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Neuroscience

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

doi: 10.3791/53628 Published: April 5, 2016

Summary

Optogenetische Ansätze sind weit verbreitet zu manipulieren neuronale Aktivität und bewerten die Auswirkungen auf die Gehirnfunktion verwendet. Hier wird eine Technik erläutert , dass bei in - vivo - Expression des optischen Aktivator Channelrhodopsin, ermöglicht eine ex vivo Analyse der synaptischen Eigenschaften bestimmter großer Reichweite und lokale neuronale Verbindungen in Angst bezogenen Schaltungen.

Abstract

Optogenetische Ansätze sind heute weit verbreitet durch die Kombination gezielte Expression von lichtaktivierten Proteine ​​und die anschließende Manipulation der neuronalen Aktivität die Funktion neuronaler Populationen und Schaltungen, die durch Licht zu studieren verwendet. Channelrhodopsinen (CHRS) sind lichtgesteuerter Kationenkanäle, und wenn ihre Expression ermöglicht die Visualisierung und gleichzeitige Aktivierung spezifischer Zelltypen und deren axonale Projektionen in definierten Bereichen des Gehirns zu einem fluoreszierenden Protein fusioniert ist. Via stereotaktische Injektion von viralen Vektoren, ChR Fusionsproteine ​​konstitutiv werden können oder bedingt in spezifischen Zellen eines bestimmten Gehirnregion zum Ausdruck gebracht, und ihre axonalen Projektionen können anschließend anatomisch und funktionell mit Hilfe von Ex - vivo - optogenetische Aktivierung in Hirnschnitten untersucht werden. Dies ist von besonderer Bedeutung während des Zielens synaptischen Eigenschaften der Verbindungen zu verstehen, die nicht mit herkömmlichen elektrischen Stimulations Ansätzen angegangen werden können, oder bei der Identifizierung von neuen AffeMiete und ableitende Konnektivität, die bisher kaum verstanden wurde. Hier einige Beispiele veranschaulichen, wie diese Technik angewendet werden kann, um diese Fragen zu Aufklären Angst bezogenen Schaltungen in der Amygdala zu untersuchen. Die Amygdala ist eine Schlüsselregion für den Erwerb und die Expression von Angst und Speicherung von Angst und emotionale Erinnerungen. Viele Beweislinien legen nahe, dass die medialen präfrontalen Kortex (mPFC) in verschiedenen Aspekten der Angst Erfassung beteiligt und Extinktion, aber seine genaue Konnektivität mit der Amygdala beginnt gerade zu verstehen. Zuerst wird gezeigt , wie ex vivo optogenetische Aktivierung verwendet werden können Aspekte der synaptischen Verbindung zwischen mPFC Afferenzen und Zielzellen in der basolateralen Amygdala (BLA) zu studieren. Ferner ist dargestellt , wie diese ex vivo optogenetische Vorgehensweise angewendet werden kann , um neue Konnektivitätsmuster unter Verwendung einer Gruppe von GABA - ergen Neuronen in der Amygdala, dem paracapsular interkalierten Zellcluster (mpITC) als Beispiel zu bewerten.

Introduction

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Präzise Werkzeuge zur Visualisierung und gleichzeitige Aktivierung von spezifischen Verbindungen zwischen den Gehirnbereichen und bestimmten Arten von Neuronen werden immer wichtiger, um die funktionelle Konnektivität zugrunde liegende gesunde Gehirnfunktion und Krankheitszuständen zu verstehen. Idealerweise führt diese physiologische Untersuchung der genauen synaptischen Eigenschaften, mit denen identifiziert Neuronen kommunizieren. Dies gilt insbesondere für Verbindungen zwischen Gehirnbereichen, die nicht in einer einzigen akuten Hirnschnitt erhalten werden kann. In der Vergangenheit wurde dies in getrennten Experimenten weitgehend erreicht. Zum einen injizierten neuronalen Tracern in vivo wurden mit anschließender licht- oder elektronenmikroskopische Analyse der prä- und postsynaptischen Partnern kombiniert eingesetzt. Auf der anderen Seite, wenn Faserbahnen aus der Herkunftsregion erhalten sind und zugänglich im Schnittpräparat wurde eine elektrische Stimulation verwendet synaptischen Kommunikationsmechanismen mit Zellen in der Zielregion zu beurteilen.

Mit dem Aufkommen von Optogenetik, die gezielte Expression von lichtgesteuerten Kationenkanäle wie Channelrhodopsine (CHRS) an fluoreszierenden Proteinen fusioniert, ermöglicht nun die Aktivierung von Neuronen und ihrer axonalen Trajektorien während es für ihre Visualisierung und post-hoc - Analyse anatomischer 1- 4. Weil chr-exprimierenden Axone sogar stimuliert werden kann , wenn von den Eltern somata 5 durchtrennt, ist es möglich , in brain slices: 1) Eingänge von Hirnregionen beurteilen , die nicht zugänglich zu herkömmlichen elektrischen Stimulation waren, weil Faserbahnen nicht trennbar oder der spezifische Trajektorie ist nicht bekannt; 2) eindeutig die Herkunftsregion für bestimmte Eingaben zu identifizieren, die postuliert, wurden aber nicht vollständig verstanden; und 3) untersuchen die funktionelle Konnektivität zwischen definierten Zelltypen, sowohl lokal als auch in langfristigen Projektionen. Wegen einer Reihe von Vorteilen, diese optogenetische Abbildung von Schaltkreisen in Hirnschnitten geworden breitenly verwendet in den letzten Jahren, und eine Vielzahl von viralen Vektoren für die Expression von fluoreszenzmarkierten CHRS von kommerziellen Anbietern leicht erhältlich. Einige der wichtigsten Vorteile von optogenetische Aktivierung über herkömmliche elektrische Stimulation sind keine Schädigung des Gewebes durch die Platzierung der Stimulationselektroden, eine Spezifität von Faser Stimulation, weil die elektrische Stimulation auch Fasern der Passage oder anderen nahe gelegenen Zellen rekrutieren können, und eine ebenso schnelle und zeitlich präzise Stimulation. Zusätzlich können stereotaktische Injektion von viralen Vektoren können leicht an spezifischen Gehirnbereichen 6 und bedingte oder zelltypspezifische Expression 7 unter Verwendung von Cre-abhängige Expression und / oder spezifischer Promotoren erreicht werden , ausgerichtet sein. Hier wird diese Technik zur Kartierung von Langstrecken und lokale Schaltungen in der Angst-System angewendet.

Die Amygdala ist eine Schlüsselregion für den Erwerb und die Expression von Angst und Speicherung von Angst und emotionale Erinnerungen 8,9. Neben from die Amygdala, dem medialen präfrontalen Kortex (mPFC) und Hippocampus (HC), Strukturen, die auf der Amygdala reziprok verbunden sind, werden in Aspekten der Erfassung, Konsolidierung und den Abruf von Angst und Extinktion Erinnerungen 10,11 gebracht. Aktivität in Unterteilungen des mPFC erscheint bei der Kontrolle der hohen und niedrigen Angst heißt 12,13 eine doppelte Rolle zu spielen. Dies könnte teilweise durch direkte Verbindungen von mPFC zur Amygdala vermittelt werden, die Amygdala-Aktivität steuern würde und ausgegeben. Daher ist in den letzten Jahren begannen mehrere Studien in ex vivo Scheibe Experimente synaptische Interaktionen zwischen mPFC Afferenzen und spezifischen Zielzellen in der Amygdala 14-17 zu untersuchen.

Während Angst Lernen erreicht sensorische Informationen über bedingten und unbedingten Stimuli die Amygdala über Projektionen von spezifischen Thalamus und kortikale Regionen. Plasticity dieser Eingänge der Neuronen in dem Seitenteil (LA) des Basolateral Amygdala (BLA) ist ein wichtiger Mechanismus Angstkonditionierung 9,18 zugrunde liegen. Zunehmende Hinweise darauf , dass parallel Kunststoff Prozesse in der Amygdala hemmenden Elemente beinhalten Angst Speicher zur Steuerung 19. Eine Gruppe von Cluster - inhibitorischen Neuronen sind die GABA - erge medialen paracapsular interkaliert Zellen (mpITCs), aber ihre genaue Konnektivität und Funktion versteht sich unvollständig 20-22. Hier wird optogenetische Schaltung Mapping verwendet und abführenden Konnektivität dieser Zellen und deren Auswirkungen auf die Zielneuronen in der Amygdala beurteilen zu können , was zeigt , dass mpITCs direkten sensorischen Input von Thalamus und kortikale Relaisstationen 23 empfangen. Spezifische Expression von ChR in mpITCs oder BLA Neuronen ermöglicht die Zuordnung von lokalen Interaktionen und enthüllt, dass mpITCs hemmen, sind aber auch für beide Seiten aktiviert durch, BLA Haupt Neuronen, so dass sie in neuartigen Feedforward und Feedback hemmende Schaltungen platzieren, die effektiv BLA Aktivität steuern23.

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Protocol

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Ethik Aussage: Alle experimentellen Verfahren waren in Übereinstimmung mit der EU-Richtlinie über die Verwendung von Tieren in der Forschung und wurden von der lokalen Animal Care und Use Committee (Regierungspräsidium Tübingen, Baden-Württemberg, Deutschland), die für die Universität Tübingen genehmigt.

1. Stereotactic Injektionsverfahren

  1. Bereiten Sie sterile Werkzeuge (Schere, Skalpell, Klemmen, Bohrer, Nadeln, Nahtmaterial) mit einem Sterilisator. Anordnen sterile Instrumente und andere erforderliche Lösungen und Chirurgie liefert wie sterile Baumwoll Swaps, Desinfektionsmittel, sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) und H 2 O 2 auf einem sterilen chirurgischen Abdecktuchs.
  2. Ziehen Glasmikropipetten für Injektionszwecke (1A, Einschub) einen 3 mm breiten Feld Filaments auf einer horizontalen Mikroelektrode puller gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird .
    Hinweis: Bei tiefen Injektionen sollte die Elektrode Verjüngung ausreichendlange die ventrale meisten Koordinaten zu erreichen (ca. 5 mm;. für Koordinaten, siehe 1.10).
  3. Premix 1 ul Viruslösung und 0,2 ul 0,1% Fast Green-Lösung in sterilem PBS (zur besseren Sichtbarkeit der Lösung in der Glaspipette). Füllen Glaspipetten mit einer Mischung aus Viruslösung und schnell grün eine Mikroliterpipette mit einer feinen Spitze (1A, Einschub) verwendet wird .
    Hinweis: Arbeiten mit rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren (rAAV) wird Biosicherheitsstufe angesehen 1 (BSL 1) Arbeit und muss in einem BSL 1 Labor durchgeführt werden. rAAVs in dieser Studie verwendet wurden (Abbildung 1C) waren: 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (Serotyp 2/9) 16; 2) mgm / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (Serotyp 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1A-DIOhChR2 (H134R) -YFP (Serotyp 2/1) 23
  4. Anesthetize eine Maus ein kleines Tier Anästhesiegerät (Isofluran: 3% in Sauerstoff für Induktion) verwendet wird.
    Anmerkung: Die Mäuse in dieser Studie verwendet wurden, waren 4 -7 Wochen alt und der folgenden Stämme und Genotypen: C57Bl6 / J Wildtyp (Experiment in den 2A und 3A-D); GAD67-GFP 24 (Experiment in den 2B und 3E-H); TAC2-Cre 25 (Experiment in den 2C und 3I-J).
  5. Shave Kopf zwischen den Ohren und Augen. Wenden Sie Desinfektionsmittel (Providon-Jod-Basis) zu rasierten Kopf mit Wattestäbchen.
  6. Tragen Sie eine Augensalbe zum Austrocknen der Augen während der Narkose zu verhindern. Subkutan injizieren Maus mit analgetischen (Meloxicam-basierte, 0,1 ml von 5 mg / ml Lösung).
  7. Platzieren der Maus in stereotaktischen Rahmen (1A) und aufrechtzuerhalten Anästhesie über eine Gasnarkosemaske (Isofluran: 2% in Sauerstoff für Wartung). Überprüfen Narkose Tiefe Reflex mit Gliedmaßen Rückzug, bevor Sie fortfahren.
    Hinweis: Behalten Sie sterilen Bedingungen so gut wie möglich während des gesamten chirurgischen Eingriffs; tragen Einweg-Gesichtsmaske, chirurgische gown und Handschuhe.
  8. Machen Hautschnitt auf der Oberseite des Kopfes mit einer Schere. Ziehen Sie die Haut an der Seite stumpfen Pinzette, fix mit Klammern Schädeloberfläche freizulegen, und saubere Schädel mit H 2 O 2.
  9. Mark Injektionsstellen auf Schädel , der eine feine Spitze Permanentmarker und Bohrungen für beide Hemisphären (1B) verwendet wird . Koordinaten für Injektionen in dieser Studie sind (von Bregma (mm)): mPFC: anteriore 1.9, lateral ± 0,3, ventralen 2.1; Mgm / PIN: posterior 3.0, lateral ± 1,8, ventralen 3,8; mpITC / BLA: posterior 1,45, Seiten ± 3,35, und ventralen 4,75.
  10. Montieren gefüllt Glaspipette auf stereotaktischen Rahmen verbunden mit einer Druckeinspritzvorrichtung und bringen die Pipette zu Bregma Position.
  11. Brechen Sie die Spitze der Glaspipette mit feinen geraden Spitze Pinzette. Tun Sie dies vorsichtig Aerosolerzeugung von Viruslösung zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze ein paar Druckimpulse durch die Anwendung und die Beobachtung der Extrusion von Tropfen viru geöffnet ists Lösung.
  12. Gehen Sie zu den gewünschten Injektions Koordinaten und injizieren die Hälfte der Pipetteninhalt (~ 0,5 ul) die folgenden Einstellungen auf dem Druckinjektionsvorrichtung mit: Druck: 20 psi, mittlere Pulslänge: 30 ms, die durchschnittliche Anzahl von Impulsen: 50.
  13. Lassen Sie Pipette in Platz für ca. 1 min, bevor sie langsam (1 mm / min) zurückgezogen wird es.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Pipette nicht blockiert wird, bevor Verfahren mit der gleichen Pipette auf anderen Hemisphäre zu wiederholen. Bei blockierten Spitze, reinigen oder brechen wieder Spitze und Null Pipette Position bei Bregma ab.
  14. Saubere Schädel mit PBS (pH 7,4), entfernen Sie Klemmen, die Haut sanft zusammen ziehen und vernähen den Schnitt mit einzelnen Knopfnaht (3-4 Knoten). Wenden Sie Desinfektionsmittel (Providon-Jod-Basis) um die Wunde.
  15. Stoppen Sie die Anästhesie und lassen Sie nicht die Maus unbeaufsichtigt, bis er vollständig wach ist. Halten Sie einzelne Untergebracht oder Rückkehr in Gesellschaft anderer Tiere nur, wenn sie vollständig erholt. Postoperativ weiterhin den Gesundheitsstatus zu überwachen und Verwalter Analgetikum, falls erforderlich. Befolgen Sie die Anweisungen nach den Regeln von der lokalen Animal Care und Use Committee vorgelegt.

2. Herstellung von Acute Slices

  1. Bereiten Sie ACSF, Schneiden Lösung, Werkzeuge (Schere, Skalpell, Pinzetten, Spatel, Pasteurpipette) und Agarblöcken.
    Anmerkung: 1 L künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit (ACSF) pro Experiment erforderlich ist , und hergestellt wird durch Chemikalien in doppelt destilliertem H 2 O , wie zuvor 16,23 veröffentlicht aufzulösen. Cutting - Lösung wird durch Ergänzung 200 ml ACSF mit 0,87 ml 2 M MgSO 4 Stammlösung hergestellt.
  2. Oxygenat ACSF und Schneidelösung während des Experiments mit 95% O 2 und 5% CO 2.
  3. Tief betäuben Maus ein kleines Tier Anästhesiegerät mit Isofluran (3% in Sauerstoff) verwendet wird. Überprüfen Narkose Tiefe Reflex mit Gliedmaßen Rückzug, bevor Sie fortfahren.
  4. Enthaupten Maus große Schere und sofort kühlenKopf in eiskaltes Schneidelösung.
  5. Offene Schädel durch einen einzigen Mittelschnitt von kaudal rostral und drücken Sie vorsichtig Stück des Schädels an den Seiten einer Pinzette. Schnell Gehirn entfernen, indem Sie es vorsichtig aus dem Schädel Anheben eines kleinen runden Spachtel. Abgeschnitten Cerebellum mit Skalpell. Platzieren Sie Gehirn in eiskaltem Schneidelösung.
  6. Für mPFC Injektionsstellen: vorderen Teil des Gehirns (mit mPFC) mit einem Skalpell und setzen in eiskaltem Schneidelösung bis Schneiden abgeschnitten.
  7. Überschüssiges Schneidelösung mit einem Filterpapier und kleben Sie den hinteren Teil des Gehirns auf die Vibratom Bühne.
  8. Für gekippten Amygdala Scheiben, kleben Sie das Gehirn auf einem Agar - Block (4%) schneiden bei einem 35 ° Winkel (1D, Mitte). Für koronalen Amygdala Scheiben, mgm / PIN Injektionsstellen und mPFC Injektionsstellen, kleben Sie das Gehirn direkt auf der Bühne (1D, links und rechts). Legen Sie einen zusätzlichen Agar-Block hinter Gehirn für Stabilität beim Schneiden.
  9. Place Stufenkammer mit eiskaltem mit Sauerstoff angereicherten Schneidelösung in Schneiden, die bei 4 ° C unter Verwendung einer Kühleinheit gehalten wird. Bereiten akuten Scheiben der Amygdala (320 & mgr; m) mit einem Saphirklinge. Die Scheiben in einer Schnittstelle Kammer mit Sauerstoff angereicherten ACSF bei RT geliefert.
  10. Nach der Herstellung der akuten Amygdala Scheiben, legen Sie die Schnittstelle Kammer in einem Wasserbad bei 36 ° C Scheiben zu erholen für 35 - 45 min. Anschließend kehren die Schnittstelle Kammer auf RT. Denn von diesen Scheiben aufnehmen, fahren Sie mit Schritt 3.2.
  11. Während Beginn des Schrittes 2.10 geschnittenen Scheiben der Injektionsstellen nach wie vor für die akute Amygdala Scheiben beschrieben (Schritte 2,8 bis 2,9). Rückgewinnung von Scheiben im Wasserbad ist hier nicht erforderlich. Optional: Um schnell Injektionsstelle Lage abzuschätzen, beobachten Scheiben auf einem Stereoskop mit einer Leuchtstofflampe und geeigneter Filtersätze ausgestattet.
  12. Fix Scheiben enthält, Injektionsstellen für die Post-hoc-Analyse, indem sie zwischen zwei Filterpapieren sandwichartig und submerGing sie in 4% Paraformaldehyd (PFA) in O / N PBS-Lösung. Für die Analyse der Injektionsstellen fahren Sie mit Schritt 4.1.

3. Visualisierung und Stimulation der präsynaptischen Fibers

  1. Bereiten Sie Patch-Mikroskop für optogenetische Aktivierung von Fasern und Zellen:
    1. Zentrieren Sie die montierte Leuchtdiode (LED) auf den Lichtabgabeleitung.
    2. Messen Sie die LED-Lichtintensität an der hinteren Brennebene und am Ausgang jedes Objektiv mit einem Leistungsmesser die entsprechende Wellenlänge von 470 nm zu wählen.
    3. Berechnen Sie die Lichtintensität in mW / mm 2 und erstellen Sie eine Kalibrierungskurve (LED - Intensität (%) im Vergleich zu Lichtleistung (mW / mm 2)) für jedes Ziel für Werte für 470 nm Wellenlänge gemessen.
  2. Rufen Sie einen spitzen Amygdala Scheibe von der Schnittstellenkammer und in der Schnittkammer auf den aufrechten Mikroskop mit einer Leuchtstofflampe ausgestattet montiert. Achten Sie auf die Scheibe, so dass der SLIC zu positionierene Oberfläche nach oben in der Schnittstellenkammer zugewandt ist, ist auch mit Blick nach oben in der Aufnahmekammer. Perfundieren slice mit frischem, oxygenierte ASCF mit einer Rate von 1 bis 2 ml / min bei einer Temperatur von ca. 31 ° C.
  3. Beobachten präsynaptischen Fasern in der Schicht, die Leuchtstofflampe in Kombination mit geeigneter Filtersätze für das spezifische fluoreszierende Protein exprimiert werden. Verwenden 5x Ziel eine Übersicht (Figur 1E) zu erhalten, und 60x Ziel für die Beurteilung der Faserdichte innerhalb des Zielbereichs.
    Hinweis: Für die GFP und YFP, wählen Sie Filter setzen "grün" (Erregungs 472/20, Strahlteiler 495, Emission 490 LP) für mCherry verwenden Filter-Set "rot" (Erregungs 560/40, Strahlteiler 585, Emission 630/70), wie angegeben in den Materialien / Ausrüstung Tisch.
  4. Öffnen oder die Öffnung in dem Mikroskop Lichtweg beschränken , wie für das Experiment (2D) erwünscht.
  5. Um einen Patch Aufzeichnung zu erhalten, eine Patch-Pipette mit internen Lösung füllen und montieren in Elektrodenhalter. Bewerben positiven Druck auf die Pipette Patch und langsam zuerst in die Badlösung senken und dann unter Sichtkontrolle in die Scheibe der Mikromanipulator mit.
    1. Nähern Sie sich dem Neuron von Interesse mit der Patch-Pipette von der Seite und von oben. Lösen positive Druck, wenn die Pipette auf der Oberfläche der Zelle ist (dimple sichtbar auf der Zelloberfläche) und erhalten eine "Gigaseal" durch Unterdruck angelegt wird.
    2. Tragen Sie weitere Sog der Membranscheibe zu Bruch Whole-Cell-Aufzeichnung zu erhalten. Anschließend stimulieren markierte Fasern mit der angeschlossenen LED die entsprechende Wellenlänge zur Aktivierung ChR mit (470 nm), während elektrische Antworten aus der Zelle aufnehmen.
    3. Für synaptische Stimulation mit einer niedrigen LED-Intensität beginnen und zu erhöhen, bis die gewünschte synaptischen Stromamplitude erreicht ist. Auslöser der LED durch digitale Ausgänge in der Datenerfassungs - Software die Konfiguration der Zeitpunkt und die Pulslänge (Beispiele in Abbildung zu steuern3).
      Hinweis: andere Software und / oder TTL-erzeugende Geräte können zur Auslösung LED verwendet werden.
  6. Wiederholen Stimulation mit geöffneten oder begrenzte Öffnung (Schritt 3.4) in dem Mikroskop Lichtweg wie für das nächste aufgezeichnete Zelle und / oder in Gegenwart von bestimmten Arzneimitteln erwünscht.
  7. Nach der Aufnahme beheben Scheiben für die Post-hoc-Analyse, indem sie zwischen zwei Filterpapieren sandwichartig und sie in 4% PFA O / N Untertauchen.
  8. Analysieren elektro Daten.
    Hinweis: Verwenden Sie eine geeignete Software zur Visualisierung aufgenommenen Sweep-Daten für jede einzelne Stimulation offline. Wenn Wirkungen von Medikamenten zu analysieren, verwenden Spitzenerkennungsroutinen Zeitverlauf der Arzneimittelwirkung auf die synaptische Stromamplituden für alle einzelnen Sweeps zu erhalten. Bestimmen Sie, wann die Arzneimittelwirkung stabilen Zustand erreicht. Zur Herstellung von repräsentativen Durchschnitt Antworten für Zahlen verwenden Software durchschnittliche ≥10 einzelnen Durchläufe pro Versuchsbedingung (siehe Abbildung 3B-D, FH, J rechts).
    Hinweis: mehrere alternative Softwarepakete können für die Datenanalyse verwendet werden.

4. Post-hoc-Analyse von Injektionsstellen

  1. Waschen Scheiben Injektionsstellen (aus Schritt 2.12) und Aufnahmestellen (wenn Re-Imaging gewünscht wird, aus Schritt 3.7) dreimal in PBS. Dies wird durch wiederholtes Ersetzen Lösung mit frischem PBS auf einer rotierenden Schüttelmaschine dreimal für 10 min durchgeführt.
  2. Bereiten Sie 2% Agar-Agar-Lösung in PBS, und lassen Sie es auf ~ 65 ° C abkühlen. Die Scheiben flach auf dem Boden eines kleinen Durchmesser von 30 mm Petrischale, betten Scheiben in Agar-Agar und lassen Sie es, bis es fest abkühlen.
  3. Kleben Sie einen Agar-Block mit eingebetteten Scheibe oder Scheiben auf der Bühne eines Vibratom und platzieren Bühne im Schneidraum mit PBS.
  4. Resection eingebettet Scheiben bis 70 & mgr; m Dicke. Optional: Nach Resektion kann Scheiben gefärbt werden, das heißt mit Neurotrace zu offenbaren Cytoarchitektur (3A, C), und / oder by Immunfluoreszenzanfärbung für YFP oder mCherry das Signal von der MRK-Fusionsproteins zu steigern.
  5. Berg Scheiben auf Dias und Deckglas mit Montage Medien. Bildinjektionsstellen und, falls gewünscht, auch Bildscheiben Fasern in den Projektionsbereichen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops oder eines konfokalen Laser-Scanning - Mikroskop (2A-C) enthält.

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Representative Results

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Dieser Abschnitt zeigt den Workflow eines ex vivo optogenetischen Ansatz und repräsentative Ergebnisse aus verschiedenen experimentellen Strategien , um die physiologischen Eigenschaften von sensorischen und modulierende Langstrecken - Projektionen BLA und mpITC Neuronen sowie Eigenschaften der lokalen Konnektivität zwischen mpITC und BLA zu untersuchen.

Nach stereotaktische Injektion des ausgewählten Virusvektor an den gewünschten Koordinaten in das Mausgehirn (1A-C, Zeit viralen Expressions 2 bis 6 Wochen, je nach Experiment), akute Hirnschnitten der Injektionsstellen und die Projektionsflächen in der Amygdala werden hergestellt bei den entsprechenden Winkel für die Patch-Clamp - Experimenten und aus dem injizierten Hirnregion für Post-hoc - Analyse der Injektionsstelle (Abbildung 1D). Vor Aufnahmen und die optogenetische Stimulation starten, fluoreszenzmarkierte Zellen oder axonalen projektionen im Zielgebiet (Amygdala) sollten mit Hilfe der beigefügten Leuchtstofflampe (Abbildung 1E) für Patch-Clamp - Aufnahmen auf dem aufrechten Mikroskop geprüft werden. Nach Erhalt initiiert eine Patch-Clamp-Aufnahme von einem putativen Zielzelle im Projektionsbereich der Scheibe wird das Licht Stimulation während Zeitpunkt, Intervall- und Pulslänge über die Patch-Software gesteuert werden, die die Leuchtdiode (LED) auslöst. In Abhängigkeit von der Versuchsstrategie (Abbildung 2A-C, rechts) die Öffnung in der Fluoreszenzlichtpfad entweder vollständig geöffnet oder eingeschränkt (2D). Während die Impulslänge konstant und so kurz wie möglich zu halten (idealerweise ≤1 msec), LED - Ausgangsintensität erhöht wird langsam zu beurteilen , welche Intensität erforderlich , um die gewünschte Amplitude der synaptischen Antwort in einem bestimmten Experiment (2E) zu erreichen. Nach der Aufnahme der Amygdala Scheiben sind nachfixiert. Nach Resektion und optionalFärbung, Injektion und Aufnahmestellen sind auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet Injektionsstelle zu überprüfen und Daten von verlegt Injektionen auszuschließen. Bilder der Injektionsstellen und die zugehörigen axonale Projektionen in der Amygdala für die drei Versuchsstrategien (mPFC Eingänge BLA, thalamischen Eingänge mpITCs und lokale mpITC Aktivierung) sind in Abbildung 2A-C dargestellt.

Abbildung 3 zeigt repräsentative Aufzeichnung erhaltenen Ergebnisse von BLA Haupt Neuronen, lokale BLA Inter und mpITC Neuronen , welches die Eigenschaften von Licht hervorgerufenen Reaktionen für die verschiedenen experimentellen Strategien (3A, E, I). GABA - erge Neuronen (lokale Inter und mpITCs) zur Aufzeichnung, GAD67-GFP - Reporter - Mäuse wurden 24 verwendet zu zielen. Für mPFC und sensorische thalamischen Projektionen mehrere Aspekte der synaptischen Übertragung untersucht werden. Die zeitliche Präzision von acvierung und die kinetischen Eigenschaften der CHRS in dieser Studie verwendet ermöglichen eine zuverlässige Stimulation mit gepaarte Impulse in einem Inter-Stimulus-Intervall von 50 msec. Dies ermöglicht eine Analyse der gekoppelten Pulsverhältnisse (PPR) von postsynaptischen Ströme (PSCs), die entweder erleichtern oder deprimierend je nach Projektion sein kann und Zielzelltyp und dienen als Indikatoren der präsynaptischen Freisetzungswahrscheinlichkeit (3B, F, H) . Zusätzlich Analyse der synaptischen Latenzen ermöglicht für die Präparation von verschiedenen postsynaptischen Antwortkomponenten.

In diesem Beispiel längere Latenzen der inhibitorischen PSC (Ik) gegen exzitatorische PSC (EPSC) -Komponente zeigen eine disynaptic und monosynaptic Eingang bzw. (3C). In anderen Fällen kann eine gründlichere Analyse zusätzlicher EPSC Eigenschaften wie Antwort Jitter oder der Koeffizient der Varianz der Antwortgröße benötigt werden, um Schlussfolgerungen zu ziehen auf seinen Mono- oder disynaptic Natur 17,23. Darüber hinaus Anwendung von pharmakologischen Blockern für spezifische Rezeptoren können die Art von PSCs identifizieren (dh glutamatergen EPSC und GABAergic IPSC, 3C-D). Wie erwartet, war die frühe Komponente des mPFC Eingang glutamatergen, während der späten Komponente GABAergic war. Der komplette Block sowohl EPSC und IPSC mit dem Glutamat-Rezeptor-Blocker CNQX unterstützt ferner, dass der IPSC disynaptic ist. Bei optogenetically aktivierten Fasern zur Modulation der synaptischen Übertragung untersuchen die Wirkungen von Agonisten und Antagonisten für metabotrope Rezeptoren (hier GABA B Rezeptoren) auf Amplitude und PPR auf prä- und postsynaptischen Seiten auszuwerten Einflüsse zu beurteilen. In diesem Beispiel ist die damit einhergehende Abnahme der Amplitude mit einer Zunahme in PPR indikativ für eine präsynaptischen Modulation der lichtaktivierten Fasern (3G, H). Schließlich können lokale Wechselwirkungen von Zellen in der Amygdala beurteilt werden, beispielsweisewenn Mäuse , die 25 unter der Kontrolle des TAC2 Promotor CRE Express sind mit einem Doppel floxed ChR exprimierenden viralen Vektor (1C) injiziert. Weil TAC2 und somit ChR in mpITC und zentralen Amygdala (2C) ausgedrückt wird, wurde Lichtaktivierung an das mpITC beschränkt durch die Fluoreszenzlichtpfadöffnung (2D) zu schließen. Unter diesen Bedingungen licht evozierten Aktionspotentialen können in infizierten mpITCs ausgelöst werden. Kurze Latenz hemmende synaptische Antworten in der BLA zeigen das Vorhandensein einer funktionellen hemmenden Verbindung zwischen mpITC und BLA Haupt Neuronen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Stereotactic Injections, Vorbereitung der akuten Hirnschnitten und Visualisierung von Presynaptic Fibers. (A, B) Stereotactic Virusinjektion. A) Bild von narkotisierten Maus in einem stereotaktischen Rahmen mit dem Schädel platziert ausgesetzt und dieInjektionspipette. Kleines Bild: Zoom-in-Bild der Injektionspipette mit Virus-Lösung mit schnellem Grün gemischt gefüllt. Maßstabsbalken: 3 mm. (B) Schematische Darstellung einer Maus Schädel mit markierten Positionen von Bohrungen für unterschiedliche Spritzbereiche. (C) Schematische Darstellung verschiedener viraler Konstrukte in dieser Studie verwendet. Dunkelgrau: Promotorsequenz; blau: Channelrhodopsin2 (ChR2 (H134R)); grün / rot: fluoreszierendes Protein. Expression Zeit betrug 2 Wochen für die lokale Amygdala Projektionen und 4 - 6 Wochen für Projektionen von mPFC und mgm / PIN. (D) Herstellung von akuten Hirnschnitten: Scheme Platzierung der Maus Gehirn auf Slicer Bühne zeigt für Scheiben aus verschiedenen Injektions- und Projektionsflächen zu erhalten. (E) Visualisierung von Fasern in akuten Hirnschnitten von einem GAD 67-GFP - Maus injiziert mit ChR2-mCherry Virus in mgm / PIN. Die Bilder werden auf dem aufrechten Patch Mikroskop mit verschiedenen Filtersätzen genommen: GAD67-GFP-Expression, in der Mitte; Mgm / PIN Fasern mit mC markiertherry, richtig. Maßstabsbalken: 200 & mgr; m. mPFC, medialen präfrontalen Kortex; mpITC, medial paracapsular Einlagerungen Zellen; BLA, basolateralen Amygdala; Mgm, medialen Kniehöcker, medialen Teil; PIN, posterior intralaminären Thalamuskern; LA, laterale Amygdala; BA, basal Amygdala; CeA, zentralen Kern der Amygdala. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Injektionsstellen, Projektionsflächen und optogenetische Stimulation des axonalen Projektionen. (AC) konfokale Bilder von repräsentativen Injektionsstellen und Projektionsflächen in der BLA und Schemata der experimentellen Strategien. (A) Links: mPFC Injektionsstelle in einer C57BL / 6 - Maus mit Neurotrace gefärbt. Maßstabsbalken:500 & mgr; m. Mitte: Vorsprünge in der BLA in einer gekippten Amygdala Scheibe entspricht. Maßstabsbalken: 200 & mgr; m. Rechts: Schematische Darstellung der gesamten Feldbeleuchtung von mPFC Projektionen und Aufzeichnung von Neuron in der BLA. (B) Links: mgm / PIN Injektionsstelle in einem GAD 67-GFP - Maus. Maßstabsbalken: 500 & mgr; m. Mitte: Entsprechende Vorsprünge in mpITC und LA eines koronalen Amygdala in Scheiben schneiden. Maßstabsbalken: 200 & mgr; m. Rechts: Schematische Darstellung der gesamten Feldbeleuchtung von mgm / PIN Projektionen und Aufzeichnung eines mpITC Neuron. (C) Links: Lokale Expression von ChR2-YFP in einer Neurotrace gefärbten Amygdala Scheibe eines TAC2-Cre Maus. Maßstabsbalken: 200 & mgr; m. Kleines Bild: Zoom in der mpITCs ChR2-YFP Ausdruck zu bringen. Maßstabsbalken: 20 & mgr; m. Rechts: Schematische Darstellung der eingeschränkten Beleuchtung des mpITC Cluster und Aufzeichnung eines BLA Neuron. (D) Bilder von Kammer Aufnahme während Lichtabgabe und Bild von Neuronen in akuten Hirnschnitten (mpITC Cluster) in einem GAD 67-GFP - Maus mit offenen und beschränkten apertur. Maßstabsbalken: 30 & mgr; m. (E) exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs) durch verschiedene LED - Intensitäten (oben) hervorgerufen und die Handlung der Lichtleistung im Vergleich zu evozierte EPSC Amplitude (unten) aus einem repräsentativen mpITC Neuron auf optogenetische Aktivierung von Fasern aus mgm / PIN. Maßstabsbalken: 100 pA / 10 msec.
Hinweis:. 2A wird aus Referenz # modifiziert 16 und 2C aus Referenz # 23 Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Beispiele für Ergebnisse von optogenetische Aktivierung von Long Range und Lokale Projektionen. (A) Schema der experimentellen Strategie für (BD). (B) Repräsentative EPSCs von einer BLA Haupt Neuron aufgezeichnet undBLA Euron auf optogenetische gepaart Pulsstimulierung (50 ms Inter-Stimulus-Intervall) von Fasern aus mPFC auslösenden Impuls Erleichterung gepaart und gepaart Puls Depression sind. Maßstabsbalken: 100 pA / 25 msec. (C) optogenetische Aktivierung von Fasern aus mPFC entlockt Feed-Forward - Hemmung. Links: Repräsentative EPSC (bei -70 mV) und hemmenden postsynaptischen Strom (IPSC bei 0 mV) in einer BLA Haupt Neuron. Der IPSC hat eine längere synaptischen Latenz zum EPSC verglichen. Maßstabsbalken: 200 pA / 10 ms und 200 pA / 2 ms. Rechts: Licht evozierte zweiphasige EPSC / Ik-Sequenz (bei -50 mV) wird durch den AMPA / Kainat-Antagonisten blockiert CNQX (10 & mgr; m), weiter die disynaptic Natur des IPSC unterstützen. Maßstabsbalken: 50 pA / 5 ms. (D) Auswirkungen von Block aufeinander folgender EPSC / Ik - Sequenz (bei ​​-50 mV) durch die Cl - Kanalblocker Picrotoxin (PTX, 100 & mgr; M) und PTX + CNQX. Der IPSC wird von PTX und die restlichen EPSC von CNQX blockiert. Maßstabsbalken: 50 pA / 5 ms. (E) Schema der experimentellen Strategie für (FH). F) Vertreter EPSCs von einem mpITC aufgezeichnet und einer BLA Haupt Neuron auf optogenetische gepaart Pulsstimulierung von Fasern aus mgm / PIN. Maßstabsbalken: 50 pA / 20 ms. (G) EPSCs in einem anderen mpITC Neuron werden durch die Natriumkanalblocker Tetrodotoxin (TTX, 0,5 uM) blockiert, was darauf hinweist , dass sie auf Natriumkanalaktivität abhängig sind. Maßstabsbalken: 50 pA / 20 ms. (H) Thalamus Eingänge mpITC Neuronen werden durch präsynaptische GABA B Rezeptoren moduliert. EPSCs unter Kontrollbedingung, Reduzierung der EPSC Amplitude und die gleichzeitige Erhöhung der paarigen Pulsverhältnis während des Aufbringens des GABA B - Agonist Baclofen (2 uM), und Rückgewinnung von Amplitude und initial paarigen Impuls Ration auf Koapplikation des GABA B - Antagonist CGP55845 (10 uM). Diese Änderungen sind ein Anzeichen für einen präsynaptischen Modulation durch GABA B Rezeptoren. Maßstabsbalken: 50 pA / 20 ms. (I) Schema der experimentellen Strategie für (J). (J) Licht evozierte Aktionspotentiale aufgezeichnet von einem ChR2-YFP mpITC Neuron Ausdruck zu bringen. Licht-evozierte IPSCs von einem BLA Haupt Neuron an verschiedenen Haltepotentiale aufgezeichnet (-90, -70, -50, -20 und 0 mV) umgekehrt um die berechnete Gleichgewichtspotential für Cl -. Maßstabsbalken: 20 mV / 100 ms und 10 pA / 10 msec. Hinweis:. 3B-D modifiziert von Referenz - Nr # 16 und 3H und J aus Referenz # 23 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur ex vivo optogenetische Untersuchung von neuronalen Schaltkreise und lokale Konnektivität , die leicht auf die meisten umgesetzt werden können, wenn alle aufrechten Scheibe Patch-Clamp - Aufnahme - Setups , indem sie mit einem ~ 470 nm LED an der Epifluoreszenz Licht Port Ausrüstung nicht. Ein großer Vorteil der optogenetische Stimulation der axonale Projektionen in Scheiben ist, dass es für die spezifische Aktivierung und Untersuchung von Eigenschaften von Verbindungen ermöglicht, die nicht zugänglich zu herkömmlichen elektrischen Stimulation waren, da die entsprechenden Faserbahnen nicht bekannt waren, nicht eindeutig definiert ist, oder nicht erhalten in ein einziges Gehirn in Scheiben schneiden. Als wichtiges Beispiel relevant für Angst Schaltungen ist dargestellt, wie diese angewendet werden kann, um Eigenschaften von mPFC Eingänge an die Amygdala zu sezieren.

Selbst in Fällen, in denen elektrische Faserzug Stimulation hat ausführlich in früheren Studien verwendet worden sind, tragen diese Flächen oft Fasern aus verschiedenen Herkunftsregionen. Zum Beispiel in Schaltungen zu befürchten Lernen im Zusammenhang mit Projektionen aus verschiedenen sensorischen Thalamuskernen oder kortikalen Regionen führen den internen und externen Kapseln vermischt sind. Der Vorteil der optogenetische Stimulation ist, dass sie die selektive Aktivierung einer Untergruppe von Fasern, die aus einem definierten Bereich ermöglicht. Dies ist für die spezifische Thalamus Eingaben von PIN dargestellt und mgm zu Einlagerungen Zellen und lateralen Amygdala Hauptzellen. Darüber hinaus können Probleme mit der elektrischen Stimulation ergibt, das heißt, die Aktivierung von anderen Fasern des Durchgangs oder Zellen in der Nähe der Stimulationselektrode , die lokale Verbindungen in den Zielbereich bilden kann überwunden werden. Während jedoch optogenetische Stimulation ebenso schnelle wie elektrische Stimulation kann es Einschränkungen in Bezug auf die Stimulationsfrequenz, die zuverlässig angewendet werden können. Dies hängt von der Inaktivierung und deinactivation Kinetik und der Variante CHR, der verwendet wird, 4 sowie expression Ebenen und Methoden und Lichtstimulationsverfahren 26.

Wenn eine LED unter Verwendung von für die Lichtstimulation zur Fluoreszenz-Port angebracht ist, typischerweise das gesamte Sichtfeld eines gegebenen Ziel beleuchtet wird, in der Aktivierung aller Fasern oder Zellen in dem Feld ergeb und innerhalb einer bestimmten Tiefe. Dies kann nur teilweise auf einen kleineren Bereich oder ein Satz von markierten Zellen eingeschränkt werden (in diesem Beispiel die mpITC) eine Öffnung in dem Fluoreszenz Lichtweg 23,27 verwenden. Mit LEDs ist die Lichtleistung kein Problem, da hohe Leistung blauen LEDs von vielen Herstellern verfügbar sind. Jedoch weisen die Emissionsspektren mit voller Breite Halbmaximalwerte von einigen zehn Nanometern. Daher LEDs stellen Einschränkungen, wenn entweder räumlich präzise Stimulation für subzelluläre Mapping von Verbindungen und / oder monochromatisches Stimulation erwünscht sind. Beide können mit blauen Lasern als Lichtquellen verbessert werden, in der Regel in Kombination mit anspruchsvolleren Setups, die Teer ermöglichenGeting und / oder Scannen des Strahls in kleinen Bereichen und definierte Gewebetiefen (siehe beispielsweise 28).

Mit der ex vivo optogenetischen Ansatz , der hier beschrieben ist , kann mehrere Eigenschaften der synaptischen Transmission untersucht werden. Um monosynapticity der frühen synaptischen Antwortkomponente, gründliche Analyse von Latenzen und deren Jitter sowie Antwortamplitudenvarianz sollte auf einer repräsentativen Stichprobe von aufgezeichneten Neuronen (siehe zB 16,17,23) zu beurteilen , verwendet werden. In Fällen , in denen die Aktivierung von Netzwerk - Aktivität eine Rolle spielen können, ist die Methode der Wahl , um die direkte monosynaptic Komponente zu isolieren , indem eine Kombination von Tetrodotoxin (TTX) Anlegen von Aktionspotentialen in Kombination mit dem K + Kanalblocker 4-Aminopyridin zu blockieren (4- AP) Repolarisation 14,28,29 zu vermeiden. Die Rezeptoren Mono- und disynaptic Komponenten von Eingängen vermittelnde können mit pharmakologischen Blockern identifiziert werden. Furthermore ist es möglich , Aspekte der präsynaptischen Modulation der optogenetically aktivierten Eingänge in der Amygdala 23.30 zu studieren. Ein möglicher Nachteil ist , dass ChR2 etwas Kalzium Permeabilität 1,4 und dessen Aktivierung in präsynaptischen Fasern und Terminals wurde vorgeschlagen , durch verschiedene Mechanismen Freisetzungswahrscheinlichkeit zu verändern 26,31 hat. Dennoch mehrere Studien mit Beispielen hier erfolgreich eingesetzt ChR2 Ausdruck gezeigt zu identifizieren Input- und zielzellspezifische Unterschiede in gepaart Pulsverhältnisse in der Amygdala und anderen Gehirnbereichen 16,23,26,32 und darüber hinaus gezeigt , Modulation der Freisetzungswahrscheinlichkeit durch die Aktivierung spezifischer Signalwege in präsynaptischen , die nicht durch ChR Aktivierung 23.30 ausgeschlossen wurde. Weitere Unterstützung kommt von Daten im Hippocampus und des Kleinhirns, die zeigen, dass mit dem entsprechenden ChR Expressionsverfahren und Lichtstimulationstechnik, physiologische Aspekte einschließlich Wirksamkeit der Freisetzung und Treue of synaptischen Übertragung zuverlässig 26 untersucht werden. Schließlich hat optogenetische Faseraktivierung erfolgreich eingesetzt Stimulationsprotokolle anzuwenden , die synaptische Plastizität 31,33,34 induzieren.

Mehrere Aspekte sind für den Erfolg des Verfahrens kritisch. Eine davon ist die Genauigkeit der stereotaktischen Targeting von viralen Vektoren. Daher ist es sinnvoll, schnell Injektionsstelle Lage bewerten, bevor Aufnahmen zu erhalten und dann eine ausführlichere Post-hoc-Analyse durchführen. Zusätzlich zur räumlichen Präzision, ist die Lebensfähigkeit von Neuronen an der Injektionsstelle eine wichtige Determinante für einen erfolgreichen Versuch und hängt von Injektionstechnik. Die dargestellte Möglichkeit, unter Verwendung von langen und dünnen konischen Glaselektroden, dient diesem Zweck sowohl für gut oberflächlichen und tieferen Hirnarealen, kann aber den Nachteil, dass die Konizität sehr flexibel ist. Eine Alternative ist die Mikroliterspritzen speziell für Stereotaxie-Lieferung in den Neurowissenschaften (Neuro s entwickelt verwendenyringes) mit steifer Nadeln, die kleine Volumina verzichtet werden kann. Die Spezifität der chr-Expression auf definierte Zelltypen und Regionen Targeting weiteren kann unter Verwendung Bedingungsausdruck 7, beispielsweise mit dem Cre-System verbessert , wie für Amygdala interkaliert Zellen veranschaulicht. Dies ermöglicht auch die Verwendung von starken Promotoren in Cre-abhängige virale Vektoren.

Ein weiterer kritischer Aspekt ist die Wahl des viralen Vektors. Um auszudrücken, wurden ChR, rekombinantes Adeno-assoziierte Viren (rAAVs) verwendet, das den Vorteil, dass ein Bio-Sicherheitsstufe 1 Vektoren im Vergleich zu anderen beliebten viralen Systemen haben. rAAVs sind seit einiger Zeit und sind in der Regel sicher und zuverlässig Vektoren mit guten neuronalen Tropismus und wenig oder gar keine immunogene Potential, aber ihre Verpackungsvolumen ist begrenzt (ca.. 4-5 kb) 35 verwendet. In diesen speziellen Versuchen Serotypen 2/9 und 2/1 für die ubiquitäre und bedingte Ausdruck verwendet wurden, respectively. In Übereinstimmung mit der Literatur,se Serotypen transduzieren Zellen in der Zielregion, aber erscheint nicht von Axonen aufgenommen werden Etiketten Zellen retrograd im Gegensatz Serotypen 2/5 und 2/6 36,37. Jedoch sollte anfänglichen Experimenten auszuschließen, dass es chr-markierten Zellkörper in Bereichen der Injektionsstelle hervorstehenden, was besonders wichtig ist, wenn reziprok verbunden Hirnregionen wie mPFC und Amygdala studieren. Mehrere neuere Studien die Wirksamkeit von rAAV Serotypen in verschiedenen Hirnarealen bei Ratten und Mäusen 36,38,39 verglichen. Eine auftauchende Thema ist , dass neuere Serotypen (beispielsweise 2/1, 2/8 und 2/9) sind im Allgemeinen effizienter als der ursprüngliche 2/2 Serotyp. Auch der Hinweis, rAAV-vermittelte Expression von ChR, im Gegensatz zu anderen Methoden, nicht die Ursache für schädliche Wirkungen auf 40 Zellen oder markierte Axone Ausdruck zu bringen. Die erforderliche Expressionszeit zu erreichen effektiven Faser Aktivierung ex vivo untersucht erscheint auf dem Abstand des Projektions abzuhängen. Hier und im Einklang mit der literature, zur Beschriftung und Aktivierung von Langstrecken-Verbindungen in der Maus (mPFC und sensorische Eingänge), ein Ausdruck Zeit von 4 - 8 Wochen benötigt wird, während für die lokale Konnektivität in der Amygdala studieren, kürzere Ausdruck Zeiten von 2 - 3 Wochen sind ausreichend 14-17,23,30,34.

Für die Aufnahme von optogenetically ausgelöste Reaktionen in den Zielbereich, sind zwei Faktoren entscheidend: 1) die akute Hirnschnitt muss von guter Qualität und 2) eine erhebliche Menge an lebenden markierten Fasern zu erhalten sein muss. Die Qualität der Scheiben kann mit Saphir Klingen zum Schneiden verbessert werden. Erhaltung von Axonen und damit Größe und Stabilität der Lichtantworten können durch Schneiden Scheiben in einem bestimmten Winkel verbessert werden , wie veranschaulicht für mPFC-Amygdala Vorsprünge (1D und 2A) 16,34. Dies hängt jedoch stark von der Orientierung der Afferenzen in der Zielregion und muss für jede Kombination von Projektionsbereich und ta bestimmt werdenrget Region. In dieser Hinsicht, post-hoc-Analyse von Vorsprüngen in der Zielregion können nützlich sein. Zur Verbesserung der Fasererkennung und circumvent Bleichen, die während der Scheibe Stimulation stattgefunden haben könnte, immunostaining gegen die fluoreszierende Markierung auf der KHR-Fusionsprotein verwendet werden.

Insgesamt hat sich diese Methode der optogenetische Schaltungs Mapping vor kurzem nicht nur angewendet worden Schaltungen zu befürchten, aber viele andere Systeme im Gehirn. In Zukunft Arten von Subkeime und spezifische Zelltargeting durch eine zunehmende Reihe von genetisch veränderten Mauslinien und bedingte virale Vektoren kombiniert wird ein noch detaillierteres Verständnis der Vielfalt funktioneller synaptischer Eigenschaften von spezifischen lokalen und Langstreckenschaltungen bieten. Darüber hinaus Post-hoc - Immunmarkierung von fluoreszenzmarkierten ChR in suchten funktionellen Verbindungen könnten mit ultrastrukturellen Analyse kombiniert werden (dh mit elektronenmikroskopischen Methoden) Einblicke in präzise mor zu schaffengischen Eigenschaften von zuvor aktivierten Synapsen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585 Filters can be bought as set F46-008
                     (emission) AHF, Germany F47-630 Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (emission) AHF, Germany F76-490 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

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References

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<em>Ex Vivo</em> optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten
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Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).More

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

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