Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

doi: 10.3791/53628 Published: April 5, 2016

Summary

גישות optogenetic נמצאים בשימוש נרחב כדי לתפעל פעילות עצבית ולהעריך את ההשלכות על תפקוד המוח. הנה, טכניקה מתוארת שעם ביטוי in vivo של המפעיל האופטי Channelrhodopsin, המאפשר ניתוח vivo לשעבר של נכסים הסינפטי של ארוכי טווח ספציפי קשרים עצביים מקומיים מעגלים הקשורות פחד.

Abstract

גישות optogenetic נמצאים כעת בשימוש נרחב כדי ללמוד את הפונקציה של אוכלוסיות נוירונים ומעגלים ידי שילוב ביטוי ממוקד של חלבוני אור מופעל והמניפולציה הבאה של פעילות עצבית על ידי אור. Channelrhodopsins (ChRs) הם אור מגודר קטיון ערוצים וכאשר התמזגו חלבון פלואורסצנטי הביטוי שלהם מאפשר להדמית הפעלה בו זמנית של סוגי תאים ספציפיים תחזיות axonal שלהם באזורים המוגדרים של המוח. באמצעות זריקה stereotactic של וקטורים ויראליים, חלבונים היתוך CHR ניתן constitutively או הביע תנאי בתאים ספציפיים של אזור במוח מוגדר, ותחזיות axonal שלהם יכול לאחר מכן להיחקר אנטומית והן מבחינה תפקודית באמצעות לשעבר vivo ההפעלה optogenetic פרוסות המוח. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת כאשר מכוונים על מנת להבין את המאפיינים הסינפטי של קשרים שלא ניתן להתמודד עם גישות גירוי קונבנציונליות חשמליות או בזיהוי affe רומןלהשכרה וקישוריות efferent כי הובן היטב בעבר. הנה, כמה דוגמאות להמחיש עד כמה טכניקה זו ניתן ליישם לחקור שאלות אלה כדי הבהרת מעגלים הקשורות פחד באמיגדלה. האמיגדלה היא אזור מפתח לרכישה והבעה של פחד, ואחסון של פחד זכרונות רגשיים. קווים של ראיות רבים מראים כי קליפת מוח הקדם חזיתית המדיאלי (mPFC) משתתפת היבטים שונים של רכישת פחד הכחדה, אבל הקישוריות המדויקת שלה עם האמיגדלה היא רק מתחילה להיות מובנת. ראשית, הוא הראה כיצד vivo לשעבר ההפעלה optogenetic יכול לשמש כדי לחקור היבטים של תקשורת הסינפטי בין afferents mPFC ותאי היעד באמיגדלה basolateral (BLA). יתר על כן, היא המחישה עד כמה vivo לשעבר זו הגישה optogenetic ניתן ליישם כדי להעריך דפוסי קישוריות הרומן באמצעות קבוצת נוירונים GABAergic באמיגדלה, האשכול תא intercalated paracapsular (mpITC), כדוגמה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כלים מדויקים להדמית הפעלה במקבילה של קשרים ספציפיים בין אזורים במוח לבין סוגים מסוימים של נוירונים הם הופכים חשובים יותר בהבנת מדינות תפקוד המוח ומחלות הבריאות הבסיסיות הקישוריות התפקודית. באופן אידיאלי, זה כרוך בחקירה פיזיולוגית של נכסים הסינפטי מדויקים עם אשר זיהו נוירונים לתקשר. זה נכון במיוחד עבור חיבורים בין אזורים במוח שלא ניתן להישמר פרוסה מוחית חריף יחידה. בעבר, זו הושגה בעיקר ניסויים נפרדים. מצד אחד, קליעים נותבים עצביים מוזרקים in vivo הועסק בשילוב עם אור עוקב או ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים של שותפים טרום postsynaptic. מצד השני, כאשר שטחי סיבים מהאזור מהמוצא נשמרים ונגישים בהכנת הפרוסה, גירוי חשמלי נעשה שימוש כדי להעריך מנגנוני תקשורת סינפטית עם תאים באזור היעד.

עם כניסתו של optogenetics, הביטוי הממוקד של-ערוצי קטיון אור המגודרים, כגון Channelrhodopsins (ChRs) התמזג חלבוני ניאון, מאפשר כעת הפעלה של נוירונים מסלולי axonal שלהם, ובמקביל לאפשר להדמיה שלהם פוסט הוק ניתוח אנטומי 1- 4. בגלל CHR להביע אקסונים יכול להיות מגורה גם כאשר ניתק מהורה somata 5, אפשר פרוסות המוח אל: 1) להעריך תשומות מאזורים במוח שלא היו נגישים עם גירוי חשמלי קונבנציונלי, כי שטחי סיבים אינם להפרדה או מסלול ספציפי הוא לא ידוע; 2) באופן חד משמעי לזהות את האזור המוצא לתשומות ספציפיות שהיו הניחו אך באופן חלקי הבינו; ו -3) לחקור את הקישוריות התפקודית בין סוגי תאים מוגדרים, הן מקומי והן בתחזיות ארוך טווח. בגלל מספר יתרונות, מיפוי optogenetic זו של מעגלים פרוסות המוח הפך רחבly בשימוש בשנים האחרונות, וכן מגוון של וקטורים ויראליים עבור ביטוי ChRs fluorescently-tagged זמין מספקי מסחרי. כמה יתרונות מרכזיים של הפעלת optogenetic על גירוי חשמלי קונבנציונלי הם ללא ניזק לרקמות עקב מיקום של אלקטרודות גירוי, ספציפי של גירוי סיבים כי גירוי חשמלי יכול גם לגייס סיבי מעבר או תאים סמוכים אחרים, וכן גירוי מהיר לא פחות ובזמן מדויק. בנוסף, הזרקת stereotactic של וקטורים ויראליים ניתן לכוון בקלות לאזורים ספציפיים במוח 6 וביטוי ספציפי מותנה או תאים מסוג יכול להיות מושגים באמצעות ביטוי Cre שונה ו / או מקדם 7 ספציפיים. הנה, טכניקה זו מיושמת למיפוי של ארוכי טווח ומעגלים מקומיים במערכת הפחד.

האמיגדלה היא אזור מפתח לרכישה והבעה של פחד, ואחסון של פחד זכרונות רגשיים 8,9. חוץ הלוך ושובמ האמיגדלה, קליפת המוח הקדם חזיתית המדיאלי (mPFC) ובהיפוקמפוס (HC), מבנים המחוברים באופן הדדי לאמיגדלה, הם מעורבים בהיבטים של הרכישה, איחוד ואחזור של זיכרונות פחד הכחדה 10,11. פעילות מחוזות של mPFC תנוגן תפקיד כפול זה לשלוט פחד גבוה ונמוך מקובעת 12,13. זה יכול בחלקו להיות מתווך על ידי קשרים ישירים מן mPFC לאמיגדלה שצפויה לשלוט פעילות האמיגדלה ופלט. לכן, בשנים האחרונות, מספר מחקרים אשר נכתבו בניסויים פרוסים vivo לשעבר לחקור אינטראקציות הסינפטי בין afferents mPFC ותאי יעד ספציפיים באמיגדלה 14-17.

במהלך הלמידה פחד, מידע חושי על גירויים ממוזגים מותנית מגיע האמיגדלה באמצעות תחזיות מאזורים התלמוס ואת קליפת המוח ספציפיים. פלסטיות של תשומות אלה לנוירונים בחלק לרוחב (LA) של basolהאמיגדלה ateral (BLA) היא מנגנון חשוב שבבסיס פחד מיזוג 9,18. ראיות הגדלה עולות כי תהליכי פלסטיק במקביל באמיגדלה כרוכות באלמנטים מעכבים לשלוט זיכרון פחד 19. קבוצת נוירונים מעכבים אשכולות הם תאי המדיאלי GABAergic intercalated paracapsular (mpITCs), אבל הקישוריות והתפקוד המדויקת שלהם מובנת 20-22 חלקית. כאן, מיפוי מעגל optogenetic משמש כדי להעריך קישוריות מביאה ו efferent של תאים אלה והשפיעו על הנוירונים היעד באמיגדלה, הוכחה כי mpITCs לקבל קלט חושי ישיר מתחנות ממסר התלמוס ואת קליפת מוח 23. ביטוי ספציפי של chr ב mpITCs או נוירונים BLA מאפשר מיפוי של אינטראקציות מקומיות, חושף כי mpITCs לעכב, אלא גם מופעלים הדדית, הנוירונים העיקריים BLA, הצבתם מעגלים מעכבות היזון קדימה ומשוב הרומן ששולטים ביעילות פעילות BLA23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הצהרה אתיקה: כל הפרוצדורות היו בהתאם הדירקטיבה של האיחוד האירופי על השימוש בחיות במחקר אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מקומיים ושימוש הוועדה (Regierungspräsidium Tuebingen, מדינת באדן-וירטמברג, גרמניה) אחראי מאוניברסיטת טובינגן.

1. נוהל הזרקת stereotactic

  1. הכן את כלי סטרילי (מספריים, סכין מנתחים, מלחציים, קודח, מחטים, חומר תפר) באמצעות מעקר. מסדרים כלים סטרילי ופתרונות נדרשים אחרים ואספקה ​​ניתוח כגון חילופי גפן סטרילי, חיטוי, בופר פוספט סטרילית (PBS, pH 7.4), ו- H 2 O 2 על וילון ניתוח סטרילי.
  2. משוך micropipettes זכוכית זריקות (איור 1 א ', הבלעה) באמצעות נימת תיבה רחבה 3 מ"מ על microelectrode אופקי חולץ על פי הוראות היצרן.
    הערה: עבור זריקות עמוקות, להתחדד אלקטרודה צריך להיות מספיקזמן להגיע הקואורדינטות ביותר הגחון (כ 5 מ"מ;. קואורדינטות, ראה 1.10).
  3. Premix 1 μl של פתרון וירוס ו -0.2 μl של פתרון ירוק מהיר 0.1% ב PBS סטרילית (הנראות של פתרון טוב יותר ב פיפטה זכוכית). מלאו טפטפות זכוכית עם תערובת של פתרון וירוס וירוק מהר בעזרת פיפטה מיקרוליטר עם טיפ נאה (איור 1 א ', הבלעה).
    הערה: עבודה עם וקטורים ויראליים הקשורים מוקטורים (rAAV) נחשב בטיחות ביולוגית ברמה 1 (BSL 1) עבודה והוא חייב להתבצע במעבדה 1 BSL. rAAVs ששימשו במחקר זה (תרשים 1C) היו: 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (סרוטיפ 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (סרוטיפ 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (סרוטיפ 2/1) 23
  4. להרדים עכבר באמצעות מכונת הרדמה חיה קטנה (Isoflurane: 3% חמצן לזירוז).
    הערה: עכברים ששימשו במחקר זה היו 4 -7 שבועות ישנים של הזנים גנוטיפים הבאים: סוג בר C57BL6 / J (ניסוי 2A דמויות 3A-D); GAD67-GFP 24 (ניסוי 2B דמויות 3E-H); Tac2-Cre 25 (ניסוי 2C דמויות 3I-J).
  5. לגלח את הראש בין האוזניים והעיניים. החל חיטוי (providone-יוד המבוססת) בראש מגולח באמצעות צמר גפן.
  6. החל משחת עין כדי למנוע התייבשות של עיניים במהלך הרדמה. תת עורי להזריק עכבר עם משכך כאבים (מבוסס-meloxicam, 0.1 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל ​​פתרון).
  7. העבר את העכבר בתוך מסגרת stereotactic (איור 1A) ולשמור הרדמה באמצעות מסכת גז הרדמה (Isoflurane: 2% חמצן לצורך תחזוקה). בדוק עומק ההרדמה באמצעות רפלקס נסיגה איבר לפני שתמשיך.
    הערה: לשמור על תנאים סטריליים טוב ככל האפשר במהלך ההליך הכירורגי כולו; ללבוש facemask חד פעמי, ללכת כירורגיתwn, וכפפות.
  8. בצע חתך עור על החלק העליון של הראש באמצעות מספריים. משוך בעדינות את עור לצד באמצעות מלקחיים בוטים, לתקן עם מלחציים לחשוף פני גולגולת, וגולגולת נקיה עם H 2 O 2.
  9. המוזרקים מארק על הגולגולת באמצעות חורים סמן וצינורות קידוח קבע טיפ נאה עבור ההמיספרות הן (איור 1B). קואורדינאטות זריקות במחקר זה הם (מ גבחת (מ"מ)): mPFC: קדמית 1.9, לרוחב ± 0.3, הגחון 2.1; MGM / PIN: אחורי 3.0, לרוחב ± 1.8, גחון 3.8; mpITC / BLA: אחורי 1.45, לרוחב ± 3.35, ועל גחון 4.75.
  10. הר פיפטה זכוכית מלאה על מסגרת stereotactic מחוברת להתקן הזרקה בלחץ ולהביא פיפטה לעמדת גבחת.
  11. לשבור את קצה פיפטה הזכוכית באמצעות מלקחיים ישר-טיפ נאה. האם זה בעדינות כדי למנוע דור אירוסול של פתרון וירוס. ודא קצה פיפטה פתוח ידי החלת פולסים הלחץ כמה והתבוננות שחול של טיפות Viruהפתרון של.
  12. עבור אל קואורדינטות הזרקה הרצויות ולהזריק מחצית תוכן פיפטה (~ 0.5 μl) באמצעות ההגדרות הבאות בהתקן ההזרקה בלחץ: לחץ: 20 psi, אורך הפולס ממוצע: 30 ms, מספר הממוצע של פעימות: 50.
  13. השאירו פיפטה במקום דקות ~ 1 לפני לאט (1 מ"מ / דקה) חוזרת בה זה.
    הערה: הפוך פיפטה בטוח אינו חסום לפני חזרה הליך עם פיפטה אותו על אונה אחרת. במקרה של קצה חסום, נקי או לנתק קצה ומצבת פיפטה אפס גבחת שוב.
  14. גולגולת נקיה עם PBS (pH 7.4), להסיר מלחציים, משוכה בעדינות את העור יחד, תפרה את החתך עם תפר כפתור פרט (3 - 4 קשרים). החל החיטוי (providone-יוד המבוססת) באזור הפצע.
  15. עצור ההרדמה ואל תשאירו עכבר ללא השגחה עד שהוא ער לחלוטין. שמור יחיד שוכן או לחזור לחברה של בעלי חיים אחרים רק כאשר התאוששו לחלוטין. לאחר ניתוח, ממשיך לעקוב אחר מצב הבריאות, ואת המנהלמשכך כאבים ter במידת הצורך. בצע את ההליכים על פי כללים שהועלו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המקומית.

2. הכנת פרוסות חריפה

  1. כן ACSF, פתרון חיתוך, כלים (מספריים, סכין מנתחים, מלקחיים, מרית, פיפטה פסטר), וחוסם אגר.
    הערה: 1 ליטר של נוזל מלאכותי השדרה Cerebro (ACSF) נדרש לכל ניסוי, והוא הוכן על ידי המסת חומרים כימיים H פעמיים מזוקקים 2 O כפי שפורסם בעבר 16,23. פתרון חיתוך הוא הוכן על ידי השלמת 200 מ"ל של ACSF עם 0.87 מ"ל של 2 מניות פתרון M MgSO 4.
  2. ACSF וחיתוך חמצן פתרון לאורך הניסוי עם 95% O 2, 5% CO 2.
  3. עמוק להרדים העכבר באמצעות מכונת הרדמה חיה קטנה באמצעות isoflurane (3% חמצן). בדוק עומק ההרדמה באמצעות רפלקס נסיגה איבר לפני שתמשיך.
  4. לערוף עכבר באמצעות מספריים גדולים ומיד לצנןראש בתמיסת חיתוך קר כקרח.
  5. גולגולת נפתחת בידי חתך קו אמצע אחת מן הזנב מקורי ודחף בעדינות פיסות גולגולת לצדדים באמצעות מלקחיים. במהירות להסיר מוח על ידי הרמתו מתוך הגולגולת בעדינות בעזרת מרית מעוגלת קטנה. חותכי מוח קטן עם אזמל. מניחים המוח בפתרון חיתוך קר כקרח.
  6. לקבלת המוזרקים mPFC: לחתוך חלק הקדמי של המוח (המכיל mPFC) באמצעות אזמל ולשים פתרון חיתוך קר כקרח עד חיתוך.
  7. הסר פתרון חיתוך עודף עם נייר סינון ודבק בחלק האחורי של המוח לבמה vibratome.
  8. עבור פרוסות האמיגדלה מוטות, מדביק את המוח על לחסום את אגר (4%) לחתוך בזווית 35 מעלות (1D איור, באמצע). עבור פרוסות האמיגדלה העטרה, המוזרקים MGM / PIN ו המוזרקים mPFC, מדביקים את המוח באופן ישיר על הבמה (איור 1D, על ימין ועל שמאל). הוסף בלוק אגר נוסף מאחורי המוח ליציבות בזמן שחתך.
  9. placדואר שלב חיתוך קאמרי עם פתרון חיתוך מחומצן קר כקרח שמתוחזק על 4 מעלות צלזיוס באמצעות יחידת קירור. כן פרוסות חריפות של האמיגדלה (320 מיקרומטר) באמצעות סכין ספיר. מניחים פרוסות בתא ממשק המסופק עם ACSF מחומצן ב RT.
  10. לאחר ההכנה של פרוסות האמיגדלה חריפות, מניח את חדר הממשק בתוך waterbath על 36 ° C להתאושש פרוסות עבור 35 - 45 דקות. בהמשך לכך, לחזור לתא ממשק RT. עבור הקלטה מ פרוסות אלה, להמשיך עם שלב 3.2.
  11. במהלך תחילת השלב 2.10, לחתוך פרוסות המוזרקות כפי שתואר קודם לכן עבור פרוסות האמיגדלה חריפות (שלבי 2.8 - 2.9). שחזור של פרוסות waterbath אינו נדרש כאן. אופציונלי: כדי להעריך ההזרקה מיקום במהירות, להתבונן פרוסות על סטריאוסקופ מצויד מנורת פלורסנט וערכות מסנן מתאים.
  12. תקן פרוסות המכילות מוזרקים עבור ניתוח פוסט הוק על ידי רבדה אותם בין שני ניירות לסנן submerגינג אותם paraformaldehyde 4% (PFA) ב N / O פתרון PBS. באשר לניתוח מוזרק להמשיך בשלב 4.1.

3. ויזואליזציה גירוי של סיבי Presynaptic

  1. כן מיקרוסקופ תיקון עבור הפעלת optogenetic של סיבים ותאים:
    1. מרכז את דיודה הרכובה פולטות אור (LED) על מסלול מסירת האור.
    2. מדוד את עוצמת אור LED במישור המוקד האחורי ו במוצא של כל מטרה עם מד כוח בבחירת אורך הגל המתאים של 470 ננומטר.
    3. חשב את עוצמת האור ב mW / 2 מ"מ וליצור עקומת כיול (עוצמת LED (%) לעומת תפוקת האור (mW / מ"מ 2)) לכל מטרה עבור הערכים הנמדדים עבור 470 ננומטר אורך גל.
  2. תחזור פרוסת האמיגדלה חריפה מאולם ממשק המקום בתא הפרוס רכוב על גבי מיקרוסקופ הזקוף מצויד מנורת פלורסנט. תשמור על עצמך כדי למקם את הפרוסה כזו כי slicמשטח דואר פונה כלפי מעלה בתא הממשק גם הוא מופנה כלפי מעלה בחדר ההקלטה. Perfuse פרוסה עם ASCF טריים, מחומצן בשיעור של 1 - 2 מ"ל / דקה בטמפרטורה של כ -31 מעלות צלזיוס.
  3. שים סיבי presynaptic של הפרוסה באמצעות מנורת פלורסנט בשילוב עם מערכות סינון מתאימות עבור חלבון פלואורסצנטי הספציפי לידי ביטוי. השתמש המטרה 5x להשיג סקירה (איור 1E), ואובייקטיבי 60x להערכת צפיפות סיבים בתוך אזור היעד.
    הערה: GFP ו YFP, להגדיר מסנן השימוש "ירוק" (עירור 472/20, beamsplitter 495, פליטה 490 LP) עבור mCherry להשתמש במסנן להגדיר "אדום" (עירור 560/40, beamsplitter 585, פליטה 630/70) כמפורט בטבלת חומרים / ציוד.
  4. פתח או להגביל את הצמצם במסלול אור מיקרוסקופ כפי רצוי עבור הניסוי (איור 2 ד).
  5. כדי לקבל הקלטה תיקון, למלא פיפטה תיקון עם פתרון פנימי ו הר iבעל אלקטרודה n. החל לחץ חיובי פיפטה את התיקון ולאט לאט להוריד את זה קודם לתוך התמיסה אמבטיה ולאחר מכן תחת שליטה חזותית לתוך הפרוסה באמצעות micromanipulator.
    1. מתקרבים נוירון עניינים עם פיפטה את התיקון מהצד ומלמעלה. שחרר לחץ חיובי כאשר פיפטה על פני השטח של התא (גלוי גומה על פני התא) ולקבל "gigaseal" על ידי הפעלת לחץ שלילי.
    2. החל יניקה נוספת כדי לקרוע את קרום תיקון להשיג הקלטה כל תא. בהמשך לכך, לעורר סיבים שכותרתו עם LED המחוברים באמצעות אורך הגל המתאים להפעלת chr (470 ננומטר) בעת הקלטת תגובות חשמל מהתא.
    3. עבור גירוי הסינפטי להתחיל עם עוצמת LED נמוכה ולהגדיל עד משרעת הנוכחית הסינפטי הרצויה הוא הגיע. לעורר את LED על ידי הגדרת יציאות דיגיטליות בתוכנת רכישת נתונים לשלוט באורך העיתוי דופק (דוגמאות באיור3).
      הערה: תוכנות אחרות ו / או המניבה TTL התקנים יכולים לשמש כדי להפעיל LED.
  6. גירוי חזור עם צמצם פתוח או מוגבל (שלב 3.4) במסלול אור מיקרוסקופ כפי רצוי בתא הסמוך רשם ו / או בנוכחות תרופות ספציפיות.
  7. לאחר הקלטת, לתקן פרוסות לניתוח פוסט-הוק על ידי הרבדה אותם בין שני ניירות לסנן ו השריית אותם 4% PFA O / N.
  8. לנתח נתונים אלקטרו.
    הערה: תוכנה מתאימה השתמש כדי להמחיש נתונים לטאטא מוקלטים לכל מחובר גירוי יחיד. כאשר מנתחים השפעת סמים, השתמש רוטינות לגילוי השיא להשיג מהלך הזמן של אפקט התרופה על אמפליטודות הנוכחית הסינפטי עבור כל מטאטא הפרט. לקבוע מתי השפעת התרופה מגיעה למצב יציב. כדי להכין תשובות ממוצעות מייצגות עבור דמויות, להשתמש בתוכנה כדי ממוצע ≥10 מטאטא בודד לכל תנאי ניסוי (cf איור 3B-D, FHפנל ימני, J).
    הערה: מספר חבילות תוכנות חלופיות יכולות לשמש לניתוח נתונים.

ניתוח 4. פוסט-הוק של מוזרקים

  1. לשטוף פרוסות מוזרקות (משלב 2.12) והקלטת אתרים (אם הוא רצוי ההדמיה מחדש, משלב 3.7) שלוש פעמים PBS. הדבר נעשה על ידי החלפת פתרון שוב ושוב עם PBS הטרי על שייקר מסתובב שלוש פעמים במשך 10 דקות.
  2. כן פתרון אגר-אגר 2% ב PBS, ולתת לו להתקרר ~ 65 מעלות צלזיוס. פרוסות מקום שטוח על החלק התחתון של צלחת פטרי בקוטר קטן 30 מ"מ, להטביע הפרוסות-אגר אגר ולתת לו להתקרר עד מוצק.
  3. מדביק בלוק אגר עם פרוסה מוטבעת או פרוס לשלב של vibratome ומניח במת חיתוך קאמרי עם PBS.
  4. כריתה מוטבעת פרוסות עד 70 מיקרומטר עובי. אופציונלי: לאחר resectioning, יכול להיות מוכתם פרוסות, כלומר, עם Neurotrace לחשוף cytoarchitecture (איור 3 א, ג), ו / או במכתים immunofluorescence y עבור YFP או mCherry כדי להגביר את האות מן החלבון היתוך Chr.
  5. פרוסות הר בשקופיות ו coverslip עם תקשורת גוברת. המוזרקים תמונה, אם תרצה בכך, גם פרוסות תמונה המכיל סיבי בתחומי הקרנה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופ לייזר סריקה confocal (איור 2 א-ג).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

חלק זה מציג את זרימת העבודה של vivo לשעבר הגישה optogenetic ותוצאות נציג אסטרטגיות ניסויים שונים כדי לחקור את המאפיינים הפיזיולוגיים של תחזיות ארוכות טווח חושי modulatory כדי BLA ונוירונים mpITC וכן נכסים של קישוריות מקומית בין mpITC ו BLA.

לאחר הזרקת stereotactic של וקטור ויראלי שנבחר בחלק קואורדינטות הרצוי לתוך מוח העכבר (איור 1 א-ג, זמן ביטוי ויראלי 2 - 6 שבועות, תלויים בניסוי), פרוסות מוח חריפות של המוזרקים ויצירת אזורי הקרנה באמיגדלה ערוכים בזווית המתאימה ניסויי תיקון- מהדקים מאזור המוח מוזרק לניתוח פוסט-הוק של מוזרקים (1D איור). לפני שמתחיל הקלטות ואת גירוי optogenetic, תאים שכותרתו fluorescently או פרו אקסונליתjections באזור היעד (אמיגדלה) צריך להיבדק על מיקרוסקופ זקוף להקלטות-מהדק תיקון באמצעות מנורת פלורסנט המצורפת (איור 1E). כאשר קיבלו-מהדק תיקון הקלטה מתא היעד המשוערת באזור ההקרנה של הפרוסה, גירוי האור היא יזמה בעוד נקודת זמן, מרווח, ואת אורך הפולס נשלטים באמצעות תוכנת תיקון שמפעיל את דיודה פולטת אור (LED). בהתאם לאסטרטגיה הניסוי (איור 2 א-ג, מימין) הצמצם בנתיב אור פלורסנט או נפתח באופן מלא או מוגבל (איור 2 ד). תוך שמירה על אורך הפולס קבועים קצר ככל האפשר (רצוי ≤1 msec), עוצמת פלט LED הוא גדל לאט להעריך אילו עוצמת נדרש כדי להשיג את המשרעת הרצוי התגובה הסינפטי בניסוי מסוים (איור 2E). לאחר ההקלטה, פרוסות האמיגדלה הם פוסט-קבוע. עם resectioning ואופציונאליאתרי מכתים, הזרקת והקלטה הם צילמו על מיקרוסקופ confocal כדי לאמת מיקום ההזרקה לכלול נתונים מ זריקות במקומה. תמונות של מוזרקים ואת תחזיות axonal הקשורים באמיגדלה במשך שלוש אסטרטגיות הניסוי (תשומות mPFC כדי BLA, תשומות התלמוס כדי mpITCs, והפעלת mpITC המקומית) מוצגות באיור 2A-C.

איור 3 מציג תוצאות הקלטת נציג המתקבלות נוירונים העיקרי BLA, interneurons BLA מקומי נוירונים mpITC הממחישות את המאפיינים של תגובות אור עוררת עבור אסטרטגיות ניסוי השונות המשמשות (איור 3 א, E, I). כדי למקד נוירונים GABAergic (interneurons מקומי mpITCs) עבור הקלטה, עכברי כתב GAD67-GFP שמשו 24. לקבלת mPFC ותחזיות התלמוס חושית, מספר היבטים של העברה סינפטית ניתן ללמוד. הדיוק הזמני של activation ואת מאפייני הקינטית של ChRs השתמשו במחקר זה לאפשר גירוי אמין עם פולסים לזווג העוברים על פני מרווח בין גירוי של 50 מילי-שניות. זה מאפשר ניתוח של יחסים-לזווג דופק (PPR) של זרמי postsynaptic (PSCs), אשר יכולה להיות הקלה או מדכאים תלויים הקרנה וסוג תא המטרה, ומגישי כאינדיקטורים הסתברות שחרור presynaptic (האיור 3B, F, H) . בנוסף, ניתוח של latencies הסינפטי מאפשר לנתיחה של רכיבי תגובת postsynaptic שונים.

בדוגמא זו, latencies יותר של PSC המעכבות (IPSC) לעומת PSC המעורר (EPSC) רכיב מצביע על קלט disynaptic ו monosynaptic, בהתאמה (איור 3 ג). במקרים אחרים, ניתוח מעמיק יותר של נכסים נוספים EPSC כגון ריצוד תגובה או מקדם ההשתנות של גודל התגובה עשוי להיות נחוץ כדי להסיק מסקנות על מונו או disyna שלהטבע ptic 17,23. יתר על כן, יישום של חוסמים תרופתיים עבור קולטנים ספציפיים יכול לזהות את אופי PSCs (כלומר, EPSC glutamatergic ו GABAergic IPSC, איור 3 ג-ד). כצפוי, הרכיב מוקדם של קלט mPFC היה glutamatergic, ואילו מרכיב מאוחר היה GABAergic. הבלוק המלא של שני EPSC ו IPSC עם חוסם קולטן הגלוטמט CNQX תומך בהמשך כי IPSC הוא disynaptic. כדי לחקור אפנון של שידור הסינפטי ב סיבי מופעל optogenetically, את ההשפעות של אגוניסטים ואת היריבים לקולטני metabotropic (כאן קולטני GABA B) על משרעת ומקום מגורי הקבע ניתן להעריך להעריך השפעות באתרים טרום postsynaptic. בדוגמא זו, הירידה הקשורה של משרעת עם עלייה PPR מעידה על אפנון presynaptic של סיבי אור מופעל (3G, H). לבסוף, אינטראקציות מקומיות של תאי באמיגדלה ניתן להעריך, למשל,כאשר עכברים המבטאים Cre תחת שליטה של האמרגן Tac2 25 מוזרקים עם וקטור ויראלי להביע פעמיים floxed chr (תרשים 1C). בגלל Tac2 וכך, chr מתבטא mpITC ובאמיגדלה המרכזי (איור 2 ג), הפעלת אור הייתה מוגבלת של mpITC ידי סגירת צמצם פלורסנט נתיב אור (איור 2 ד). בתנאים אלה, פוטנציאל פעולה עורר אור ניתן שהושר mpITCs הנגוע. תגובות הסינפטי מעכבות חביון קצר BLA להעיד על הנוכחות של חיבור מעכבות תפקודי בין mpITC ו BLA נוירונים העיקרי.

איור 1
באיור 1. זריקות stereotactic, הכנת חריפת המוח פרוסה, ויזואליזציה של סיבי Presynaptic. (A, B) הזרקת וירוס stereotactic. א) תמונה של עכבר הרדים להציב מסגרת stereotactic עם גולגולת חשופה ואתפיפטה ההזרקה. הבלעה: זום בתמונה של פיפטה הזרקה מלאה פתרון וירוס מעורבב עם ירוק מהיר. סרגל קנה מידה: 3 מ"מ. (ב) סכמטי של גולגולת עכבר עם עמדות מסומנות לקדוח חורים באזורי הזרקה שונים. (C) Scheme מראה בונה ויראלי שונים ששימשו במחקר זה. אפור כהה: רצף האמרגן; כחול: Channelrhodopsin2 (ChR2 (H134R)); ירוק / אדום: חלבון פלואורסצנטי. זמן ביטוי היה 2 שבועות עבור תחזיות האמיגדלה מקומיות ו -4 - 6 שבועות עבור תחזיות מן mPFC ו- MGM / PIN. הכנה (D) של פרוסות מוח חריפות: Scheme מראה מיקום של מוח עכבר על במת מבצעה לקבלת פרוסות מאזורים הזרקה והשלכה שונות. (E) ויזואליזציה של סיבי פרוסות המוח חריפה מתוך עכבר GAD67-GFP מוזרק עם וירוס ChR2-mCherry ב MGM / PIN. תמונות מצולמות על המיקרוסקופ התיקון הזקוף עם סינונים שונים: ביטוי-GFP GAD67, באמצע; MGM / סיבים PIN שכותרתו עם mCהרים, נכון. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. mPFC, קליפת המוח הקדם חזיתית המדיאלי; mpITC, תאי intercalated paracapsular המדיאלי; BLA, האמיגדלה basolateral; MGM, גרעין הברכיתי המדיאלי, חלק המדיאלי; PIN, אחורי intralaminar גרעין התלמוס; LA, האמיגדלה לרוחב; BA, האמיגדלה בסיס; CEA, גרעין מרכזי של האמיגדלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
מוזרקי איור 2., תחומי הקרנה, ו optogenetic גירוי של תחזיות axonal. (AC) תמונות Confocal של מוזרקי נציג ואזורי הקרנה של BLA, וערכות של האסטרטגיות ניסיון. (א) משמאל: זריקת mPFC בעכבר C57Bl / 6 מוכתם Neurotrace. סרגל קנה מידה:500 מיקרומטר. תיכון: מקביל תחזיות של BLA ב פרוסת האמיגדלה נטויה. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. סכמטי של תאורת שדה השלמה של תחזיות mPFC והקלטה של ​​נוירון ב BLA: נכון. (ב) משמאל: זריקת MGM / PIN בעכבר GAD67-GFP. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. תיכון: תחזיות מקבילות mpITC ובלוס אנג'לס של פרוסת האמיגדלה עטרה. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. סכמטי של תאורת שדה השלמה של תחזיות MGM / PIN והקלטה של ​​נוירון mpITC: נכון. (C) משמאל: ביטוי מקומי של ChR2-YFP ב פרוסה האמיגדלה מוכתם Neurotrace של עכבר Tac2-Cre. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. הבלעה: הגדלה של mpITCs להביע ChR2-YFP. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. מימין: סכמטי של תאורה מוגבלת של האשכול והקלטת mpITC של נוירון BLA. (ד) תמונות של ההקלטה קאמרית במהלך הלידה אור ותמונה של נוירונים פרוסות המוח חריפה (אשכול mpITC) ב עכבר GAD67-GFP עם aper פתוח מוגבלture. סרגל קנה מידה: 30 מיקרומטר. (ה) זרמים סינפתטי (EPSCs) עורר על ידי עוצמות LED שונים (למעלה) העלילה של כוח האור לעומת עורר משרעת EPSC (למטה) מן נוירון mpITC נציג באקטיבציה optogenetic של סיבים MGM / PIN. סרגל קנה מידה: 100 PA / 10 msec.
הערה:. איור 2 א הוא שונה מההתייחסות # 16 ואיור 2C מהתייחסות # 23 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. תוצאות למופת מן optogenetic הפעלה ארוך טווח ותחזיות מקומיות. (א) תכנית של אסטרטגיה ניסיונית (BD). (ב) נציג EPSCs רשם נוירון העיקרי BLA וinterneuron BLA על גירוי לזווג דופק optogenetic (50 msec יתר עם עוררות יתר אינטרוולים) של סיבי mPFC לעורר לזווג הנחיית דופקת ודיכאון לזווג דופק, בהתאמה. סרגל קנה מידה: 100 PA / 25 msec. (ג) הפעלת optogenetic של סיבים mPFC מעוררת עיכוב feed-קדימה. מימין: נציג EPSC (ב -70 mV) ובהווה postsynaptic מעכבות (IPSC, ב 0 mV) ב נוירון העיקרי BLA. IPSC יש חביון הסינפטי יותר בהשוואה EPSC. ברי סולם: 200 PA / 10 msec ו -200 רשות / 2 msec. מימין: אור עורר בי-פאזית EPSC / רצף IPSC (ב -50 mV) נחסם על ידי אנטגוניסט AMPA / Kainate CNQX (10 מיקרומטר), ותומך הטבע disynaptic של IPSC. סרגל קנה מידה: 50 הרשות / 5 msec. אפקטים (D) של הגוש הבא של רצף EPSC / IPSC (ב -50 mV) על ידי Cl - ערוץ החוסם Picrotoxin (PTX, 100 מיקרומטר) PTX + CNQX. IPSC חסומה על ידי PTX ואת EPSC הנותרים ידי CNQX. ברי סולם: 50 רשות / 5 msec. (E) תוכנית של אסטרטגיה ניסיונית (FH). F) EPSCs נציג רשם מתוך mpITC ו נוירון BLA עיקרי על גירוי לזווג דופק optogenetic של סיבי MGM / PIN. סרגל קנה מידה: 50 הרשות / 20 msec. (G) EPSCs אחר נוירון mpITC נחסם ע"י חוסם ערוץ נתרן tetrodotoxin (TTX, 0.5 מיקרומטר), המציין כי הם תלויים פעילות ערוץ נתרן. סרגל קנה מידה: 50 הרשות / 20 msec. (H) תשומות התלמוס לנוירונים mpITC הם מווסתים על ידי קולטנים B GABA presynaptic. EPSCs בתנאי שליטה, ירידה של משרעת EPSC ו הגדלה מקבילה של היחס לזווג הדופק במהלך היישום של אגוניסט B GABA Baclofen (2 מיקרומטר), והתאוששות של שני משרעת הראשונית מנה הדופק לזווג כלפי חבריך יישום של CGP55845 אנטגוניסט B GABA (10 מיקרומטר). שינויים אלו מצביעים על אפנון presynaptic ידי קולטני GABA B. סרגל קנה מידה: 50 הרשות / 20 msec. (אני) תוכנית של אסטרטגיה ניסיונית (J). (J) אור עורר פוטנציאל פעולה רשמה נוירון ChR2-YFP להביע mpITC. האור עורר iPSCs רשם נוירון העיקרי BLA ב פוטנציאלי החזקה שונים (-90, -70, -50, -20, ו 0 mV) הפוך ברחבי פוטנציאל שיווי המשקל מחושב עבור Cl -. ברי סולם: 20 mV / 100 msec ו -10 PA / 10 msec. הערה:. איור 3 ב-D הוא שונה מן ההפניה # 16, והאיור 3H ו- J מהתייחסות # 23 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקירת vivo לשעבר optogenetic של מעגלים עצביים וקישוריות מקומית שניתן ליישם בקלות על רוב, אם לא כל, setups ההקלטה תיקון- clamp הפרוס זקוף על ידי לאבזר אותם עם ננומטר ~ 470 LED בנמל אור epifluorescence. יתרון עיקרי של גירוי optogenetic של תחזיות axonal בפרוסה הוא שהיא מאפשרת הפעלה ספציפית וחקירה של תכונות של קשרים שלא היו נגישים עם גירוי חשמלי קונבנציונלי, כי את שטחי סיבים המתאימים לא היו ידועים, אינו מוגדר בבירור, או לא נשמרו פרוסת מוח יחידה. כדוגמא מפתח רלוונטית עבור מעגלי פחד, זה מודגם איך זה יכול להיות מיושם לנתח מאפיינים של תשומות mPFC לאמיגדלה.

גם במקרים בם גירוי בדרכי סיבי חשמל כבר נעשה שימוש נרחב במחקרים בעבר, קטעים אלה לעתים קרובות לשאת סיבי מאזורים שונים ממוצא. לדוגמה, בתוך מעגלים הקשורים לפחד למידה, תחזיות מן חושית שונה גרעינים התלמוס או אזורים בקליפת המוח לרוץ התערבבו דרך קפסולות פנימיים וחיצוניים, בהתאמה. היתרון של גירוי optogenetic הוא בכך שהוא מאפשר הפעלה סלקטיבית של קבוצת משנה של סיבים מאזור מוגדר. זו באה לידי ביטוי לתשומות התלמוס ספציפיות מתוך PIN ו- MGM לתאי intercalated ואת התאים עיקריים האמיגדלה לרוחב. יתר על כן, בעיות נובעות עם גירוי חשמלי, כלומר, הפעלה של סיבים אחרים של מעבר או תאים בקרבת האלקטרודה המגרה שעשויה ליצור קשרים מקומיים באזור היעד ניתן להתגבר. עם זאת, בעוד גירוי optogenetic הוא מהיר באותה מידה כמו גירוי חשמלי, ייתכנו מגבלות לגבי תדירות הגירוי שניתן ליישם באופן מהימן. זה תלוי קינטיקה איון ו deinactivation ושל גרסה של chr אשר נמצא בשימוש, 4 וכן expressioרמות ושיטות n, ושיטות גירוי אור 26.

בעת שימוש LED רכוב לנמל הקרינה להבזקי האור, בדרך כלל את כל השדה של נוף של יעד נתון מואר, וכתוצאה מכך ההפעלה של כל סיבי או תאים בתחום ובתוך עומק מסוים. זה יכול להיות מוגבל רק באופן חלקי לאזור קטן או קבוצה של תאים שכותרתו (בדוגמא זו, mpITC) באמצעות צמצם בנתיב אור ניאון 23,27. עם נוריות, כוח האור הוא לא בעיה, כמו נוריות כחולות מתח גבוה זמינות כעת מיצרנים רבים. עם זאת, ספקטרום הפליטה יש ערכים מרביים וחצי ברוחב מלא של כמה עשרות ננומטרים. לכן, נוריות פוזת מגבלות וכשאחד גירוי מדויק מרחבית למיפוי subcellular של קישוריות ו / או גירוי מונוכרומטי הם רצויים. שניהם ניתן לשפר על ידי שימוש בלייזר כחול כמקורות אור, בדרך כלל בשילוב עם setups מתוחכמים יותר המאפשרים זפתgeting ו / או סריקה של הקרן באזורים קטנים ועומקי רקמות מוגדרים (למשל, לראות 28).

עם התקרבות optogenetic vivo לשעבר המתואר כאן, מספר מאפיינים של העברה סינפטית ניתן ללמוד. כדי להעריך monosynapticity של רכיב התגובה הסינפטי מוקדם, ניתוח מעמיק של latencies להתעצבן שלהם, וכן שונות משרעת תגובה צריך לשמש על מדגם מייצג של נוירונים מוקלטים (למשל, לראות 16,17,23). במקרים בם הפעלת פעילות רשת עשויה לשחק תפקיד, שיטת הבחירה היא לבודד את המרכיב הישיר monosynaptic ידי החלת שילוב של tetrodotoxin (TTX) לחסום פוטנציאל פעולה בשילוב עם חוסם ערוץ + K 4-aminopyridine (4- AP) כדי למנוע 14,28,29 repolarization. הקולטנים בתיווך רכיבים ובי-disynaptic תשומות ניתן לזהות באמצעות חוסמים תרופתיים. Furthermorדואר, אפשר ללמוד היבטים של אפנון presynaptic תשומות optogenetically המופעל באמיגדלה 23,30. הערת אזהרה היא כי פוטנציאל ChR2 יש כמה 1,4 חדירות סידן ההפעלה שלה בסיבי presynaptic ומסופי הוצעה לשנות הסתברות שחרור על ידי מנגנונים שונים 26,31. אף על פי כן, מספר מחקרים כולל דוגמאות שהובאו כאן בהצלחה מועסקת ביטוי ChR2 לזהות input- ולכוון הבדלי תא ספציפי ביחסים הדופק לזווג באמיגדלה אזור מוח אחר 16,23,26,32 ויתר על כן אפנון הפגין הסתברות שחרור על ידי הפעלה של מסלולי איתות ספציפיים מסופי presynaptic כי לא נמנע בגלל CHR ההפעלה 23,30. תמיכה נוספת מגיעה נתונים ההיפוקמפוס במוח קטן, מראה כי עם שיטת CHR הביטוי ההולמת וטכניקת גירוי אור, היבטים פיסיולוגיים כולל יעילות של שחרור ונאמנות oניתן ללמוד הילוכים הסינפטי ו מהימן 26. לבסוף, הפעלת סיבי optogenetic גם שימש בהצלחה ליישם פרוטוקולים גירוי המשרים 31,33,34 הפלסטיות הסינפטית.

כמה היבטים הם קריטיים להצלחת שיטה זו. אחת מהן הוא הדיוק של מיקוד stereotactic של וקטורים ויראליים. לכן, כדאי להעריך מיקום ההזרקה במהירות לפני קבלת הקלטות ולאחר מכן לבצע ניתוח שלאחר הוק מפורט יותר. בנוסף דיוק מרחבית, את הכדאיות של נוירונים באזור ההזרקה היא קובע עיקרי עבור ניסוי מוצלח תלוי טכניקת הזרקה. האפשרות הציגה, באמצעות אלקטרודות זכוכית ארוכות ודקות-קונים, משרתת היטב את המטרה הזו היא שטחיות אזור מוח עמוק יותר, אבל יכולה להיות חסרון, כי להתחדד הוא מאוד גמיש. חלופה אחת היא להשתמש מזרקי מיקרוליטר שפותחו במיוחד עבור משלוח stereotaxic במדעי המוח (נוירו-syringes) עם מחטים נוקשות יותר שיכול לוותר בנפחים קטנים. הספציפי של מיקוד CHR-ביטוי לסוגים ואזורי תא מוגדרים ניתן לשפר עוד יותר באמצעות משפט תנאי 7, למשל עם מערכת Cre כפי שמודגם עבור תאי intercalated האמיגדלה. זה גם מאפשר שימוש של יזמים חזקים וקטורים ויראליים Cre תלויים.

עוד היבט קריטי הוא הבחירה של וקטור ויראלי. כדי להביע chr, הווירוסים הקשורים מוקטורים (rAAVs) שמשו אשר יש את היתרון של להיות ברמת בטיחות ביולוגית 1 וקטורים בהשוואה למערכות ויראלי פופולריות אחרות. rAAVs שמש במשך כמה זמן הם וקטורים בטוחים ואמינים בדרך כלל עם כמיהות עצביות טובות מעט או ללא פוטנציאל immunogenic, אבל נפח האריזה שלהם מוגבל (כ. 4-5 kb) 35. בניסויים ספציפיים אלה, קפסיד 2/9 ו 2/1 שימשו ביטוי בכל מקום ומותנית, בהתאמה. בהתאם הספרות,se קפסיד transduce תאים באזור היעד, אבל להופיע שלא להיות נלקח על ידי אקסונים כדי retrogradely תאים תווית, בניגוד קפסיד 2/5 ו 2/6 36,37. עם זאת, ניסויים ראשוניים צריכים לשלול כי יש CHR שכותרתו גופי תא באזורים מקרינים על הזריקה, אשר חשוב במיוחד כאשר לומדים אזורים במוח קשורים הדדי כגון mPFC ובאמיגדלה. כמה מחקרים שנערכו לאחרונה לעומת היעילות של קפסיד rAAV באזורים שונים במוח אצל חולדות ועכברים 36,38,39. נושא מתעוררים הוא כי קפסיד חדש (למשל, 2/1, 2/8 ו 2/9) הוא בדרך כלל יעיל יותר מאשר 2/2 סרוטיפ המקורי. כן, יש לציין, rAAV בתיווך הביטוי של chr, בניגוד לשיטות אחרות, לא לגרום השפעות מזיקות על להביע תאים או אקסונים שכותרתו 40. שעת הביטוי הנדרשת כדי להשיג הפעלת סיבים יעילה vivo לשעבר שתלוי על המרחק של ההקרנה למדה. פה עולה בקנה אחד עם לייטrature, תיוג והפעלה של קשרים ארוך טווח של העכבר (mPFC ותשומות חושיות), זמן ביטוי של 4 - 8 שבועות יש צורך, ואילו ללימוד קישוריות מקומית באמיגדלה, פעמי ביטוי קצרות של 2 - 3 שבועות הם מספיק 14-17,23,30,34.

להקלטת תגובות optogenetically-שהושרו באזור היעד, שני גורמים קריטיים: 1) פרוסת המוח החריפה צריכה להיות באיכות טובה ו -2) כמות משמעותית של סיבים שכותרתו קיימא צריכה להישמר. איכות הפרוסות ניתן לשפר את המצב באמצעות להבי ספיר עבור חיתוך. שימור של אקסונים וכך, גודל ויציבות של תגובות אור ניתן לשפר על ידי חיתוך פרוס בזווית מסוימת כפי שמודגם על תחזיות mPFC-האמיגדלה (איור 1D ו 2 א) 16,34. עם זאת, זה מאוד תלוי האוריינטציה של afferents באזור היעד והוא יצטרך להיקבע עבור כל שילוב של שטח הקרנה ת"אr קבל באזור. מבחינה זו, ניתוח-הוק לתפקיד תחזיות באזור היעד יכול להיות שימושי. כדי לשפר זיהוי סיבי הלבנה עוקפת, אשר ייתכן שאירעה במהלך הגירוי פרוס, immunostaining נגד תג הניאון על חלבון היתוך CHR יכול להיות מועסק.

בסך הכל, בשיטה זו של מיפוי מעגל optogenetic לאחרונה לא יושמה רק לפחד מעגלים, אבל רבות למערכות אחרות במוח. בעתיד, מיקוד של subnuclei סוגי תאים ספציפיים על ידי שילוב מערך הולך וגדל של קווי עכבר מהונדסים גנטי וקטורים ויראליים מותנים יספק הבנה עוד יותר מפורט של מגוון נכסים הסינפטי תפקודיים של מעגלים לטווח ארוך ספציפיים מקומי. יתר על כן, פוסט-הוק immunolabeling של chr fluorescently- מתויג בחיבורים פונקציונליים נחקרו יכול להיות משולב עם ניתוח ultrastructural (כלומר, תוך שימוש בשיטות מיקרוסקופיות אלקטרונים) לספק תובנות מור מדויקנכסי phological של סינפסות מופעלת בעבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585 Filters can be bought as set F46-008
                     (emission) AHF, Germany F47-630 Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (emission) AHF, Germany F76-490 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (24), 13940-13945 (2003).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13, (4), 251-266 (2012).
  4. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, (1), 9-34 (2011).
  5. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, (5), 663-668 (2007).
  6. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, (6), 3166-3173 (2006).
  7. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).
  8. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).
  9. Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90, (2), 419-463 (2010).
  10. Myers, K. M., Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12, (2), 120-150 (2007).
  11. Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33, (1), 56-72 (2008).
  12. Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13, (6), 728-733 (2006).
  13. Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36, (2), 529-538 (2011).
  14. Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80, (6), 1491-1507 (2013).
  15. Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34, (47), 15601-15609 (2014).
  16. Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).
  17. Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10, (9), 1435-1442 (2015).
  18. Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning. Neuropharmacology. 52, (1), 215-227 (2007).
  19. Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62, (6), 757-771 (2009).
  20. Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247, (2), 246-271 (1986).
  21. Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31, (13), 5131-5144 (2011).
  22. Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234 (2012).
  23. Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86, (2), 541-554 (2015).
  24. Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467, (1), 60-79 (2003).
  25. Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, (2012).
  26. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34, (22), 7704-7714 (2014).
  27. Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16, (3), 332-339 (2013).
  28. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, (7233), 1142-1145 (2009).
  29. Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79, (4), 658-664 (2013).
  30. Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32, (42), 14815-14820 (2012).
  31. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4, (2), 139-141 (2007).
  32. Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76, (4), 790-803 (2012).
  33. Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14, (11), 1413-1415 (2011).
  34. Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31, (1), 339-345 (2011).
  35. Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4, (5), 353-364 (2003).
  36. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8, (9), (2013).
  37. Salegio, E. A., et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20, (3), 348-352 (2013).
  38. Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, (2014).
  39. McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109, (3), 838-845 (2009).
  40. Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, (2013).
<em>Ex Vivo</em> optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).More

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter