा है। एकल रखे रखें या अन्य जानवरों की कंपनी केवल जब पूरी तरह से ठीक करने के लिए वापसी। ऑपरेशन के बाद स्वास्थ्य की स्थिति पर नजर रखने के लिए जारी है, और प्रशासनआतंकवाद एनाल्जेसिक यदि आवश्यक है। स्थानीय पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा आगे रखा नियमों के अनुसार प्रक्रियाओं का पालन करें।

2. तीव्र स्लाइस की तैयारी

  1. ACSF, काटने समाधान, उपकरण (कैंची, छुरी, संदंश, रंग, पाश्चर विंदुक), और अगर ब्लॉकों तैयार करें।
    नोट: कृत्रिम Cerebro-रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ (ACSF) के 1 एल प्रयोग के प्रति आवश्यक है, और डबल आसुत एच 2 ओ पहले प्रकाशित 16,23 के रूप में रसायनों भंग द्वारा तैयार किया जाता है। काटने समाधान 2 एम MgSO 4 स्टॉक समाधान के 0.87 मिलीलीटर के साथ ACSF की 200 मिलीलीटर सप्लीमेंट द्वारा तैयार किया जाता है।
  2. आक्सीजन ACSF और 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के साथ प्रयोग के दौरान काटने समाधान।
  3. गहराई से एक छोटा सा जानवर संज्ञाहरण मशीन isoflurane का उपयोग (ऑक्सीजन में 3%) का उपयोग माउस anesthetize। आगे बढ़ने से पहले अंग वापसी पलटा का उपयोग कर संज्ञाहरण गहराई की जाँच करें।
  4. बड़ी कैंची का उपयोग माउस सिर काटना और तुरंत ठंडाठंडा काटने समाधान में सिर।
  5. ओपन खोपड़ी दुम से व्याख्यान चबूतरे करने के लिए और एक भी midline चीरा द्वारा धीरे संदंश का उपयोग पक्षों के लिए खोपड़ी के टुकड़े धक्का। तेजी से धीरे यह खोपड़ी के एक छोटे गोल रंग का उपयोग कर से बाहर उठाने से मस्तिष्क को हटा दें। छुरी के साथ सेरिबैलम काट दिया। ठंडा काटने समाधान में मस्तिष्क रखें।
  6. mPFC इंजेक्शन साइटों के लिए: मस्तिष्क (mPFC युक्त) एक छुरी का उपयोग कर के पूर्वकाल हिस्सा कट और टुकड़ा करने की क्रिया जब तक ठंडा काटने के घोल में डाल दिया।
  7. एक फिल्टर पेपर के साथ अतिरिक्त काटने समाधान निकालें और vibratome मंच पर मस्तिष्क के पीछे भाग गोंद।
  8. झुका प्रमस्तिष्कखंड स्लाइस के लिए, एक 35 डिग्री के कोण (चित्रा -1, मध्य) में एक अगर ब्लॉक (4%) में कटौती पर मस्तिष्क गोंद। राज्याभिषेक प्रमस्तिष्कखंड स्लाइस, एमजीएम / पिन इंजेक्शन साइटों और mPFC इंजेक्शन साइटों के लिए, मंच पर सीधे मस्तिष्क गोंद (चित्रा -1, बाएं और दाएं)। मस्तिष्क के पीछे एक अतिरिक्त अगर ब्लॉक स्थिरता के लिए जगह है, जबकि टुकड़ा करने की क्रिया।
  9. Placकि एक शीतलन इकाई का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा है ठंडा ऑक्सीजन काटने समाधान के साथ चैम्बर काटने में ई मंच। प्रमस्तिष्कखंड (320 माइक्रोन) नीलमणि ब्लेड का उपयोग करने का तीव्र स्लाइस तैयार करें। एक इंटरफेस चैम्बर आरटी पर ऑक्सीजन ACSF के साथ आपूर्ति में स्लाइस रखें।
  10. 45 मिनट - तीव्र प्रमस्तिष्कखंड स्लाइस की तैयारी के बाद, 35 के लिए स्लाइस की वसूली के लिए 36 डिग्री सेल्सियस पर एक waterbath में इंटरफ़ेस चैम्बर जगह है। बाद में, आरटी के लिए इंटरफेस चैम्बर वापसी। इन स्लाइस से रिकॉर्डिंग के लिए, 3.2 कदम के साथ आगे बढ़ें।
  11. 2.10 कदम के प्रारंभ के दौरान इंजेक्शन साइटों के स्लाइस के रूप में तीव्र प्रमस्तिष्कखंड स्लाइस (- 2.9 कदम 2.8) के लिए पहले वर्णित काटा। waterbath में स्लाइस की वसूली यहां आवश्यकता नहीं है। वैकल्पिक: जल्दी, इंजेक्शन साइट स्थान का अनुमान एक फ्लोरोसेंट लैंप और उपयुक्त फिल्टर सेट से लैस एक त्रिविमदर्शी पर स्लाइस का निरीक्षण करने के लिए।
  12. उन्हें दो फिल्टर कागजात और submer के बीच sandwiching द्वारा पोस्ट अस्थायी विश्लेषण के लिए इंजेक्शन साइटों युक्त स्लाइस फिक्सउन्हें पीबीएस समाधान हे / एन में 4% paraformaldehyde (पीएफए) में ging। इंजेक्शन साइटों के विश्लेषण के लिए कदम 4.1 के साथ आगे बढ़ें।

3. दृश्य और presynaptic फाइबर की उत्तेजना

  1. फाइबर और कोशिकाओं के optogenetic सक्रियण के लिए पैच माइक्रोस्कोप तैयार:
    1. घुड़सवार प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) प्रकाश वितरण मार्ग पर केंद्र।
    2. वापस फोकल हवाई जहाज़ पर और 470 एनएम का उचित तरंगदैर्ध्य का चयन एक बिजली मीटर के साथ प्रत्येक उद्देश्य के उत्पादन में एलईडी प्रकाश की तीव्रता को मापने।
    3. मेगावाट / 2 मिमी में प्रकाश की तीव्रता की गणना और एक अंशांकन वक्र (एलईडी तीव्रता (%) मेगावाट / 2 मिमी) प्रकाश उत्पादन (बनाम) 470 एनएम तरंगदैर्ध्य के लिए मापा मूल्यों के लिए प्रत्येक उद्देश्य के लिए पैदा करते हैं।
  2. इंटरफेस कक्ष और टुकड़ा चैम्बर ईमानदार एक फ्लोरोसेंट लैंप के साथ सुसज्जित खुर्दबीन पर मुहिम शुरू में जगह से एक तीव्र प्रमस्तिष्कखंड टुकड़ा निकालते हैं। ऐसी है कि SLIC टुकड़ा की स्थिति के लिए ध्यान रखनाई सतह इंटरफेस कक्ष में ऊपर की ओर का सामना करना पड़ भी रिकॉर्डिंग कक्ष में ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है। ~ 31 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 2 मिलीग्राम / मिनट - 1 की दर से ताजा, ऑक्सीजन ASCF साथ टुकड़ा छिड़कना।
  3. व्यक्त विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए उपयुक्त फिल्टर सेट के साथ संयोजन में फ्लोरोसेंट लैंप का उपयोग कर टुकड़ा में presynaptic फाइबर का निरीक्षण करें। एक सिंहावलोकन (चित्रा 1E), और लक्ष्य क्षेत्र के भीतर फाइबर घनत्व के आकलन के लिए 60x उद्देश्य प्राप्त करने के लिए 5x उद्देश्य का उपयोग करें।
    नोट: GFP और YFP के लिए, का उपयोग करें फ़िल्टर निर्दिष्ट के रूप में mCherry फिल्टर सेट "लाल" (उत्तेजना 560/40, beamsplitter 585, 630/70 उत्सर्जन) का उपयोग करने के लिए सेट "हरी" (उत्तेजना 472/20, beamsplitter 495, 490 उत्सर्जन एलपी) सामग्री / उपकरण तालिका में।
  4. खोलें या के रूप में प्रयोग (चित्रा 2 डी) के लिए वांछित माइक्रोस्कोप प्रकाश मार्ग में एपर्चर सीमित।
  5. एक पैच रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए, आंतरिक समाधान के साथ एक पैच पिपेट भरने और मैं माउंटn इलेक्ट्रोड धारक। पैच पिपेट करने के लिए सकारात्मक दबाव लागू करें और धीरे-धीरे टुकड़ा micromanipulator का उपयोग करने में स्नान समाधान में पहले और उसके बाद इसे कम दृश्य नियंत्रण के अधीन।
    1. पक्ष और ऊपर से पैच पिपेट के साथ ब्याज की न्यूरॉन दृष्टिकोण। सकारात्मक दबाव जारी जब पिपेट सेल (डिंपल कोशिका की सतह पर दिखाई) की सतह पर है और नकारात्मक दबाव लागू करने के द्वारा एक "gigaseal" प्राप्त करते हैं।
    2. पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए झिल्ली पैच टूटना करने के लिए आगे सक्शन लागू करें। बाद में, Chr (470 एनएम) को सक्रिय सेल से बिजली प्रतिक्रियाओं जबकि रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त तरंग दैर्ध्य का उपयोग जुड़े एलईडी के साथ लेबल तंतुओं को प्रोत्साहित।
    3. synaptic उत्तेजना के लिए एक कम तीव्रता का नेतृत्व के साथ शुरू और वृद्धि जब तक वांछित synaptic वर्तमान आयाम तक पहुँच जाता है। डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में डिजिटल outputs के विन्यास के समय और नाड़ी की लंबाई (चित्रा में उदाहरण को नियंत्रित करने के नेतृत्व में ट्रिगर3)।
      नोट: अन्य सॉफ्टवेयर और / या टीटीएल पैदा उपकरणों एलईडी ट्रिगर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  6. माइक्रोस्कोप प्रकाश मार्ग के रूप में अगले दर्ज सेल और / या विशिष्ट दवाओं की उपस्थिति में लिए वांछित में खोला या प्रतिबंधित एपर्चर (3.4 कदम) के साथ दोहराएँ उत्तेजना।
  7. दर्ज करने के बाद उन्हें दो फिल्टर कागजात के बीच sandwiching और उन्हें 4% पीएफए ​​हे / एन में जलमग्न द्वारा पोस्ट अस्थायी विश्लेषण के लिए स्लाइस को ठीक।
  8. electrophysiological डेटा का विश्लेषण।
    नोट: उपयुक्त सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें प्रत्येक व्यक्ति उत्तेजना ऑफ़लाइन के लिए दर्ज झाडू डेटा कल्पना करने के लिए। जब दवाओं के प्रभाव का विश्लेषण करने, सभी अलग-अलग sweeps के लिए synaptic वर्तमान आयाम पर दवा प्रभाव के समय पाठ्यक्रम प्राप्त करने के लिए चोटी का पता लगाने दिनचर्या का उपयोग करें। निर्धारित जब दवा प्रभाव स्थिर अवस्था तक पहुँचता है। आंकड़ों के लिए प्रतिनिधि औसत प्रतिक्रियाओं को तैयार करने के लिए, प्रयोगात्मक हालत प्रति औसत ≥10 व्यक्ति स्वीप करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें (सीएफ चित्रा 3 बी डी, एफ एच, जम्मू सही पैनल)।
    नोट: कई वैकल्पिक सॉफ्टवेयर संकुल डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

4. पोस्ट अस्थायी इंजेक्शन साइटों का विश्लेषण

  1. इंजेक्शन साइटों और पीबीएस में रिकॉर्डिंग साइटों (यदि फिर से इमेजिंग 3.7 चरण से, वांछित है) तीन बार (2.12 कदम से) के स्लाइस धो लें। यह बार बार समाधान ताजा पीबीएस के साथ एक घूर्णन प्रकार के बरतन पर 10 मिनट के लिए तीन बार की जगह द्वारा किया जाता है।
  2. पीबीएस में 2% अगर-अगर समाधान तैयार है, और यह ~ 65 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें। प्लेस स्लाइस एक छोटे से 30 मिमी व्यास पेट्री डिश के तल पर फ्लैट, अगर-अगर में स्लाइस एम्बेड और यह ठोस जब तक ठंडा होने दें।
  3. एक vibratome के मंच पर एम्बेडेड टुकड़ा या स्लाइस के साथ एक अगर ब्लॉक गोंद और पीबीएस के साथ चैम्बर काटने में मंच जगह है।
  4. लकीर एम्बेडेड 70 माइक्रोन मोटाई के स्लाइस। वैकल्पिक: resectioning के बाद, स्लाइस दाग जा सकता है, यानी, NeuroTrace साथ cytoarchitecture (चित्रा 3 ए, सी) प्रकट करने के लिए, और / या बीYFP या mCherry के लिए y immunofluorescence धुंधला Chr संलयन प्रोटीन से सिग्नल को बढ़ावा देने के लिए।
  5. स्लाइड और बढ़ते मीडिया के साथ coverslip पर माउंट स्लाइस। छवि इंजेक्शन साइटों और, अगर वांछित, भी छवि एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप या एक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (चित्रा 2A सी) का उपयोग प्रक्षेपण क्षेत्रों में फाइबर युक्त स्लाइस।

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Representative Results

यह खंड बीएलए के लिए संवेदी और modulatory लंबी दूरी के अनुमानों और mpITC न्यूरॉन्स के रूप में अच्छी तरह से mpITC और बीएलए के बीच स्थानीय कनेक्टिविटी के गुणों के शारीरिक गुणों की जांच करने के लिए एक पूर्व vivo optogenetic दृष्टिकोण और विभिन्न प्रयोगात्मक रणनीतियों से प्रतिनिधि परिणामों के कार्यप्रवाह पता चलता है।

माउस मस्तिष्क में वांछित निर्देशांक पर चयनित वायरल वेक्टर के स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के बाद (चित्रा 1 ए सी, वायरल अभिव्यक्ति समय 2 - 6 सप्ताह, प्रयोग के आधार पर), इंजेक्शन साइटों और प्रमस्तिष्कखंड में प्रक्षेपण क्षेत्रों के तीव्र मस्तिष्क स्लाइस तैयार कर रहे हैं पैच दबाना प्रयोगों के लिए और इंजेक्शन साइटों (चित्रा -1) के पद पर अस्थायी विश्लेषण के लिए इंजेक्शन मस्तिष्क क्षेत्र से उचित कोण पर। रिकॉर्डिंग और optogenetic उत्तेजना, fluorescently लेबल कोशिकाओं या axonal समर्थक शुरू करने से पहलेलक्ष्य क्षेत्र (प्रमस्तिष्कखंड) में jections जुड़ी फ्लोरोसेंट लैंप (चित्रा 1E) का उपयोग करके पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए ईमानदार माइक्रोस्कोप पर जाँच की जानी चाहिए। एक पैच दबाना टुकड़ा का प्रक्षेपण क्षेत्र में एक ख्यात लक्ष्य सेल से रिकॉर्डिंग प्राप्त करने पर, जबकि समय बिंदु, अंतराल, और नाड़ी की लंबाई पैच सॉफ्टवेयर है कि प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) चलाता है के माध्यम से नियंत्रित कर रहे हैं प्रकाश उत्तेजना शुरू की है। प्रयोगात्मक रणनीति पर निर्भर करता है (चित्रा 2A सी, दाएं) फ्लोरोसेंट प्रकाश पथ में एपर्चर या तो पूरी तरह से खोला या प्रतिबंधित (चित्रा 2 डी) है। पल्स लंबाई निरंतर और जितना संभव हो कम रखते हुए (आदर्श ≤1 मिसे), एलईडी उत्पादन तीव्रता धीरे-धीरे आकलन करने के लिए जो तीव्रता एक विशेष प्रयोग (चित्रा 2 ई) में synaptic प्रतिक्रिया के वांछित आयाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है बढ़ जाती है। रिकॉर्डिंग के बाद, प्रमस्तिष्कखंड स्लाइस के बाद तय कर रहे हैं। resectioning और वैकल्पिक परधुंधला हो जाना, इंजेक्शन और रिकॉर्डिंग साइटों इंजेक्शन स्थान को सत्यापित करने और गलत इंजेक्शन से डेटा बाहर करने के लिए एक confocal खुर्दबीन पर imaged हैं। इंजेक्शन साइटों की छवियों और तीन प्रयोगात्मक रणनीतियों के लिए प्रमस्तिष्कखंड में जुड़े axonal अनुमानों (बीएलए को mPFC आदानों, mpITCs को thalamic आदानों, और स्थानीय mpITC सक्रियण) चित्रा 2A सी में दिखाया जाता है।

चित्रा 3 बीएलए प्रिंसिपल न्यूरॉन्स से प्राप्त प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग परिणाम, स्थानीय बीएलए इन्तेर्नयूरोंस और mpITC न्यूरॉन्स इस्तेमाल किया विभिन्न प्रयोगात्मक रणनीतियों के लिए प्रकाश पैदा प्रतिक्रियाओं के गुण (चित्रा 3 ए, ई, मैं) illustrating पता चलता है। रिकॉर्डिंग के लिए GABAergic न्यूरॉन्स (स्थानीय इन्तेर्नयूरोंस और mpITCs) को लक्षित करने के लिए, GAD67-GFP संवाददाता चूहों 24 इस्तेमाल किया गया। mPFC और संवेदी thalamic अनुमानों के लिए, synaptic प्रसारण के कई पहलुओं का अध्ययन किया जा सकता है। एसी के अस्थायी परिशुद्धताtivation और इस अध्ययन में इस्तेमाल ChRs की गतिज गुण 50 मिसे के एक अंतर प्रोत्साहन अंतराल पर बनती दालों के साथ विश्वसनीय उत्तेजना सक्षम करें। इस पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं (पीएससी), जो या तो सुविधाजनक बनाने या निराशाजनक प्रक्षेपण और लक्ष्य सेल प्रकार पर निर्भर हो सकता है, और presynaptic रिहाई संभावना के संकेतक (चित्रा 3 बी, एफ, एच) के रूप में सेवा की बनती पल्स अनुपात (पीपीआर) के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । इसके अतिरिक्त, synaptic सुप्तावस्था के विश्लेषण के विभिन्न पोस्टअन्तर्ग्रथनी प्रतिक्रिया घटकों के विच्छेदन के लिए अनुमति देता है।

इस उदाहरण में, निरोधात्मक पीएससी (IPSC) बनाम उत्तेजक पीएससी (EPSC) घटक की लंबी सुप्तावस्था एक disynaptic और monosynaptic इनपुट, क्रमशः (चित्रा 3 सी) से संकेत मिलता है। अन्य मामलों में, इस तरह की प्रतिक्रिया घबराना या प्रतिक्रिया आकार के विचरण के गुणांक के रूप में अतिरिक्त EPSC संपत्तियों की एक और अधिक गहन विश्लेषण इसकी मोनो या disyna पर निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए आवश्यक हो सकता हैptic प्रकृति 17,23। इसके अलावा, विशिष्ट रिसेप्टर्स के लिए औषधीय ब्लॉकर्स के आवेदन पीएससी की प्रकृति की पहचान कर सकते हैं (यानी, ग्लूटामेटरगिक EPSC और GABAergic IPSC, चित्रा -3 सी-डी)। जैसी कि उम्मीद थी, mPFC इनपुट के प्रारंभिक घटक ग्लूटामेटरगिक था, जबकि देर घटक GABAergic था। दोनों EPSC और IPSC ग्लूटामेट रिसेप्टर अवरोधक CNQX साथ की पूरी ब्लॉक आगे कहा कि IPSC disynaptic है समर्थन करता है। Optogenetically सक्रिय तंतुओं पर synaptic प्रसारण के मॉडुलन की जांच करने के लिए, आयाम और पीपीआर पर एगोनिस्ट और metabotropic रिसेप्टर्स के लिए विरोधी के प्रभाव (यहां गाबा बी रिसेप्टर्स) पूर्व और postsynaptic साइटों पर प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है। इस उदाहरण में, पीपीआर में वृद्धि के साथ आयाम के सहवर्ती कमी प्रकाश सक्रिय फाइबर (3 जी, एच) की एक प्रेस्य्नाप्तिक मॉडुलन का संकेत है। अंत में, प्रमस्तिष्कखंड में कोशिकाओं की स्थानीय बातचीत का आकलन किया जा सकता है, उदाहरण के लिए,जब चूहों कि Tac2 प्रमोटर 25 के नियंत्रण में सीआरई एक्सप्रेस एक डबल floxed Chr व्यक्त वायरल वेक्टर (चित्रा 1 सी) के साथ इंजेक्शन रहे हैं। क्योंकि Tac2 और इस प्रकार, Chr mpITC और केंद्रीय प्रमस्तिष्कखंड (चित्रा -2) में व्यक्त किया जाता है, प्रकाश सक्रियण फ्लोरोसेंट प्रकाश पथ एपर्चर (चित्रा 2 डी) बंद करके mpITC करने के लिए प्रतिबंधित किया गया था। इन शर्तों के तहत, प्रकाश पैदा कार्रवाई क्षमता संक्रमित mpITCs में हासिल किया जा सकता है। बीएलए में लघु विलंबता निरोधात्मक synaptic प्रतिक्रियाओं mpITC और बीएलए प्रिंसिपल न्यूरॉन्स के बीच एक कार्यात्मक निरोधात्मक कनेक्शन की उपस्थिति का संकेत।

आकृति 1
चित्रा 1. स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी, और presynaptic फाइबर का दृश्य। (ए, बी) स्टीरियोटैक्टिक वायरस इंजेक्शन। ए) anesthetized माउस का चित्र खोपड़ी के साथ एक stereotactic फ्रेम में रखा और उजागरइंजेक्शन पिपेट। इनसेट: समाधान वायरस तेजी से हरे रंग के साथ मिश्रित के साथ भरा इंजेक्शन पिपेट की तस्वीर में ज़ूम। स्केल पट्टी: 3 मिमी। (बी) के अलग-अलग क्षेत्रों के लिए इंजेक्शन छेद ड्रिल चिह्नित पदों के साथ एक माउस खोपड़ी के योजनाबद्ध। (सी) योजना के विभिन्न वायरल इस अध्ययन में इस्तेमाल निर्माणों दिखा। डार्क ग्रे: प्रमोटर अनुक्रम; ब्लू: Channelrhodopsin2 (ChR2 (H134R)); हरी / लाल: फ्लोरोसेंट प्रोटीन। mPFC और एमजीएम / पिन से अनुमानों के लिए 6 सप्ताह - अभिव्यक्ति समय स्थानीय प्रमस्तिष्कखंड अनुमानों के लिए 2 सप्ताह और 4 था। (डी) तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी: इस योजना के अलग-अलग इंजेक्शन और प्रक्षेपण क्षेत्रों से स्लाइस प्राप्त करने के लिए स्लाइसर मंच पर माउस मस्तिष्क के स्थान दिखा। (ई) एक GAD67-GFP माउस एमजीएम / पिन में ChR2-mCherry वायरस के साथ इंजेक्शन से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में फाइबर के दृश्य। चित्र अलग फिल्टर सेट के साथ ईमानदार पैच माइक्रोस्कोप पर लिया जाता है: GAD67-GFP अभिव्यक्ति, मध्य; एमजीएम / पिन फाइबर एम सी के साथ लेबलherry, सही है। स्केल पट्टी: 200 माइक्रोन। mPFC, औसत दर्जे का प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स; mpITC, औसत दर्जे का paracapsular intercalated कोशिकाओं; बीएलए, basolateral प्रमस्तिष्कखंड; एमजीएम, औसत दर्जे का geniculate नाभिक, औसत दर्जे का हिस्सा; पिन, thalamic नाभिक intralaminar पीछे; ला, पार्श्व प्रमस्तिष्कखंड; बीए, बेसल प्रमस्तिष्कखंड; सीईए, प्रमस्तिष्कखंड के केंद्रीय नाभिक। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. इंजेक्शन साइटों, प्रोजेक्शन क्षेत्रों, और axonal अनुमानों के optogenetic उत्तेजना। (एसी) प्रतिनिधि इंजेक्शन साइटों और बीएलए में प्रक्षेपण क्षेत्रों के Confocal छवियों, और प्रयोगात्मक रणनीतियों की योजनाओं। (ए) वाम: एक C57BL 6 / माउस NeuroTrace के साथ दाग में mPFC इंजेक्शन साइट। पैमाने पर पट्टी:500 माइक्रोन। मध्य: इसी बीएलए में अनुमानों से झुके प्रमस्तिष्कखंड टुकड़ा में। स्केल पट्टी: 200 माइक्रोन। अधिकार: mPFC अनुमानों और बीएलए में न्यूरॉन की रिकॉर्डिंग के पूरे क्षेत्र रोशनी के योजनाबद्ध। (बी) वाम: एक GAD67-GFP माउस में एमजीएम / पिन इंजेक्शन साइट। स्केल पट्टी: 500 माइक्रोन। मध्य: mpITC और एक राज्याभिषेक प्रमस्तिष्कखंड टुकड़ा के ला में इसी अनुमानों। स्केल पट्टी: 200 माइक्रोन। अधिकार: एमजीएम / पिन अनुमानों और एक mpITC न्यूरॉन की रिकॉर्डिंग के पूरे क्षेत्र रोशनी के योजनाबद्ध। (सी) वाम: एक Tac2-CRE माउस की एक NeuroTrace दाग प्रमस्तिष्कखंड टुकड़ा में ChR2-YFP के स्थानीय अभिव्यक्ति। स्केल पट्टी: 200 माइक्रोन। इनसेट: ChR2-YFP व्यक्त mpITCs में ज़ूम। स्केल पट्टी: 20 माइक्रोन। अधिकार: mpITC क्लस्टर और एक बीएलए न्यूरॉन की रिकॉर्डिंग के प्रतिबंधित रोशनी के योजनाबद्ध। (डी) खुला और प्रतिबंधित कोल के साथ एक GAD67-GFP माउस में तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में प्रकाश वितरण और न्यूरॉन्स की छवि (mpITC क्लस्टर) के दौरान कक्ष रिकॉर्डिंग के चित्रसंरचना। स्केल पट्टी: 30 माइक्रोन। (ई) उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं (EPSCs) विभिन्न एलईडी तीव्रता (ऊपर) और प्रकाश बिजली की साजिश द्वारा पैदा बनाम एमजीएम / पिन से फाइबर की optogenetic सक्रियण पर एक प्रतिनिधि mpITC न्यूरॉन से EPSC आयाम (नीचे) पैदा की। स्केल पट्टी: 100 पीए / 10 मिसे।
नोट:। चित्रा 2A संदर्भ # 23 से संदर्भ # 16 और चित्रा -2 से संशोधित किया गया है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. लंबी दूरी की और स्थानीय अनुमानों के optogenetic सक्रियण से अनुकरणीय परिणाम। (ए) के लिए प्रयोगात्मक रणनीति की योजना (बी)। (बी) के प्रतिनिधि EPSCs एक बीएलए प्रिंसिपल न्यूरॉन से दर्ज की गई औरmPFC से फाइबर की optogenetic बनती पल्स उत्तेजना (50 मिसे अंतर प्रोत्साहन अंतराल) पर बीएलए interneuron क्रमश: पल्स सरलीकरण और बनती पल्स अवसाद बनती है, जानने। स्केल पट्टी: 100 पीए / 25 मिसे। (सी) mPFC से फाइबर की optogenetic सक्रियण फ़ीड आगे निषेध elicits। वाम: प्रतिनिधि EPSC (-70 एम वी पर) और निरोधात्मक पोस्टअन्तर्ग्रथनी वर्तमान (IPSC, 0 एम वी पर) एक बीएलए प्रिंसिपल न्यूरॉन में। IPSC एक लंबी synaptic विलंबता EPSC की तुलना में है। स्केल सलाखों: 200 पीए / 10 मिसे और 200 पीए / 2 मिसे। अधिकार: प्रकाश पैदा biphasic EPSC / IPSC अनुक्रम (-50 एम वी पर), AMPA / Kainate प्रतिपक्षी CNQX (10 माइक्रोन) द्वारा अवरुद्ध है आगे IPSC की disynaptic प्रकृति का समर्थन। स्केल पट्टी: 50 पीए / 5 मिसे। (डी) EPSC / IPSC अनुक्रम के बाद ब्लॉक (-50 एम वी पर) के प्रभाव सीएल द्वारा - चैनल अवरोधक Picrotoxin (PTX, 100 माइक्रोन) के और PTX + CNQX। IPSC PTX और CNQX द्वारा शेष EPSC द्वारा अवरुद्ध है। स्केल सलाखों: 50 पीए / 5 मिसे। (ई) के लिए प्रयोगात्मक रणनीति की योजना (एफ एच)। एफ) एक mpITC और एमजीएम / पिन से फाइबर की optogenetic बनती पल्स उत्तेजना पर एक बीएलए प्रिंसिपल न्यूरॉन से दर्ज प्रतिनिधि EPSCs। स्केल पट्टी: 50 पीए / 20 मिसे। (G) एक और mpITC न्यूरॉन में EPSCs, सोडियम चैनल अवरोधक tetrodotoxin (TTX, 0.5 माइक्रोन) के द्वारा अवरुद्ध कर रहे हैं यह दर्शाता है कि वे सोडियम चैनल गतिविधि पर निर्भर हैं। स्केल पट्टी: 50 पीए / 20 मिसे। (एच) mpITC न्यूरॉन्स के लिए thalamic आदानों प्रीसानेप्टिक गाबा बी रिसेप्टर्स द्वारा संग्राहक हैं। नियंत्रण शर्त के तहत EPSCs, गाबा बी एगोनिस्ट Baclofen (2 माइक्रोन) के आवेदन के दौरान EPSC आयाम और बनती पल्स अनुपात में सहवर्ती वृद्धि की कमी है, और दोनों आयाम की वसूली और गाबा बी प्रतिपक्षी CGP55845 के सह आवेदन पर बनती पल्स राशन प्रारंभिक (10 माइक्रोन) के। इन परिवर्तनों को गाबा बी रिसेप्टर्स द्वारा एक प्रेस्य्नाप्तिक मॉडुलन के संकेत हैं। स्केल पट्टी: 50 पीए / 20 मिसे। (मैं) (जे) के लिए प्रयोगात्मक रणनीति की योजना। (जे) प्रकाश पैदा कार्रवाई की क्षमता एक ChR2-YFP से दर्ज mpITC न्यूरॉन व्यक्त। प्रकाश पैदा IPSCs अलग होल्डिंग क्षमता पर एक बीएलए प्रिंसिपल न्यूरॉन से दर्ज (-90, -70, -50, -20, और 0 एम वी) सीएल के लिए गणना संतुलन क्षमता के चारों ओर रिवर्स -। स्केल सलाखों: 20 एम वी / 100 मिसे और 10 पीए / 10 मिसे। नोट:। चित्रा 3 बी डी चित्रा 3H और जम्मू संदर्भ # 23 से संदर्भ # 16 से संशोधित किया गया है, और यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल तंत्रिका सर्किट और स्थानीय कनेक्टिविटी आसानी से अधिकांश पर लागू किया जा सकता है कि नहीं तो सब के पूर्व vivo optogenetic जांच के लिए एक विधि का वर्णन है, उन्हें एक ~ 470 एनएम epifluorescence प्रकाश बंदरगाह पर एलईडी के साथ लैस द्वारा ईमानदार टुकड़ा पैच दबाना रिकॉर्डिंग setups। स्लाइस में axonal अनुमानों के optogenetic उत्तेजना का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह है, क्योंकि इसी फाइबर इलाकों, पता नहीं चल पाया स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं है, या में संरक्षित नहीं विशिष्ट सक्रियण और कनेक्शन है कि पारंपरिक बिजली की उत्तेजना के साथ सुलभ नहीं थे की संपत्तियों की जांच के लिए अनुमति देता है एक भी मस्तिष्क टुकड़ा। डर सर्किट के लिए प्रासंगिक एक प्रमुख उदाहरण के रूप में, यह है कि यह कैसे प्रमस्तिष्कखंड को mPFC आदानों के गुण काटना करने के लिए लागू किया जा सकता सचित्र है।

यहाँ तक कि उन मामलों में जहां बिजली फाइबर पथ उत्तेजना बड़े पैमाने पर पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है, इन इलाकों अक्सर मूल के विभिन्न क्षेत्रों से फाइबर ले। उदाहरण के लिए, सीखने को डर से संबंधित सर्किट में, अलग-अलग संवेदी thalamic नाभिक या cortical क्षेत्रों से अनुमानों आंतरिक और बाह्य कैप्सूल के माध्यम से क्रमश: intermingled चलाते हैं। optogenetic उत्तेजना का लाभ यह है कि यह एक निर्धारित क्षेत्र से फाइबर का एक सबसेट के चुनिंदा सक्रियण के लिए सक्षम बनाता है। इस intercalated कोशिकाओं और पार्श्व प्रमस्तिष्कखंड प्रिंसिपल कोशिकाओं के लिए पिन और एमजीएम से विशिष्ट thalamic आदानों के लिए सचित्र है। इसके अलावा, बिजली की उत्तेजना, यानी, पारित होने या उत्तेजक इलेक्ट्रोड कि लक्ष्य क्षेत्र में स्थानीय कनेक्शन कर सकते हैं के आसपास के क्षेत्र में कोशिकाओं के अन्य फाइबर की सक्रियता के साथ उत्पन्न होने वाली समस्याओं को दूर किया जा सकता है। हालांकि, जबकि optogenetic उत्तेजना बिजली की उत्तेजना के रूप में समान रूप से तेजी से होता है, वहाँ उत्तेजना आवृत्ति है कि मज़बूती से लागू किया जा सकता है के बारे में सीमाओं हो सकता है। इस expressio के रूप में रूप में अच्छी तरह निष्क्रियता और deinactivation कैनेटीक्स पर और Chr के संस्करण है कि इस्तेमाल किया जा रहा है, 4 की निर्भर करता हैn स्तर और विधियों, और प्रकाश उत्तेजना तरीकों 26।

एक एलईडी प्रकाश उत्तेजना के लिए प्रतिदीप्ति बंदरगाह के लिए मुहिम शुरू का उपयोग करते हैं, आम तौर पर एक दिया उद्देश्य की दृष्टि से पूरे क्षेत्र प्रबुद्ध है, सभी फाइबर या क्षेत्र में कोशिकाओं की सक्रियता में और एक निश्चित गहराई के भीतर हो जाती है। यह केवल आंशिक रूप से एक छोटे क्षेत्र के लिए प्रतिबंधित या लेबल की कोशिकाओं के लिए सेट किया जा सकता है (इस उदाहरण में, mpITC) फ्लोरोसेंट प्रकाश पथ 23,27 में एक छेद का उपयोग कर। एल ई डी के साथ, प्रकाश की शक्ति, एक मुद्दा नहीं है के रूप में उच्च शक्ति नीले एलईडी अब कई निर्माताओं से उपलब्ध हैं। हालांकि, उत्सर्जन स्पेक्ट्रा नैनोमीटर के कई दसियों की पूर्ण चौड़ाई आधा अधिकतम मूल्य नहीं है। इसलिए, एल ई डी सीमाओं मुद्रा जब या तो कनेक्टिविटी और / या एक रंग उत्तेजना की subcellular मानचित्रण के लिए स्थानिक सटीक उत्तेजना वांछित हैं। दोनों अधिक परिष्कृत setups कि टार सक्षम के साथ, प्रकाश स्रोतों के रूप में नीले लेजर का उपयोग आमतौर पर संयोजन में सुधार किया जा सकताgeting और / या छोटे क्षेत्रों में किरण की स्कैनिंग और परिभाषित ऊतक गहराई (जैसे, 28 देखें)।

साथ पूर्व vivo optogenetic दृष्टिकोण यहाँ वर्णित है, synaptic प्रसारण के कई गुणों का अध्ययन किया जा सकता है। जल्दी synaptic प्रतिक्रिया घटक, सुप्तावस्था का गहन विश्लेषण और उनके घबराना के monosynapticity, साथ ही प्रतिक्रिया आयाम विचरण आकलन करने के लिए दर्ज न्यूरॉन्स (जैसे, 16,17,23 देखें) का एक प्रतिनिधि नमूने पर इस्तेमाल किया जाना चाहिए। मामलों में जहां नेटवर्क गतिविधि की सक्रियता के एक भूमिका निभा सकता है, पसंद की विधि (tetrodotoxin (TTX) + K चैनल अवरोधक 4-aminopyridine के साथ संयोजन में कार्रवाई क्षमता को ब्लॉक करने का एक संयोजन को लागू करने से प्रत्यक्ष monosynaptic घटक को अलग-थलग करने के लिए है 4 एपी) repolarization 14,28,29 को रोकने के लिए। आदानों की मोनो और disynaptic घटकों मध्यस्थता रिसेप्टर्स औषधीय ब्लॉकर्स का उपयोग कर पहचाना जा सकता है। Furthermorई, यह प्रमस्तिष्कखंड 23,30 में optogenetically सक्रिय आदानों की प्रेस्य्नाप्तिक मॉडुलन के पहलुओं का अध्ययन करने के लिए संभव है। एक संभावित चेतावनी ChR2 कुछ कैल्शियम पारगम्यता 1,4 है और presynaptic फाइबर और टर्मिनलों में अपने सक्रियण विभिन्न तंत्र 26,31 द्वारा रिलीज संभावना को बदलने के लिए सुझाव दिया गया है कि है। फिर भी, और दिखाया यहाँ सफलतापूर्वक कार्यरत ChR2 अभिव्यक्ति इनपुट की पहचान करने और सेल विशिष्ट और अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों 16,23,26,32 प्रमस्तिष्कखंड में बनती पल्स अनुपातों में मतभेद निशाना बनाने के लिए उदाहरण सक्रियण द्वारा रिलीज की संभावना है इसके अलावा प्रदर्शन किया मॉडुलन सहित कई अध्ययनों presynaptic टर्मिनलों में विशिष्ट संकेत दे रास्ते कि Chr सक्रियण 23,30 से रोका नहीं गया था। इसके अलावा समर्थन, हिप्पोकैम्पस और सेरिबैलम में डेटा से आता दिखा रहा है कि उचित Chr अभिव्यक्ति विधि और प्रकाश उत्तेजना तकनीक, रिहाई और निष्ठा ओ की प्रभावकारिता सहित शारीरिक पहलुओं के साथएफ synaptic प्रसारण मज़बूती से 26 का अध्ययन किया जा सकता है। अन्त में, optogenetic फाइबर सक्रियण भी सफलतापूर्वक उत्तेजना प्रोटोकॉल है कि synaptic plasticity 31,33,34 प्रेरित लागू करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

कई पहलुओं को इस विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं। एक वायरल वैक्टर स्टीरियोटैक्टिक लक्ष्य-निर्धारण की सटीक है। इसलिए, यह तेजी से रिकॉर्डिंग प्राप्त करने से पहले इंजेक्शन साइट स्थान का आकलन करने के लिए और फिर एक अधिक विस्तृत पद अस्थायी विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है। स्थानिक परिशुद्धता के अलावा, इंजेक्शन स्थल पर न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता का एक सफल प्रयोग के लिए एक प्रमुख निर्धारक है और इंजेक्शन तकनीक पर निर्भर करता है। प्रस्तुत विकल्प, लंबी और पतली-पतली कांच इलेक्ट्रोड का उपयोग, दोनों सतही और गहरा मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए अच्छी तरह से इस उद्देश्य से कार्य करता है, लेकिन नुकसान यह है कि घटना बहुत लचीला है हो सकता है। एक वैकल्पिक microliter सीरिंज विशेष रूप में तंत्रिका विज्ञान (न्यूरो-एस stereotaxic वितरण के लिए विकसित का उपयोग करने के लिए हैyringes) और अधिक कठोर सुइयों कि छोटी मात्रा में वितरित कर सकते हैं के साथ। परिभाषित प्रकार की कोशिकाओं और क्षेत्रों को CHR-अभिव्यक्ति को निशाना बनाने की विशिष्टता के आगे, के रूप में प्रमस्तिष्कखंड intercalated कोशिकाओं के लिए सचित्र सशर्त अभिव्यक्ति 7 का उपयोग कर सुधार किया जा सकता Cre-प्रणाली के साथ उदाहरण के लिए। यह भी Cre पर निर्भर वायरल वैक्टर में मजबूत प्रमोटरों के उपयोग की अनुमति देता है।

एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू वायरल वेक्टर की पसंद है। Chr को व्यक्त करने के लिए, पुनः संयोजक एडिनो से जुड़े वायरस (rAAVs) का इस्तेमाल किया गया है, जो अन्य लोकप्रिय वायरल प्रणालियों की तुलना में एक जैव सुरक्षा स्तर की जा रही है 1 वैक्टर का फायदा है। rAAVs कुछ समय के लिए इस्तेमाल किया गया है और आम तौर पर अच्छा तंत्रिका tropism और कम या कोई immunogenic क्षमता के साथ सुरक्षित और विश्वसनीय वैक्टर रहे हैं, लेकिन उनकी पैकेजिंग की मात्रा सीमित है (लगभग। 4-5 केबी) 35। इन विशिष्ट प्रयोगों में, सीरमप्रकारों 2/9 और 2/1 क्रमश: सर्वव्यापी और सशर्त अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया गया। साहित्य के अनुसार,एसई सीरमप्रकारों लक्ष्य क्षेत्र में कोशिकाओं transduce, लेकिन, लेबल कोशिकाओं प्रतिगमनपूर्वक को एक्सोन द्वारा शुरू किए जाने वाले सीरमप्रकारों 2/5 और 2/6 36,37 के विपरीत नहीं दिखाई देते हैं। हालांकि, प्रारंभिक प्रयोगों इंजेक्शन साइट है, जो विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जब इस तरह के mPFC और प्रमस्तिष्कखंड के रूप में आपस में जुड़े हुए मस्तिष्क क्षेत्रों का अध्ययन करने के लिए पेश क्षेत्रों में Chr लेबल सेल निकायों देखते हैं कि बाहर कर देना चाहिए। हाल ही में कई अध्ययनों से चूहों और चूहों 36,38,39 में अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में rAAV सीरमप्रकारों की प्रभावकारिता की तुलना में। एक उभरती विषय है कि नए सीरमप्रकारों (जैसे, 2/1, 2/8 और 2/9) आम तौर पर मूल 2/2 सीरोटाइप की तुलना में अधिक कुशल हैं। ध्यान दें, Chr के rAAV की मध्यस्थता अभिव्यक्ति, अन्य तरीकों के विपरीत के अलावा, कोशिकाओं या लेबल एक्सोन 40 को व्यक्त करने पर हानिकारक प्रभाव का कारण नहीं था। आवश्यक अभिव्यक्ति समय प्रभावी फाइबर सक्रियण हासिल करने के लिए पूर्व vivo प्रक्षेपण अध्ययन की दूरी पर निर्भर होता है। यहाँ और लाइट के साथ सुसंगतrature, लेबलिंग और लंबी दूरी से कनेक्शन की सक्रियता के माउस में (mPFC और संवेदी आदानों), 4 की अभिव्यक्ति के लिए समय - 8 सप्ताह की जरूरत है, स्थानीय कनेक्टिविटी प्रमस्तिष्कखंड में 2 की, छोटे अभिव्यक्ति बार के अध्ययन के लिए, जबकि - 3 सप्ताह कर रहे हैं पर्याप्त 14-17,23,30,34।

लक्ष्य क्षेत्र में optogenetically-हासिल प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग के लिए, दो कारकों महत्वपूर्ण हैं: 1) तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा अच्छी गुणवत्ता और 2) व्यवहार्य लेबल फाइबर की पर्याप्त मात्रा में संरक्षित किए जाने की जरूरत की जरूरत है। स्लाइस की गुणवत्ता टुकड़ा करने की क्रिया के लिए नीलमणि ब्लेड का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है। एक्सोन के संरक्षण और इस प्रकार, आकार और स्थिरता प्रकाश प्रतिक्रियाओं का एक खास कोण पर स्लाइस काटने के रूप में mPFC-प्रमस्तिष्कखंड अनुमानों (चित्रा -1 और 2 ए) 16,34 के लिए सचित्र द्वारा सुधार किया जा सकता है। बहरहाल, यह दृढ़ता से लक्ष्य क्षेत्र में afferents के उन्मुखीकरण पर निर्भर करता है और प्रक्षेपण क्षेत्र और प्रादेशिक सेना के प्रत्येक संयोजन के लिए निर्धारित किया जाना पड़ेगाrget क्षेत्र। इस संबंध में, लक्ष्य क्षेत्र में अनुमानों के बाद अनौपचारिक विश्लेषण उपयोगी हो सकता है। फाइबर का पता लगाने और दरकिनार विरंजन कि टुकड़ा उत्तेजना के दौरान हुई हो सकती है, Chr संलयन प्रोटीन नियोजित किया जा सकता है पर फ्लोरोसेंट टैग के खिलाफ immunostaining बढ़ाने के लिए।

कुल मिलाकर, optogenetic सर्किट मानचित्रण की इस पद्धति का हाल ही में केवल मस्तिष्क में सर्किट, लेकिन कई अन्य प्रणालियों के डर करने के लिए लागू नहीं किया गया है। भविष्य में, आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों और सशर्त वायरल वैक्टर के एक बढ़ती हुई सरणी के संयोजन से subnuclei और विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को लक्षित विशिष्ट स्थानीय और लंबी दूरी सर्किट के कार्यात्मक synaptic गुणों की विविधता का एक और भी अधिक विस्तृत समझ प्रदान करेगा। इसके अलावा, जांच कार्यात्मक कनेक्शन में fluorescently टैग Chr के पद अस्थायी immunolabeling Ultrastructural विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है (यानी, इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म तरीकों का उपयोग कर) सटीक Mor में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिएपहले से ही सक्रिय synapses के phological गुण।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585 Filters can be bought as set F46-008
                     (emission) AHF, Germany F47-630 Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (emission) AHF, Germany F76-490 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

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References

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ब्रेन स्लाइस में डर सर्किट के <em>पूर्व vivo</em> optogenetic विच्छेदन
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Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I.… More

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

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