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Neuroscience

Ex Vivo optogénétiques Dissection de circuits Peur en tranches cérébrales

doi: 10.3791/53628 Published: April 5, 2016

Summary

approches optogénétiques sont largement utilisés pour manipuler l'activité neuronale et d'évaluer les conséquences pour le fonctionnement du cerveau. Ici, une technique est décrit que , lors de l' expression in vivo de l'activateur optique channelrhodopsin, permet une analyse ex vivo des propriétés synaptiques de longue portée spécifique et les connexions locales dans les circuits neuronaux liés à la peur.

Abstract

approches optogénétiques sont maintenant largement utilisées pour étudier la fonction des populations de neurones et les circuits en combinant l'expression ciblée des protéines activées par la lumière et la manipulation ultérieure de l'activité neuronale par la lumière. Channelrhodopsins (CHRS) sont de cations canaux de lumière-dépendants et quand fusionné à une protéine fluorescente permet leur expression pour la visualisation et l'activation simultanée de types cellulaires spécifiques et leurs projections axonales dans les zones définies du cerveau. Par injection stéréotaxique de vecteurs viraux, des protéines de fusion peuvent être constitutivement Chr ou sous certaines conditions exprimées dans des cellules spécifiques d'une région du cerveau définie, et leurs projections axonales peuvent ensuite être étudiées anatomiquement et fonctionnellement par l' intermédiaire de l' activation ex vivo optogenetic dans des tranches de cerveau. Ceci est d'une importance particulière lorsque l'on cherche à comprendre les propriétés synaptiques des connexions qui ne pouvaient pas être traitées avec des approches classiques de stimulation électrique, ou dans l'identification roman affele loyer et la connectivité efférente qui a déjà été mal comprise. Ici, quelques exemples illustrent comment cette technique peut être utilisée pour étudier ces questions à élucider les circuits liés à la peur dans l'amygdale. L'amygdale est une région clé pour l'acquisition et l'expression de la peur, et le stockage de la peur et de souvenirs émotionnels. De nombreuses preuves suggèrent que le cortex préfrontal médian (CPFm) participe à différents aspects de l'acquisition de la peur et de l'extinction, mais sa connectivité précise avec l'amygdale commence à peine à être compris. Tout d' abord, il est montré comment ex vivo activation optogenetic peut être utilisée pour étudier les aspects de la communication synaptique entre les afférences MPFC et les cellules cibles dans l'amygdale basolatérale (BLA). En outre, il est illustré comment cette approche ex vivo optogenetic peut être utilisé pour évaluer les nouveaux modèles de connectivité à l' aide d' un groupe de neurones GABAergiques dans l'amygdale, le pôle paracapsular intercalation de cellules (mpITC), à titre d'exemple.

Introduction

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des outils précis pour la visualisation et l'activation simultanée de connexions spécifiques entre les zones du cerveau et des types spécifiques de neurones sont de plus en plus important dans la compréhension des fonctions cérébrales et des maladies connectivité fonctionnelle états sains sous-jacents. Idéalement, cela implique une enquête physiologique des propriétés synaptiques précises avec lesquelles identifiés neurones communiquent. Cela est particulièrement vrai pour les connexions entre les zones du cerveau qui ne peuvent être conservés dans une seule tranche de cerveau aiguë. Dans le passé, cela a été réalisé en grande partie dans des expériences séparées. D'une part, les traceurs neuronaux injectés in vivo ont été employés combinée à la lumière ultérieure ou de l' analyse au microscope électronique des partenaires pré- et post - synaptiques. D'autre part, lorsque des faisceaux de fibres à partir de la région d'origine sont conservées et accessibles dans la préparation de tranches, la stimulation électrique a été utilisé pour évaluer les mécanismes de communication synaptiques avec des cellules dans la région cible,.

Avec l'avènement de l' optogénétique, l'expression ciblée de cations-canaux de lumière-gated, comme Channelrhodopsins (CHRS) fusionnée à des protéines fluorescentes, permet désormais l' activation des neurones et de leurs trajectoires axonales tout en permettant leur visualisation et l' analyse post-hoc anatomique 1- 4. Parce que les axones ChR exprimant peuvent être stimulés même quand il est coupé du parent somata 5, il est possible dans le cerveau des tranches à: 1) évaluer les contributions des régions du cerveau qui ne sont pas accessibles avec une stimulation électrique classique parce que des faisceaux de fibres ne sont pas séparables ou la trajectoire spécifique On ne sait pas; 2) d'identifier sans équivoque la région d'origine pour les entrées spécifiques qui ont été postulées mais incomplètement comprises; et 3) étudier la connectivité fonctionnelle entre les types cellulaires définis, à la fois localement et dans les projections à long terme. En raison d'un certain nombre d'avantages, cette cartographie optogenetic de circuits dans des tranches de cerveau est devenu largely utilisé dans les dernières années, et une variété de vecteurs viraux pour l'expression de CHRS fluorescence marqués sont facilement disponibles auprès de fournisseurs commerciaux. Quelques avantages clés d'activation optogenetic sur la stimulation électrique conventionnelle ne sont pas des dommages aux tissus en raison de placement des électrodes de stimulation, la spécificité de la stimulation de la fibre parce que la stimulation électrique peut également recruter des fibres de passage ou d'autres cellules voisines, et une stimulation aussi rapide et temporellement précis. En outre, l' injection stéréotaxique de vecteurs viraux peut facilement être ciblée sur des zones spécifiques du cerveau 6 et une expression spécifique conditionnelle ou de type cellulaire peuvent être réalisés en utilisant l' expression Cre dépendant et / ou des promoteurs spécifiques 7. Ici, cette technique est appliquée pour la cartographie de longue portée et de circuits locaux dans le système de la peur.

L'amygdale est une région clé pour l' acquisition et l' expression de la peur, et le stockage de la peur et de souvenirs émotionnels 8,9. Outre from l'amygdale, le cortex médial préfrontal (CPFm) et de l' hippocampe (HC), des structures qui sont réciproquement connectés à l'amygdale, sont impliqués dans les aspects de l' acquisition, la consolidation et la récupération de la peur et d' extinction des souvenirs 10,11. L' activité dans les subdivisions de la CPFm semble jouer un double rôle dans le contrôle de la peur à la fois haute et basse déclare 12,13. Cela pourrait être en partie médiée par des liaisons directes de CPFm à l'amygdale qui permettrait de contrôler l'activité de l'amygdale et de sortie. Par conséquent, au cours des dernières années, plusieurs études ont commencé en ex vivo des expériences de tranche pour étudier les interactions synaptiques entre afférences MPFC et les cellules cibles spécifiques dans l'amygdale 14-17.

Au cours de l'apprentissage de la peur, l'information sensorielle au sujet conditionné et inconditionné stimuli atteint l'amygdale via des projections des régions thalamiques et corticales spécifiques. Plasticité de ces entrées pour les neurones dans la partie latérale (LA) du BASOLamygdale ateral (BLA) est un mécanisme important qui sous - tend la peur conditionné 9,18. Des preuves croissantes suggèrent que les processus de plastique parallèles dans l'amygdale impliquent des éléments inhibiteurs pour contrôler la peur mémoire 19. Un groupe de neurones inhibiteurs en cluster sont les GABAergiques paracapsular intercalés cellules médiales (de mpITCs), mais leur connectivité et la fonction précise est incomplètement compris 20-22. Ici, la cartographie du circuit optogenetic est utilisé pour évaluer afférentes et efférentes la connectivité de ces cellules et leur impact sur ​​les neurones cibles dans l'amygdale, ce qui démontre que mpITCs reçoivent l' entrée sensorielle directe des stations de relais thalamiques et corticales 23. expression spécifique de ChR en mpITCs ou neurones BLA permet la cartographie des interactions locales, révélant que mpITCs inhibent, mais sont également mutuellement activé par, BLA principaux neurones, les plaçant dans des circuits inhibiteurs feed-forward et de rétroaction nouvelles qui contrôlent efficacement l'activité de BLA23.

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Protocol

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déclaration éthique: Toutes les procédures expérimentales étaient conformes à la directive européenne sur l'utilisation des animaux dans la recherche et ont été approuvés par le soin des animaux locaux et utilisation Comité (Regierungspräsidium Tübingen, état de Baden-Württemberg, Allemagne) responsable de l'Université de Tübingen.

1. Procédure d'injection stéréotaxique

  1. Préparer des outils stériles (ciseaux, scalpel, pinces, forage, aiguilles, matériel de suture) en utilisant un stérilisateur. Disposer des outils stériles et d' autres solutions nécessaires et les fournitures de chirurgie tels que les swaps stériles de coton, désinfectant, stérile tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4), et H 2 O 2 sur un champ opératoire stérile.
  2. Pull micropipettes de verre pour les injections (figure 1A, encart) en utilisant une largeur de 3 mm boîte filament sur ​​un microélectrodes horizontal extracteur selon les instructions du fabricant.
    Remarque: Pour les injections profondes, le cône de l'électrode doit être suffisammentlong pour atteindre les ventrales la plupart des coordonnées (environ 5 mm;. pour les coordonnées, voir 1.10).
  3. Premix 1 pl de solution de virus et 0,2 pi de solution vert rapide de 0,1% dans du PBS stérile (pour une meilleure visibilité de la solution dans la pipette en verre). Remplissez pipettes en verre avec un mélange de solution de virus et vert rapide à l' aide d' une pipette microlitre avec une pointe fine (figure 1A, encart).
    Remarque: Travailler avec des vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV) est considéré comme le niveau de biosécurité 1 (BSL 1) travail et doit être exécuté dans un BSL 1 laboratoire. rAAV utilisés dans cette étude (figure 1C) étaient les suivants : 1) CPFm: rAAV-Hsyn-ChR2 (H134R) -eYFP (sérotype 2/9) 16; 2) MGm / PIN: rAAV-CAGH-ChR2 (H134R) -mCherry (sérotype 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) YFP (sérotype 2/1) 23
  4. Anesthésier une souris à l'aide d'une petite machine d'anesthésie des animaux (isoflurane: 3% dans de l'oxygène pour l'induction).
    Remarque: Les souris utilisées dans cette étude étaient 4 -7 semaines et des souches suivantes et génotypes: C57BL6 / J de type sauvage (expérience sur les figures 2A et 3A-D); GAD67-GFP 24 (expérience dans les figures 2B et 3E-H); TAC2-Cre 25 (expérience dans les figures 2C et 3I-J).
  5. Raser la tête entre les oreilles et les yeux. Appliquer un désinfectant (providone-à base d'iode) à la tête rasée en utilisant des cotons-tiges.
  6. Appliquer une pommade oculaire pour éviter le dessèchement des yeux pendant l'anesthésie. Injecter par voie sous- cutanée à la souris avec analgésique (0,1 ml d'une solution de 5 mg à base de méloxicam-/ ml).
  7. Placer la souris dans le cadre stéréotaxique (figure 1A) et maintenir une anesthésie par l' intermédiaire d' un masque d'anesthésie au gaz (isoflurane: 2% dans de l' oxygène pour la maintenance). Contrôler la profondeur d'anesthésie en utilisant le retrait du membre réflexe avant de continuer.
    Remarque: Maintenir des conditions stériles aussi bien que possible pendant toute la procédure chirurgicale; porter un masque facial jetable, go chirurgicalewn, et des gants.
  8. Faire incision de la peau sur le dessus de la tête avec des ciseaux. Tirez doucement sur ​​la peau sur le côté en utilisant des pinces émoussées, fixer avec des pinces pour exposer la surface du crâne, et le crâne propre avec H 2 O 2.
  9. Sites d'injection Marquer sur le crâne à l' aide d' un marqueur fines et percer des trous permanents pointe pour les deux hémisphères (figure 1B). Coordonnées pour les injections dans cette étude sont (de bregma (mm)): CPFm: antérieure 1.9, latérale ± 0,3, 2,1 ventrale; MGm / PIN: 3.0 postérieure, latérale ± 1,8, 3,8 ventrale; mpITC / BLA: 1,45 postérieure, latérale ± 3,35, et 4,75 ventrale.
  10. Monter rempli pipette en verre sur le cadre stéréotaxique relié à un dispositif d'injection de pression et amener la pipette en position bregma.
  11. Casser la pointe de la pipette de verre en utilisant pince fine pointe droite. Pour ce faire, doucement pour éviter la production d'aérosols de solution de virus. Assurez-vous que la pointe de la pipette est ouverte en appliquant quelques impulsions de pression et en observant l'extrusion de gouttes de virus solution.
  12. Aller aux coordonnées d'injection désirées et injecter la moitié du contenu de la pipette (~ 0,5 pi) en utilisant les paramètres suivants sur le dispositif d'injection de pression: Pression: 20 psi, longueur d'impulsion moyenne: 30 ms, le nombre moyen d'impulsions: 50.
  13. Laissez pipette en place pour ~ 1 min avant de lentement (1 mm / min) rétracter.
    Remarque: Assurez-vous que la pipette ne soit pas bloqué avant de répéter la procédure avec la même pipette sur un autre hémisphère. En cas de pointe bloquée, propre ou rompre la pointe et la position zéro de la pipette à bregma à nouveau.
  14. Nettoyer le crâne avec du PBS (pH 7,4), retirer des pinces, tirez doucement la peau ensemble, et suturer l'incision avec bouton individuel suture (3 - 4 nœuds). Appliquer un désinfectant (providone-à base d'iode) autour de la plaie.
  15. Arrêtez l'anesthésie et ne pas laisser la souris sans surveillance jusqu'à ce qu'il soit complètement réveillé. Gardez seule loge ou retourner à la compagnie d'autres animaux que lorsqu'il est complètement récupéré. Après l'opération, continuer à surveiller l'état de santé, et administer analgésique si nécessaire. Suivez les procédures selon les règles formulées par le Comité des soins et l'utilisation des animaux local.

2. Préparation des tranches aiguës

  1. Préparer ACSF, solution de coupe, outils (ciseaux, scalpel, pince, spatule, pipette Pasteur), et des blocs de gélose.
    Note: 1 litre de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) est requise par l' expérience, et elle est préparée par dissolution de produits chimiques dans bidistillée H 2 O comme précédemment publiée 16,23. Solution de coupe est préparée en complétant 200 ml de ACSF avec 0,87 ml de M MgSO4 solution mère 2.
  2. ACSF et oxygéner la solution de découpe tout au long de l'expérience avec 95% O 2 et 5% de CO 2.
  3. Profondément anesthésier souris à l'aide d'une petite machine d'anesthésie de l'animal en utilisant l'isoflurane (3% en oxygène). Contrôler la profondeur d'anesthésie en utilisant le retrait du membre réflexe avant de continuer.
  4. Décapitez souris à l'aide de ciseaux et de grandes refroidir immédiatementla tête dans une solution de coupe glacée.
  5. Ouvrir le crâne par une seule incision médiane de caudale à rostre et pousser délicatement des morceaux de crâne sur les côtés à l'aide de forceps. retirer rapidement le cerveau en soulevant doucement hors du crâne à l'aide d'une petite spatule arrondie. Coupez le cervelet avec scalpel. Placez le cerveau dans une solution de coupe glacée.
  6. Pour les sites d'injection MPFC: couper une partie antérieure du cerveau (contenant CPFm) à l'aide d'un scalpel et mis en solution de coupe glacée jusqu'à ce que le tranchage.
  7. Retirer la solution de coupe excédent avec un papier filtre et coller la partie postérieure du cerveau sur la scène vibratome.
  8. Pour les tranches de amygdale inclinées, coller le cerveau sur un bloc de gélose (4%) coupé à un angle de 35 ° (figure 1D, milieu). Pour les tranches de amygdale coronales, sites d'injection MGm / PIN et des sites d'injection MPFC, coller directement le cerveau sur scène (figure 1D, à gauche et à droite). Placez un bloc de gélose supplémentaire derrière le cerveau pour la stabilité tout en tranchage.
  9. Placstade e dans la chambre de coupe avec une solution de coupe oxygénées glacée qui est maintenue à 4 ° C en utilisant une unité de refroidissement. Préparer des tranches aiguës de l'amygdale (320 pm) en utilisant une lame de saphir. Placer les tranches dans une chambre d'interface fourni avec ACSF oxygénée à la température ambiante.
  10. Après la préparation de tranches de amygdale aiguës, placer la chambre d'interface dans un bain-marie à 36 ° C pour récupérer des tranches pour les 35 - 45 min. Par la suite, le retour de la chambre d'interface à RT. Pour l'enregistrement de ces tranches, passez à l'étape 3.2.
  11. Pendant le début de l'étape 2.10, des tranches de sites d'injection coupé comme décrit précédemment pour les tranches de amygdale aiguës (étapes 02/08 à 02/09). Recouvrement des tranches dans le bain d'eau ne soit pas nécessaire ici. Facultatif: Pour estimer rapidement l'emplacement du site d'injection, observer les tranches sur un stéréoscope équipé d'une lampe fluorescente et des filtres appropriés.
  12. Fixer des tranches contenant des sites d'injection pour l'analyse post-hoc en les intercalant entre deux papiers filtres et submerles ging dans 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS solution O / N. Pour l'analyse des sites d'injection passez à l'étape 4.1.

3. Visualisation et stimulation des fibres présynaptiques

  1. Préparer Patch microscope pour l'activation optogenetic de fibres et de cellules:
    1. Centre de la diode montée électroluminescente (DEL) sur la voie de livraison lumière.
    2. Mesurer l'intensité de la lumière LED dans le plan focal arrière et à la sortie de chaque objectif avec un compteur de puissance en choisissant la longueur d'onde appropriée de 470 nm.
    3. Calculer l'intensité lumineuse en mW / mm 2 et de créer une courbe d'étalonnage (intensité LED (%) en fonction de la sortie de lumière (mW / mm 2)) pour chaque objectif pour les valeurs mesurées pour 470 nm de longueur d' onde.
  2. Récupérez une amygdale tranche aiguë de la chambre d'interface et dans la chambre de coupe monté sur le microscope droit équipé d'une lampe fluorescente. Prenez soin de positionner la tranche telle que la slicsurface e vers le haut dans la chambre d'interface est également orientée vers le haut dans la chambre d'enregistrement. Perfuser tranche avec des produits frais, FCSA oxygénée à un taux de 1 - 2 ml / min à une température de ~ 31 ° C.
  3. Observer les fibres présynaptiques dans la tranche à l'aide de la lampe fluorescente en combinaison avec des filtres appropriés pour la protéine fluorescente spécifique exprimée. Utilisez objectif 5x pour obtenir une vue d' ensemble (figure 1E) et 60x objective pour l' évaluation de la densité des fibres dans la zone cible.
    Remarque: Pour la GFP et YFP, l'utilisation du filtre réglé "vert" (Excitation 472/20, Beamsplitter 495, émission 490 LP) pour mCherry utiliser le filtre mis en "rouge" (Excitation 560/40, Beamsplitter 585, Emission 630/70) comme spécifié dans la table des matières / équipement.
  4. Ouvrir ou restreindre l'ouverture dans la voie optique du microscope comme on le souhaite pour l'expérience (figure 2D).
  5. Pour obtenir un enregistrement de patch, remplir une pipette de patch avec une solution interne et monte in support d'électrode. Appliquer une pression positive à la pipette de patch et lentement abaisser d'abord dans la solution de bain et sous contrôle visuel dans la tranche à l'aide du micromanipulateur.
    1. Approchez le neurone d'intérêt avec la pipette de patch sur le côté et le dessus. Relâcher la pression positive lorsque la pipette se trouve sur la surface de la cellule (fossette visible sur la surface cellulaire) et d'obtenir un "gigaseal" en appliquant une pression négative.
    2. Appliquer davantage aspiration à la rupture de la pièce de membrane pour obtenir l'enregistrement de cellules entières. Ensuite, à stimuler les fibres marquées avec la LED connectée en utilisant la longueur d'onde appropriée pour activer chr (470 nm) lors de l'enregistrement des réponses électriques provenant de la cellule.
    3. Pour la stimulation synaptique commencer avec une faible intensité LED et augmenter jusqu'à ce que l'amplitude synaptique courant désirée est atteinte. Déclencher la LED en configurant sorties numériques dans le logiciel d'acquisition de données pour contrôler la synchronisation et l' impulsion de longueur (exemples de la figure3).
      Remarque: les appareils d'autres logiciels et / ou TTL génératrices peuvent être utilisées pour déclencher LED.
  6. stimulation de répétition avec l'ouverture ouverte ou restreinte (étape 3.4) dans la voie optique du microscope que désiré pour la cellule suivante enregistrée et / ou en présence de médicaments spécifiques.
  7. Après l'enregistrement, fixer des tranches pour l'analyse post-hoc en les intercalant entre deux papiers filtres et les submergeant dans 4% PFA O / N.
  8. Analyser les données électrophysiologiques.
    Remarque: Utilisez un logiciel approprié pour visualiser les données de balayage enregistrées pour chaque mode hors connexion de stimulation individuelle. Lors de l'analyse des effets de la drogue, utiliser des routines de détection de pointe pour obtenir cours du temps de l'effet du médicament sur les amplitudes de courant synaptiques pour tous les balayages individuels. Déterminer le moment où l'effet du médicament atteint l'état d'équilibre. Pour préparer les réponses moyennes représentatives pour les chiffres, utiliser un logiciel pour la moyenne ≥10 balayages individuels par condition expérimentale (cf Figure 3B-D, FH, J panneau de droite).
    Remarque: plusieurs logiciels alternatifs peuvent être utilisés pour l'analyse des données.

4. Post-hoc Analyse des sites d'injection

  1. Laver des tranches de sites d'injection (étape 2.12) et les sites d'enregistrement (si ré-imagerie est souhaitée, à l'étape 3.7), trois fois dans du PBS. Ceci est réalisé en remplaçant à plusieurs reprises avec la solution PBS frais sur un agitateur rotatif à trois reprises pendant 10 min.
  2. Préparer la solution d'agar-agar 2% dans du PBS, et laissez-le refroidir à ~ 65 ° C. Placer les tranches à plat sur le fond d'un petit 30 mm de diamètre plat de Pétri, incorporer des tranches dans l'agar-agar et laissez-le refroidir jusqu'à ce que solide.
  3. Coller un bloc de gélose avec une tranche ou des tranches intégré à la scène d'un vibratome et placer étape dans la chambre de coupe avec du PBS.
  4. Relèvement des tranches à 70 um d'épaisseur intégré. Facultatif: Après résection, les tranches peuvent être colorées, à savoir, avec Neurotrace pour révéler cytoarchitecture (figure 3A, C), et / ou by coloration par immunofluorescence pour YFP ou mCherry pour booster le signal de la protéine de fusion ChR.
  5. tranches de montage sur des lames et lamelle avec un milieu de montage. Les sites d'injection de l' image et, si on le souhaite, également des tranches d'image contenant des fibres dans les zones de projection en utilisant un microscope à fluorescence ou un microscope confocal à balayage laser microscope (Figure 2A-C).

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Representative Results

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Cette section présente le flux de travail d'une approche optogenetic ex vivo et des résultats représentatifs de différentes stratégies expérimentales pour étudier les propriétés physiologiques des projections sensorielles et modulateurs de longue portée à BLA et les neurones mpITC ainsi que les propriétés de connectivité locale entre mpITC et BLA.

Après l' injection stéréotactique du vecteur viral sélectionné aux coordonnées désirées dans le cerveau de souris (figure 1A-C, le temps de l' expression virale 2 - 6 semaines, en fonction de l' expérience), des tranches de cerveau aiguës des sites d'injection et des zones de projection dans l'amygdale sont préparés à l'angle approprié pour les expériences de patch-clamp et de la région du cerveau injecté pour l' analyse post-hoc de sites d'injection (Figure 1D). Avant de commencer les enregistrements et la stimulation optogenetic, les cellules marquées par fluorescence ou pro axonalejections dans la zone cible (amygdale) doivent être vérifiés sur le microscope droit pour les enregistrements de patch-clamp en utilisant la lampe fluorescente attachée (figure 1E). Lors de l'obtention d'un enregistrement à partir d'une cellule putative cible dans la région de projection de la tranche de patch-clamp, la stimulation lumineuse est lancée alors que le point de temps, intervalle, et la durée d'impulsion sont contrôlés via le logiciel de patch qui déclenche la diode électroluminescente (LED). En fonction de la stratégie expérimentale (figure 2A-C, à droite) l'ouverture dans le trajet de la lumière fluorescente est soit complètement ouverte ou restreinte (figure 2D). Tout en maintenant la durée d'impulsion constante et aussi court que possible (idéalement ≤1 msec), l' intensité de sortie de LED est lentement augmentée pour évaluer l' intensité qui est nécessaire pour atteindre l'amplitude souhaitée de la réponse synaptique dans une expérience particulière (figure 2E). Après l'enregistrement, les tranches de l'amygdale sont post-fixe. Après résection et facultatifcoloration, injection et d'enregistrement des sites sont imagés sur un microscope confocal pour vérifier l'emplacement d'injection et d'exclure les données des injections mal placées. Images de sites d'injection et les projections axonales associés dans l'amygdale pour les trois stratégies expérimentales (entrées MPFC à BLA, entrées thalamiques à mpITCs et activation de mpITC locale) sont présentés dans la figure 2A-C.

La figure 3 montre des résultats représentatifs d'enregistrement obtenus à partir de neurones principaux BLA, BLA interneurones locaux et les neurones mpITC illustrant les propriétés des réponses luminescentes évoquée pour les différentes stratégies expérimentales utilisées (figure 3A, E, I). Pour cibler les neurones GABAergiques (interneurones locaux et mpITCs) pour l' enregistrement, les souris rapporteurs GAD67-GFP ont été utilisés 24. Pour CPFm et projections thalamiques sensorielles, plusieurs aspects de la transmission synaptique peuvent être étudiés. La précision temporelle de l'activation et les propriétés cinétiques du RRPC utilisés dans cette étude permettent une stimulation fiable avec des impulsions appariées à un inter-stimulus-intervalle de 50 msec. Cela permet l' analyse des ratios appariées impulsions (PPR) des courants postsynaptiques (CSP), qui peuvent être soit faciliter ou déprimant en fonction de projection et le type de cellule cible, et servir d'indicateurs de présynaptique probabilité de libération (figure 3B, F, H) . En outre, l'analyse des latences synaptiques permet la dissection des différents éléments de réponse post-synaptiques.

Dans cet exemple, des latences plus longues de la CFP inhibitrice (IPSC) par rapport à la CFP excitateur (RPEC) composant indiquent une entrée disynaptique et monosynaptique, respectivement (figure 3C). Dans d'autres cas, une analyse plus approfondie des propriétés RPEC supplémentaires telles que la gigue de réponse ou le coefficient de variation de la taille de la réponse peut être nécessaire pour tirer des conclusions sur son mono- ou disynanature CITP 17,23. En outre, l' application des inhibiteurs pharmacologiques pour des récepteurs spécifiques peut identifier la nature des CSP (c. -à- glutamatergique RPEC et GABAergique IPSC, figure 3C-D). Comme prévu, la composante précoce de l'entrée CPFm était glutamatergique, alors que la fin du composant est GABAergique. Le bloc complet des deux RPEC et IPSC avec le glutamate bloqueur des récepteurs CNQX soutient en outre que l'IPSC est disynaptique. Pour étudier la modulation de la transmission synaptique à fibres optogenetically activées, les effets des agonistes et des antagonistes des récepteurs métabotropiques (ici récepteurs GABA B) sur l' amplitude et PPR peuvent être évalués afin d' évaluer les influences sur les sites pré et post - synaptiques. Dans cet exemple, la diminution concomitante de l' amplitude avec une augmentation de PPR est indicative d'une modulation présynaptique de fibres activées par la lumière (3G, H). Enfin, les interactions locales des cellules dans l'amygdale peuvent être évaluées, par exemple,lorsque des souris qui expriment Cre sous le contrôle du promoteur TAC2 25 sont injectés avec un ChR vecteur exprimant double floxée virale (figure 1C). Parce TAC2 et donc, ChR est exprimée en mpITC et l' amygdale centrale (figure 2C), activation de la lumière a été limitée à la mpITC en fermant l'ouverture du chemin de lumière fluorescente (figure 2D). Dans ces conditions, les potentiels d'action évoqués par la lumière peut être obtenue chez mpITCs infectés. réponses latence inhibiteurs synaptiques courtes dans le BLA indiquent la présence d'une connexion inhibitrice fonctionnelle entre mpITC et BLA neurones principaux.

Figure 1
Figure 1. stéréotaxiques Injections, Préparation des tranches aiguë du cerveau, et la visualisation des fibres présynaptiques. (A, B) injection de virus stéréotaxique. A) Image de souris anesthésiée placés dans un cadre stéréotaxique avec le crâne exposé etla pipette d'injection. Encart: Zoom dans l'image de la pipette d'injection rempli de solution de virus mélangé avec le vert rapide. Barre d'échelle: 3 mm. (B) Schéma d'un crâne de la souris avec des positions marquées de trous de forage pour les différentes zones d'injection. (C) Schéma montrant les différentes constructions virales utilisées dans cette étude. gris foncé: séquence de promoteur; bleu: Channelrhodopsin2 (ChR2 (H134R)); vert / rouge: protéine fluorescente. Temps d'expression était de 2 semaines pour les projections amygdale locales et 4 - 6 semaines pour les projections de CPFm et MGm / PIN. (D) Préparation des tranches de cerveau aiguës: Schéma montrant le placement du cerveau de la souris sur la scène de trancheuse pour obtenir des tranches de différentes zones d'injection et de projection. (E) Visualisation des fibres dans des tranches de cerveau aiguës d'une souris GAD67-GFP injecté avec le virus ChR2-mCherry dans MGm / PIN. Les photos sont prises sur le microscope patch debout avec différents jeux de filtres: expression GAD67-GFP, au milieu; fibres MGm / PIN marqué avec mCherry, à droite. Barre d'échelle: 200 um. CPFm, cortex préfrontal médian; mpITC, les cellules intercalées de paracapsular médian; BLA, amygdale basolatérale; MGm, médial noyau géniculé, partie médiane; PIN, postérieure intralaminaire noyau thalamique; LA, amygdale latérale; BA, amygdale basale; ACÉ, le noyau central de l'amygdale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Sites d'injection, les zones de projection, et optogénétiques Stimulation des projections axonales. (AC) images confocale de sites d'injection représentatifs et les zones de projection dans la BLA, et des schémas des stratégies expérimentales. (A) Gauche: CPFm site d'injection dans une souris C57BL / 6 colorées avec Neurotrace. Barre d'échelle:500 um. Moyen: projections dans le BLA correspondant dans une amygdale tranche inclinée. Barre d'échelle: 200 um. A droite: Schéma d'éclairage ensemble du champ des projections MPFC et l'enregistrement des neurones dans la BLA. (B) Gauche: MGm / PIN site d'injection dans une souris GAD67-GFP. Barre d'échelle: 500 um. Moyen: projections correspondantes dans mpITC et LA d'une amygdale coupe coronale. Barre d'échelle: 200 um. A droite: Schéma d'éclairage ensemble du champ des projections MGm / PIN et l'enregistrement d'un neurone mpITC. (C) Gauche: expression locale de ChR2-YFP dans un Neurotrace tachée amygdale tranche d'une souris TAC2-Cre. Barre d'échelle: 200 um. Encart: Zoom de mpITCs exprimant CHR2-YFP. Barre d'échelle: 20 um. A droite: Schéma d'éclairage restreint du cluster mpITC et l'enregistrement d'un neurone BLA. (D) Les photos de chambre d' enregistrement lors de la livraison de lumière et de l' image des neurones dans des tranches de cerveau aiguës (groupe mpITC) chez une souris GAD67-GFP avec aper ouverts et restreintsture. Barre d'échelle: 30 um. (E) courants postsynaptiques excitateurs (de EPSCs) évoqués par différentes intensités de LED (en haut) et parcelle de puissance lumineuse par rapport évoqué RPEC amplitude (bas) à partir d' un neurone mpITC représentant lors de l' activation optogenetic de fibres de MGm / PIN. Barre d'échelle: 100 pA / 10 msec.
Remarque:. La figure 2A est modifiée de la référence n ° 16 et la figure 2C de la référence n ° 23 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Des exemples Les résultats de optogénétiques Activation de Long Range et projections locales. (A) Schéma de la stratégie expérimentale pour (BD). (B) EPSCs représentatifs enregistrés à partir d' un neurone principale BLA etBLA interneuron lors de la stimulation de optogenetic appariées impulsion (50 msec inter-stimulus-intervalle) de fibres de CPFm provoquant jumelé la facilitation du pouls et la dépression d'impulsion couplé, respectivement. Barre d'échelle: 100 pA / 25 msec. (C) activation optogénétiques de fibres de CPFm provoque l' inhibition de feed-forward. Gauche: Représentant RPEC (à -70 mV) et le courant post-synaptique inhibitrice (IPSC, à 0 mV) dans un principal neurone BLA. L'IPSC a une latence synaptique plus par rapport à la RPEC. Barres d'échelle: 200 pA / 10 msec et 200 pA / 2 msec. Droit: Lumière évoqué RPEC séquence biphasique / CISP (à -50 mV) est bloqué par l'antagoniste AMPA / kainate CNQX (10 um), en soutenant davantage la nature disynaptique de l'IPSC. Barre d'échelle: 50 pA / 5 msec. (D) Effets de la séquence suivante de RPEC séquence / CISP (à -50 mV) par le canal Cl - bloquant picrotoxine (PTX, 100 uM) et PTX + CNQX. L'IPSC est bloqué par PTX et le reste RPEC par CNQX. Barres d'échelle: 50 pA / 5 msec. (E) Schéma de la stratégie expérimentale pour (FH). F) EPSCs représentatifs enregistrées à partir d'un mpITC et un principal neurone BLA sur optogenetic stimulation double impulsion de fibres de MGm / PIN. Barre d'échelle: 50 pA / 20 msec. (G) EPSCs dans un autre neurone mpITC sont bloqués par le bloqueur des canaux sodiques tétrodotoxine (TTX, 0,5 uM), ce qui indique qu'elles dépendent de l' activité de canal de sodium. Barre d'échelle: 50 pA / 20 msec. (H) entrées thalamiques à neurones mpITC sont modulés par les récepteurs présynaptiques GABA B. EPSCs sous condition de contrôle, la réduction de RPEC amplitude et une augmentation concomitante du taux d'impulsion couplé pendant l' application du GABA B agoniste baclofène (2 uM), et la récupération de l'amplitude et initiale ration d'impulsions appariées lors de la co-application du GABA B antagoniste CGP55845 (10 pM). Ces modifications sont indicatives d'une modulation présynaptique par les récepteurs GABAB. Barre d'échelle: 50 pA / 20 msec. (I) Schéma de la stratégie expérimentale pour (J). (J) Light-évoqué des potentiels d'action enregistrés à partir d' un ChR2-YFP exprimant mpITC neurone. CISP lumière évoqués enregistrés à partir d' un principal neurone BLA à des potentiels différents de maintien (-90, -70, -50, -20 et 0 mV) inverse autour du potentiel d'équilibre calculé pour Cl -. Barres d'échelle: 20 mV / 100 msec et 10 pA / 10 msec. Remarque:. Figure 3B-D est modifié à partir de référence n ° 16, et la figure 3H et J de la référence # 23 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Ce protocole décrit une méthode ex vivo enquête optogenetic des circuits neuronaux et la connectivité locale qui peuvent être facilement mises en œuvre sur la plupart, sinon tous, debout tranche enregistrement patch-clamp configurations en les dotant d'une ~ 470 LED au port de lumière épifluorescence nm. Un avantage majeur de la stimulation optogenetic des projections axonales en tranches est qu'il permet l'activation et l'investigation des propriétés des connexions qui ne sont pas accessibles avec une stimulation électrique classique spécifique, parce que les faisceaux de fibres correspondantes ne sont pas connus, pas clairement définis, ou non conservés dans une seule tranche de cerveau. Comme un exemple clé pertinent pour les circuits de la peur, il est illustré comment cela peut être appliqué pour disséquer les propriétés des entrées MPFC à l'amygdale.

Même dans les cas où la stimulation des voies de fibre électrique a été largement utilisés dans les études antérieures, ces contrats portent souvent des fibres de différentes régions d'origine. Par exemple, dans les circuits associés à craindre l'apprentissage, les projections de différents sensitif noyaux thalamiques ou les régions corticales courent entremêlées à travers les capsules internes et externes, respectivement. L'avantage d'une stimulation optogenetic est qu'elle permet l'activation sélective d'un sous-ensemble de fibres à partir d'une région définie. Ceci est illustré pour les entrées thalamiques spécifiques du code PIN et MGm aux cellules intercalées et les cellules principales de l'amygdale latérale. En outre, les problèmes posés par stimulation électrique, à savoir l' activation d'autres fibres de passage ou des cellules au voisinage de l'électrode de stimulation qui peuvent établir des connexions locales dans la zone cible peuvent être surmontés. Cependant, alors que la stimulation optogenetic est tout aussi rapide que la stimulation électrique, il peut y avoir des limitations en ce qui concerne la fréquence de stimulation qui peut être appliquée de façon fiable. Cela dépend de la cinétique d' inactivation et deinactivation et de la variante de chr qui est utilisé, 4 ainsi que expression niveaux et méthodes, et les méthodes de stimulation de lumière 26.

Lors de l'utilisation d'une LED montée sur le port de fluorescence pour la stimulation lumineuse, typiquement tout le champ de vue d'un objectif donné est éclairé, ce qui entraîne l'activation de toutes les fibres ou les cellules dans le champ et dans une certaine profondeur. Ceci peut être que partiellement limité à une petite région ou un ensemble de cellules marquées (dans cet exemple, le mpITC) à l' aide d' une ouverture dans le trajet de la lumière fluorescente 23,27. Avec les LED, la puissance lumineuse est pas un problème, car les LED bleues de haute puissance sont désormais disponibles auprès de nombreux fabricants. Cependant, les spectres d'émission ont des valeurs pleine largeur à mi-hauteur de plusieurs dizaines de nanomètres. Par conséquent, les LED présentent des limitations lorsque l'une stimulation spatialement précise pour la cartographie subcellulaire de connectivité et / ou la stimulation monochromatique sont souhaitées. Les deux peuvent être améliorées en utilisant des lasers bleus comme sources de lumière, généralement en combinaison avec des configurations plus complexes qui permettent de goudrongeting et / ou balayage du faisceau dans de petites zones et profondeurs de tissu définies (par exemple, voir 28).

Avec l'approche ex vivo optogenetic décrit ici, plusieurs propriétés de la transmission synaptique peuvent être étudiés. Pour évaluer monosynapticity de la composante précoce synaptique de réponse, une analyse approfondie des latences et de leur instabilité, ainsi que la réponse amplitude variance doit être utilisée sur un échantillon représentatif des neurones enregistrés (par exemple, voir 16,17,23). Dans les cas où l' activation de l' activité du réseau peut jouer un rôle, la méthode de choix est d'isoler la composante monosynaptique directe en appliquant une combinaison de tétrodotoxine (TTX) pour bloquer les potentiels d'action en combinaison avec le canal K + bloqueur 4-aminopyridine (4- AP) pour empêcher la repolarisation 14,28,29. Les récepteurs de médiation des composants mono- et disynaptique des entrées peuvent être identifiés en utilisant les inhibiteurs pharmacologiques. AILLEURSe, il est possible d'étudier les aspects de la modulation présynaptique des entrées optogenetically activées dans l'amygdale 23,30. Une mise en garde que le potentiel est de 1,4 CHR2 a une certaine perméabilité de calcium et son activation dans les fibres et les terminaux présynaptiques a été proposé de modifier la libération probabilité par divers mécanismes 26,31. Néanmoins, plusieurs études , y compris des exemples illustrés expression ChR2 ici employée avec succès pour identifier et cibler les différences entrées - spécifiques des cellules dans des rapports appariées impulsions dans l'amygdale et d' autres zones du cerveau 16,23,26,32 et modulation de plus , démontré de probabilité de libération par l' activation des voies de signalisation spécifiques dans les terminaux présynaptiques qui n'a pas été exclues par ChR activation 23,30. Un soutien supplémentaire provient des données dans l'hippocampe et le cervelet, montrant que la méthode d'expression de ChR appropriée et technique de stimulation lumineuse, aspects physiologiques, y compris l'efficacité de la libération et de la fidélité ola transmission synaptique f peut être étudiée de manière fiable 26. Enfin, l' activation de la fibre optogenetic a également été utilisé avec succès pour appliquer des protocoles de stimulation qui provoquent la plasticité synaptique 31,33,34.

Plusieurs aspects sont essentiels pour le succès de cette méthode. La première est la précision de ciblage stéréotactique des vecteurs viraux. Par conséquent, il est utile d'évaluer rapidement l'emplacement du site d'injection avant d'obtenir les enregistrements, puis effectuer une analyse post-hoc plus détaillée. En plus de la précision spatiale, la viabilité des neurones au niveau du site d'injection est un facteur déterminant pour une expérience réussie et dépend de la technique d'injection. L'option présentée, en utilisant des électrodes de verre longues et minces conique, sert à cette fin ainsi à la fois superficielles et profondes zones du cerveau, mais elle peut présenter l'inconvénient que le cône est très flexible. Une alternative consiste à utiliser des seringues microlitres spécialement conçus pour la livraison stéréotaxique en neuroscience (neuro-syringes) avec des aiguilles plus rigides qui peuvent dispenser de petits volumes. La spécificité du ciblage chr-expression à des types cellulaires et des régions définies peut encore être améliorée en utilisant une expression conditionnelle 7, par exemple avec le système Cre comme cela est illustré pour les cellules amygdale intercalés. Ceci permet également l'utilisation de promoteurs forts dans des vecteurs viraux Cre-dépendants.

Un autre aspect important est le choix du vecteur viral. Pour exprimer ChR, des virus recombinants adéno-associés (rAAV) ont été utilisés, qui ont l'avantage d'être un niveau de biosécurité 1 vecteurs par rapport à d'autres systèmes viraux populaires. rAAV ont été utilisés pendant un certain temps et sont généralement des vecteurs sûrs et fiables avec un bon tropisme nerveux et peu ou pas de potentiel immunogène, mais leur volume d'emballage est limité (env. 4-5 kb) 35. Dans ces expériences spécifiques, sérotypes 2/9 et 2/1 ont été utilisés pour l'expression ubiquitaire et conditionnelle, respectivement. Conformément à la littérature,sérotypes soi transduire des cellules dans la région cible, mais ne semblent pas être absorbé par voie rétrograde axonale des cellules de l' étiquette, à la différence sérotypes 2/5 et 2/6 36,37. Cependant, des expériences initiales ne devraient pas comprendre qu'il y a des corps cellulaires ChR marqués dans les zones en saillie vers le site d'injection, ce qui est particulièrement important lors de l'étude des régions cérébrales telles que réciproquement reliés CPFm et l'amygdale. Plusieurs études récentes ont comparé l' efficacité de sérotypes rAAV dans différentes zones du cerveau chez les rats et les souris 36,38,39. Un thème émergent est que les sérotypes les plus récents (par exemple, 2/1, 2/8 et 2/9) sont généralement plus efficaces que le 2/2 sérotype d' origine. A noter également, l' expression rAAV-médiée de ChR, contrairement à d' autres méthodes, ne pas causer des effets néfastes sur les cellules exprimant ou axones marqués 40. Le temps de l' expression est requis pour obtenir une activation efficace des fibres ex vivo semble dépendre de la distance de la saillie étudiée. Ici et compatible avec litepérature, pour l'étiquetage et l'activation des connexions à longue portée chez la souris (CPFm et entrées sensorielles), un temps d'expression de 4 - 8 semaines est nécessaire, alors que pour l'étude de la connectivité locale dans l'amygdale, la réduction des temps d'expression de 2 - 3 semaines sont suffisante 14-17,23,30,34.

Pour l'enregistrement des réponses optogenetically-induites dans la zone cible, deux facteurs sont essentiels: 1) la tranche de cerveau aiguë doit être de bonne qualité et 2) une quantité importante de fibres marquées viables doit être préservé. La qualité des tranches peut être améliorée en utilisant des lames de saphir pour trancher. La préservation des axones et donc, la taille et la stabilité des réponses claires peuvent être améliorées en coupant des tranches à un certain angle , comme illustré pour les projections CPFm-amygdale (figure 1D et 2A) 16,34. Toutefois, cela dépend fortement de l'orientation des fibres afférentes dans la région cible, et devra être déterminée pour chaque combinaison de la zone de projection et target région. À cet égard, l'analyse post-hoc de projections dans la région cible peut être utile. Pour améliorer la détection de la fibre et le blanchiment circumvent qui peuvent avoir eu lieu lors de la stimulation de la tranche, immunocoloration contre le marqueur fluorescent sur la protéine de fusion ChR peut être employé.

Dans l'ensemble, cette méthode de cartographie circuit optogenetic a récemment non seulement été appliquée à craindre des circuits, mais beaucoup d'autres systèmes dans le cerveau. Dans l'avenir, le ciblage des sous-noyaux et des types cellulaires spécifiques en combinant un nombre croissant de lignées de souris génétiquement modifiées et des vecteurs viraux conditionnels fournira une compréhension encore plus détaillée de la diversité des propriétés synaptiques fonctionnelles des circuits spécifiques locaux et de longue portée. En outre, immunomarquage post-hoc de ChR fluorescence marquée dans les connexions fonctionnelles étudiées pourrait être combinée avec l' analyse ultrastructurale (ie, en utilisant des méthodes électroniques microscopiques) pour donner un aperçu de mor précisepropriétés morphologiques des synapses précédemment activés.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585 Filters can be bought as set F46-008
                     (emission) AHF, Germany F47-630 Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (emission) AHF, Germany F76-490 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

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References

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<em>Ex Vivo</em> optogénétiques Dissection de circuits Peur en tranches cérébrales
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Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).More

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

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