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Neuroscience

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

doi: 10.3791/53628 Published: April 5, 2016

Summary

光遺伝学アプローチは広く神経活動を操作し、脳機能の影響を評価するために使用されます。ここでは、この技術は、光活性化剤チャネルロドプシンのインビボでの発現の際に、恐怖に関連する回路内の特定の長距離およびローカル神経接続のシナプス特性のex vivo分析を可能にすることが概説されています。

Abstract

光遺伝学のアプローチは、現在広く光によって光活性化タンパク質と神経活動のその後の操作の標的発現を組み合わせることにより、神経集団や回路の機能を研究するために使用されています。 Channelrhodopsins(CHRS)は、光依存性カチオンチャネルであり、蛍光タンパク質に融合させたときに、それらの発現は、視覚化し、特定の細胞型の同時活性化と脳の定義された領域での軸索投射を可能にします。ウイルスベクターの定位注射によって、CHR融合タンパク質は、構成的にまたは条件規定された脳領域の特定の細胞で発現することができ、それらの軸索突起は、その後、脳切片におけるエクスビボ光遺伝学の活性化を介して、解剖学的及び機能的に研究することができます。従来の電気刺激の方法で対処することができなかった接続のシナプスの性質を理解することを目的とする場合に、または新規affeを識別する際に特に重要です以前に十分に理解された家賃と遠心性接続。ここでは、いくつかの例は、この技術が扁桃体に恐怖関連の回路の解明にこれらの質問を調査するために適用することができる方法を示しています。扁桃体は恐怖と感情的な思い出の取得と恐怖の表情、およびストレージのための重要な領域です。証拠の多くの行は、内側前頭前皮質(のmPFC)は恐怖の取得と絶滅のさまざまな側面に関与するが、扁桃体との正確な接続がちょうど理解され始めていることを示唆しています。まず、光遺伝学活性化は基底扁桃体(BLA)中のmPFCの求心性と標的細胞との間のシナプス伝達の側面を研究するために使用することができる方法をex vivoで示されています。また、このエクスビボ光遺伝学アプローチは、扁桃体においてGABA作動性ニューロンのグループを使用して新規の接続パターンを評価するために適用することができる方法を説明するが、一例としてparacapsularインターカレー細胞塊(mpITC)。

Introduction

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可視化および脳領域および神経細胞の特定のタイプとの間の特定の接続の同時活性化のための正確なツールは、健康な脳機能及び疾患状態の根底にある機能的接続性を理解する上でより重要になってきています。理想的には、これは、ニューロンが通信識別される正確なシナプス特性の生理学的な調査を必要とします。これは、単一の急性脳スライスに保存することができない脳の領域間の接続に特に当てはまります。過去において、これは、主に別の実験で達成されました。一方、 生体内で注入された神経トレーサーは、後続の光や前およびシナプス後パートナーの電子顕微鏡分析と組み合わせて使用されてきました。原点の領域からの線維トラクトがスライス標本に保存し、アクセスされたとき一方、電気刺激は、標的領域内の細胞とシナプス通信メカニズムを評価するために使用されています。

彼らの可視化を可能にし、事後解剖学的分析の1-ながら、光遺伝学の出現により、蛍光タンパク質に融合したようなChannelrhodopsins(CHRS)などの光依存性陽イオンチャネルの標的発現は、今ニューロンとその軸索軌道の活性化を可能にします4。線維路が分離または特定の軌道ではないので、1)従来の電気刺激によるアクセスできませんでした脳領域からの入力を評価:親細胞体5から切断場合でもCHRを発現する軸索は刺激することができるので、それはに脳スライスで可能です不明です。 2)明確に想定するが完全には理解された特定の入力の出身地域を特定します。そして、3)の両方のローカルおよび長距離の突起で、定義された細胞型の間の機能の接続性を調べます。そのため、多くの利点を、脳スライス内の回路のこの光遺伝学マッピングは、ワイドになっていますlyが最後の年で使用され、蛍光タグ付きCHRSの発現のための種々のウイルスベクターは、商業的な供給業者から容易に入手可能です。電気刺激はまた、通路または他の近くの細胞、および均等に迅速かつ時間的に正確な刺激の繊維を募集する可能性があるため、従来の電気刺激を超える光遺伝学活性化のいくつかの重要な利点は、刺激電極の配置、繊維の刺激の特異性に起因する組織への損傷はありません。さらに、ウイルスベクターの定位注射を容易Cre依存の発現および/ ​​または特異的プロモーター7を用いて達成することができる特定の脳領域6及び条件または細胞型特異的発現を標的とすることができます。ここでは、この技術は、恐怖システムにおける長距離のマッピングとローカル回路に印加されます。

扁桃体は恐怖と感情的な思い出8,9の取得と恐怖の表情、およびストレージのための重要な領域です。別にあちこち扁桃体、内側前頭前皮質(のmPFC)および海馬(HC)のmは、相互に扁桃体に接続されている構造は、恐怖や絶滅思い出10,11の買収、統合と検索の側面に関与しています。 mPFCの細分化における活性は12,13を述べてハイとローの両方の恐怖を制御する際に二重の役割を果たしていると思われます。これは、一部には扁桃体の活動と出力を制御することになる扁桃体へのmPFCからの直接接続によって媒介される可能性があります。そのため、最後の年に、いくつかの研究では、扁桃体14-17でのmPFCの求心性および特定の標的細胞間のシナプスの相互作用を調査するためにex vivoでスライス実験で始まりました。

恐怖学習中は、エアコンと無条件刺激についての感覚情報は、特定の視床と皮質領域からの突起を介して、扁桃体に到達します。 basolの側部(LA)内のニューロンへのこれらの入力の可塑性ateral扁桃体(BLA)が恐怖条件9,18の基礎なる重要なメカニズムです。増加する証拠は、扁桃体における並列プラスチックプロセスが恐怖記憶19を制御するための阻害要素を伴うことを示唆しています。クラスタ化された抑制性ニューロンのグループは、GABA作動性内側paracapsularインターカレーション細胞(mpITCs)であるが、その正確な接続性と機能が不完全20-22を理解されています。ここでは、光遺伝学の回路マッピングはmpITCsは視床と皮質中継局23からの直接の感覚入力を受け取ることを実証し、求心性および遠心性これらの細胞の接続と扁桃体における標的ニューロンへの影響を評価するために使用されます。 mpITCsまたはBLAニューロンにおけるCHRの特異的な発現を効果的BLAの活性を制御新規フィードフォワードとフィードバック抑制回路に置く、mpITCsを阻害することを明らかにし、局所的相互作用のマッピングを可能にするだけでなく、相互にBLA校長ニューロン、によって活性化されます23。

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Protocol

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倫理文は:すべての実験手順は、研究における動物の使用に関するEU指令に従ったと地元の動物実験委員会によって承認された(Regierungspräsidiumチュービンゲン、バーデン・ヴュルテンベルク州、ドイツの状態)テュービンゲン大学の責任。

1.定位注入手順

  1. 滅菌器を使用して滅菌ツール(はさみ、メス、クランプ、ドリル、針、縫合糸材料)を準備します。例えば滅菌外科用ドレープ上の滅菌綿スワップ、消毒、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)で、およびH 2 O 2のような滅菌ツールや他の必要なソリューションや手術用品を配置します。
  2. 製造元の指示に従って水平微小電極プラー上に幅3mmのボックスのフィラメントを使用して、注射剤( 図1A、挿入図)用ガラスマイクロピペットを引き出します。
    注:深い注射のために、電極のテーパーが十分でなければなりません腹最も座標に到達するのに長い(約5ミリメートル;座標のため、1.10を参照してください)​​。
  3. プレミックスウイルス溶液1μl及び滅菌PBS中の0.1%ファーストグリーン液0.2μlの(ガラスピペット内の溶液の優れた視認性のため)。先端の細い( 図1A、挿入図)とマイクロリットルピペットを使用してウイルス液と高速グリーンの混合物とガラスピペットを埋めます。
    注:組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAAVの)と協力はバイオセーフティーレベル1(BSL 1)仕事と考えられ、BSL 1実験室で実施する必要があります。この研究( 図1C)で使用rAAVsは以下の通りであった:1)のmPFC:のrAAV-HSYN-のChR2(H134R)-eYFP(血清型2/9)16。 2)MGM / PIN:のrAAV-CAGh-のChR2(H134R)-mCherry(血清型2/9)23。 3)mpITC / BLA:のrAAV-EF1A-DIOhChR2(H134R)-YFP(血清型2/1)23
  4. 小動物麻酔機(:誘導のための酸素中3%イソフルラン)を使用して、マウスを麻酔。
    注:この研究で使用したマウスは4でした -7週齢と以下の株と遺伝子型の:のC57Bl6 / J野生型( 図2A3A-Dでの実験)。 GAD67-GFP 24( 図2Bおよび3E-Hでの実験)。 TAC2-Creを25( 図2Cおよび3I-Jでの実験)。
  5. 耳と目の間に頭を剃ります。綿棒を使って剃った頭に消毒剤(ベース - イオジン)を適用します。
  6. 麻酔中に目の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。皮下鎮痛剤(メロキシカムベースの5mg / mlの溶液0.1 ml)でマウスを注入します。
  7. (:保守のための酸素中2%イソフルラン)定位フレーム( 図1A)でマウスを置き、ガス麻酔のマスクを介して麻酔を維持します。続行する前に肢引っ込め反射を使用して麻酔深度を確認してください。
    注:全体の外科手術中に無菌状態並びに可能を維持します。使い捨てフェイスマスクを着用し、手術用外出WN、および手袋。
  8. はさみを使って頭の上に皮膚切開を行います。優しく、鈍鉗子を使用して、側に皮膚を引っ張って頭蓋骨の表面を露出するようにクランプで固定し、そしてH 2 O 2とクリーン頭蓋骨。
  9. 図1B)両半球のための先端の細い油性マーカーとドリル穴を使用して頭蓋骨上のマーク注射部位。 (ブレグマ(ミリメートル)から)この研究での注射のためにされている座標:のmPFC:0.3±横前方1.9、腹2.1。 MGM / PIN:1.8±横、3.0事後、腹側3.8。 mpITC / BLA:3.35、および4.75腹±横、1.45後部。
  10. 圧力噴射装置に接続された定位フレーム上に充填されたガラスピペットをマウントし、ブレグマの位置にピペットをもたらします。
  11. ファインストレートチップピンセットを用いてガラスピペットの先端を折り。ウイルス溶液のエアロゾル発生を防止するために静かにこれを行います。いくつかの圧力パルスを印加し、ヴィルの液滴の押し出しを観察することにより、ピペットチップが開いていることを確認しますsのソリューション。
  12. 目標噴射座標に移動し、圧力噴射装置で次の設定を使用してピペットコンテンツ(〜0.5マイクロリットル)の半分を注入:圧力:20 psiで、平均パルス長さ:30ミリ秒、パルスの平均数:50。
  13. それを後退ゆっくり(1ミリメートル/分)の前〜1分間の場所にピペットを残します。
    注:必ずピペットは、他の半球で同じピペットで手順を繰り返す前にブロックされていないことを確認します。ブロックされたチップの場合には、クリーンまたは再びブレグマで先端とゼロピペット位置を断ちます。
  14. PBS(pH7.4)でクリーン頭蓋骨、一緒に皮膚を引っ張って、個々のボタンの縫合糸で切開部を縫合優しく、クランプを取り外します(3から4ノット)。傷の周りに消毒剤(ベース - イオジン)を適用します。
  15. 麻酔を停止し、それが完全に目を覚ましになるまで無人マウスを放置しないでください。単一収容さを維持するか、完全に回復するだけで他の動物の会社に戻ります。術後、健康状態を監視し続ける、とadminisター鎮痛剤必要に応じて。地元の動物実験委員会が提案したルールに従って手順に従ってください。

急性スライスの調製

  1. ACSF、切削液、ツール(はさみ、メス、鉗子、へら、パスツールピペット)、および寒天ブロックを準備します。
    注:人工脳脊髄液(ACSF)の1 Lは、実験ごとに必要であり、以前に公表16,23のように二重蒸留H 2 O中の化学物質を溶解することにより調製されます。切断溶液を2 M 硫酸マグネシウムストック溶液0.87 mlをACSF 200mlのを補充することによって調製されます。
  2. 含酸素ACSFおよび95%O 2および5%CO 2を用いて実験を通して溶液を切断します
  3. 深くイソフルラン(酸素中3%)を使用して、小動物麻酔機を用いてマウスを麻酔。続行する前に肢引っ込め反射を使用して麻酔深度を確認してください。
  4. 大きなハサミを用いてマウスを刎ねると、すぐに冷やします氷のように冷たい切削液中のヘッド。
  5. 吻側に尾からの単一の正中切開によるオープン頭蓋骨と優しく鉗子を使用して、側面に頭蓋骨の部分を押してください。急速にそっと小さな丸いスパチュラを用いて頭蓋骨からそれを持ち上げることにより、脳を削除します。メスで小脳をカット。氷のように冷たい切削液に脳を置きます。
  6. mPFCの注射部位の場合:(のmPFC含む)メスを用いて脳の前部を切断し、スライスまで氷冷切断溶液に入れました。
  7. 濾紙で余分な切削液を削除し、ビブラトームステージに脳の後部を接着。
  8. 傾斜扁桃体スライスについては、35°の角度( 図1D、中央)で切断寒天ブロック(4%)に脳を接着。冠状扁桃体スライス、MGM / PINの注射部位とのmPFCの注射部位については、ステージ上で直接脳を接着( 図1D、左、右)。スライスしながら、安定性のための脳の後ろに追加寒天ブロックを配置します。
  9. Plac冷却ユニットを用いて4℃に維持する氷冷酸素切削液でチャンバー切削Eステージ。サファイアブレードを用いて扁桃体(320ミクロン)の急性スライスを準備します。室温で酸素ACSFに付属のインターフェースチャンバー内のスライスを配置します。
  10. 45分 - 急性扁桃体スライスの調製後、35スライスを回復するために、36℃の水浴中でインターフェースチャンバーを配置。その後、RTにインターフェースチャンバーを返します。これらのスライスから記録するために、ステップ3.2に進みます。
  11. 急性扁桃体スライス( - 2.9 2.8ステップ)のために、前述したようにステップ2.10の開始時には、注射部位のスライスをカット。水浴内のスライスの回復は、ここで必要とされていません。オプション:すぐに蛍光灯や適切なフィルターセットを搭載したステレオスコープ上のスライスを観察し、注射部位の位置を推定するために。
  12. 2濾紙とsubmer間を挟んで事後分析のための注射部位を含むスライスを修正しました。PBS溶液をO / Nで4%パラホルムアルデヒド(PFA)でそれらを銀杏。注射部位の分析のためのステップ4.1に進みます。

シナプス前繊維の3可視化と刺激

  1. 繊維と細胞の光遺伝学活性化のためのパッチ顕微鏡を準備します。
    1. 光伝送路に取り付けられた発光ダイオード(LED)を中心。
    2. 後焦点面でのLEDの光強度を測定し、470nmでの適切な波長を選択するパワーメータとの各目的の出力で。
    3. ミリワット/ mm 2での光強度を計算し、470 nmの波長の測定値のための各目的のための(光出力(ミリワット/ mm 2)と対LEDの輝度(%))の検量線を作成します。
  2. 蛍光ランプを備えた正立顕微鏡に装着スライスチャンバー内のインターフェース室と場所から急性扁桃体スライスを取得します。このようなSLICそのスライスを配置するように注意してくださいインターフェースチャンバーに上向きE面は、記録チャンバー内に上向きに向いています。 〜31℃の温度で2 ml /分 - 1の割合で新鮮な、酸素ASCFでスライスを灌流。
  3. 発現される特異的蛍光タンパク質のための適切なフィルターセットとの組み合わせで蛍光灯を使用して、スライス内のシナプス前線維を観察します。概要( 図1E)を得るために5倍対物レンズを使用し、対象領域内の繊維密度の評価のために60倍対物レンズ。
    注:GFPとYFPの場合、使用フィルターセット「グリーン」(励起20分の472、ビームスプリッタ495、放射490 LP)mCherryをするために指定されているフィルタセット「赤」(励起40分の560、ビームスプリッタ585、放射70分の630)を使用します材料/機器テーブルインチ
  4. 開くか実験( 図2D)のために所望のように顕微鏡光路の開口を制限します。
  5. パッチ記録を入手するには、内部溶液でパッチピペットを記入し、私はマウントn電極ホルダー。パッチピペットに正の圧力を適用し、ゆっくりとマイクロマニピュレーターを用いて、スライスに視覚的な制御の下で最初に浴溶液にした後、それを下げます。
    1. サイドとトップからパッチピペットを用いて、関心のニューロンに近づきます。ピペットは、細胞の表面上にあるときに正の圧力を解放し(細胞表面上に目に見えるディンプル)と、負圧を適用することによって、「ギガシール」を得ます。
    2. 全細胞記録を得るために、膜パッチを破壊するために、さらに吸引を適用します。続いて、細胞からの電気的応答を記録しながらCHR(470 nm)を活性化するための適切な波長を使用して接続したLEDとラベルされた繊維を刺激します。
    3. シナプス刺激のために、低いLED強度で開始し、所望のシナプス電流振幅に達するまで増加します。 中の(タイミングやパルス長さを制御するためのデータ取得ソフトウェアでデジタル出力を設定することで、LEDの例をトリガー3)。
      注:他のソフトウェア及び/又はTTL発生装置は、LEDをトリガするために使用することができます。
  6. 次に記録セルのためおよび/または特定の薬物の存在下で所望のように顕微鏡光経路におけるオープンまたは制限された開口部(ステップ3.4)で繰り返し刺激。
  7. 記録した後、2枚の濾紙の間でそれらを挟んで、4%PFA O / Nでそれらを沈めることによって事後分析のためのスライスを修正します。
  8. 電気生理学的データを分析します。
    注意:使用して、適切なソフトウェアは、個々の刺激をオフライン用に記録されたスイープデータを視覚化します。薬物の効果を分析する場合、すべての個々のスイープのためのシナプス電流振幅に対する薬物効果の時間経過を得るために、ピーク検出ルーチンを使用します。薬剤効果が定常状態に達したときに決定します。実験条件ごとの平均≥10個々のスイープにソフトウェアを使用し、数値のための代表的な平均応答を準備する(CF 3B-D、FH、J右パネル)。
    注:いくつかの代替のソフトウェアパッケージは、データ分析のために使用することができます。

4.注射部位の事後分析

  1. (再イメージングは​​、ステップ3.7から、所望される場合)PBS中で3回の部位を記録する(ステップ2.12から)注射部位のスライスを洗ってください。これは、繰り返し10分間回転シェーカー上に新鮮なPBSで3回溶液を交換することによって行われます。
  2. PBS中の2%寒天溶液を調製し、そしてそれは〜65℃に冷却しましょう​​。小さな直径30mmのペトリ皿の底に平らな場所スライスは、寒天内のスライスを埋め込み、それが固体になるまで冷却しましょう​​。
  3. ビブラトームのステージに埋め込まれたスライスまたはスライスと寒天ブロックを接着し、PBSでチャンバーを切断内のステージを配置します。
  4. 切除70μmの厚さにスライスを埋め込まれました。オプション:切除した後、切片を細胞構築( 図3A、C)、および/ ​​またはBを明らかにするNeurotraceと、 すなわち 、染色することができますYFPまたはmCherryをするためのyの免疫蛍光染色は、CHR融合タンパク質からの信号をブーストします。
  5. 取り付けメディアとスライドとカバースリップ上のマウントスライス。画像注射部位と、所望であれば、蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査顕微鏡( 図2A-C)を用いて投影領域内の繊維を含む、画像スライス。

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Representative Results

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このセクションでは、ex vivo光遺伝学アプローチと感覚と調節長距離BLAとmpITCニューロンへの突出部だけでなく、mpITCとBLA間のローカル接続のプロパティの生理学的特性を調査するために、異なる実験戦略の代表的な結果のワークフローを示しています。

マウス脳への所望の座標に選択されるウイルスベクターの定位注射した後( 図1A-C、ウイルス発現時間は2から6週間は、実験に応じて)、扁桃体における注射部位と投影領域の急性脳スライスが用意されていますパッチクランプ実験のために適切な角度で、注入部位( 図1D)の事後分析のために注入された脳領域から。録音や光遺伝学の刺激を開始する前に、蛍光標識された細胞または軸索のプロターゲット領域(扁桃体)でjectionsが結合した蛍光ランプ( 図1E)を使用して、パッチクランプ記録のための正立顕微鏡で確認する必要があります。時点、間隔、パルス長は、発光ダイオード(LED)をトリガパッチソフトウェアを介して制御しながらスライスの投影領域内の推定上の標的細胞からの記録パッチクランプを得ると、光刺激が開始されます。実験戦略に応じて( 図2A-Cは 、右)蛍光灯路の開口部を全開または( 図2D)に制限されますか。一定できるだけ短いパルス長(理想的に≤1ミリ秒)を維持しながら、LEDの出力強度は徐々に特定の実験( 図2E)におけるシナプス応答の所望の振幅を達成するために必要とされる強度を評価するために増加されます。記録した後、扁桃体スライスは後固定されています。切除およびオプションの時に染色、注射および記録部位は、注入位置を確認し、見当違いの注射からデータを除外するために共焦点顕微鏡上に結像されています。注射部位の画像と3つの実験戦略のための扁桃体の関連する軸索突起部(BLAへのmPFC入力、mpITCsに視床入力、およびローカルmpITC活性化)は、 2A-Cに示されています。

図3( 図3A、E、I)を使用し、異なる実験戦略のための光誘発反応の特性を示すBLA主要なニューロン、地元のBLAの介在ニューロンとmpITCニューロンから得られた代表的な記録結果を示しています。記録のためのGABA作動性ニューロン(ローカル介在ニューロンとmpITCs)を標的にするには、GAD67-GFPレポーターマウスは、24を使用しました。 mPFC感覚視床突起は、シナプス伝達のいくつかの側面を研究することができます。交流の時間精度tivati​​onと本研究で用いたCHRSの力学的特性は、50ミリ秒の間刺激間隔でパルス対を持つ信頼性の高い刺激を可能にします。これは、容易に又は押圧突起に応じて、細胞のタイプを標的とすることができるいずれかのシナプス後電流(のPSC)の対のパルス比(PPR)の分析を可能にし、シナプス前放出確率( 図3B、F、H)の指標として機能します。さらに、シナプス待ち時間の分析は、異なるシナプス後応答コンポーネントの解剖を可能にします。

この例では、興奮PSC(EPSC)コンポーネントに対する阻害PSC(IPSC)の長い待ち時間は( 図3C)は、それぞれ、disynapticと単シナプス入力を示しています。他の例では、このような応答のジッタまたは応答の大きさの変動係数などの追加EPSC特性のより完全な分析は、モノ - またはdisynaに関する結論を引き出すために必要とされてもよいですPTIC自然17,23。また、特定の受容体のための薬理学的遮断薬のアプリケーションはのPSCの性質を識別することができる( すなわち 、グルタミン酸作動性EPSCとGABA作動性IPSC、 図3C-D)。予想されたように後半成分はGABA作動性であったのに対し、のmPFC入力の初期成分は、グルタミン酸作動しました。さらにグルタミン酸受容体遮断薬CNQXとEPSC及びIPSCの両方の完全なブロックがIPSCがdisynapticであることをサポートしています。 optogenetically活性化した繊維でシナプス伝達の変調を調査するために、振幅およびPPR上の代謝調節型受容体(ここではGABA B受容体)に対するアゴニストおよびアンタゴニストの効果は、前と後シナプス部位への影響を評価するために評価することができます。この例では、PPRの増加と振幅の同時減少は、光活性化繊維(3G、H)のシナプス前調節の指標です。最後に、扁桃体中の細胞の局所的相互作用を評価することができ、例えば、TAC2プロモーター25の制御下のCreを発現するマウスは、ウイルスベクターを発現ダブルフロックスCHR( 図1C)を注射されたとき。 TAC2したがって、CHRはmpITCと中央扁桃体( 図2C)で表現されているので、光活性化は、蛍光灯路開口( 図2D)を閉じることによってmpITCに制限されていました。これらの条件下で、光誘発活動電位は、感染mpITCsにおいて誘発することができます。 BLAで短い待ち時間の抑制性シナプス応答がmpITCとBLA主要なニューロン間の機能の阻害の接続の存在を示します。

図1
図1.定位注射、急性脳スライスの作製、およびシナプス前繊維の可視化。(A、B)定位ウイルス注入。頭蓋骨と定位フレームに配置された、麻酔したマウスのA)画像が露出し、注入ピペット。挿入図:高速グリーンと混合ウイルス液で満たされた注入ピペットの絵でズーム。スケールバー:3ミリメートル。異なる注入領域のためのドリル穴のマーク付けされた位置でマウスの頭蓋骨の(B)の回路図。 (C)スキームは、本研究で使用した異なるウイルス構築物を示します。ダークグレー:プロモーター配列;青:Channelrhodopsin2(にChR2(H134R));赤/緑:蛍光タンパク質。 mPFCとMGM / PINからの投影のための6週間 - 発現時間は、ローカルの扁桃体の凸部および4の2週間でした。 (D)急性脳切片の調製:スキーム異なる注入と投影領域からスライスを得るためのスライサーステージにマウス脳の配置を示します。 (E)MGM / PINでのChR2-mCherryをウイルスを注射したGAD67-GFPマウスから急性脳スライス中の繊維の可視化。写真は、異なるフィルタセットで直立パッチ顕微鏡で撮影されていますGAD67-GFP発現、ミドル。 MCに標識されたMGM / PIN繊維herry、右。スケールバー:200μmです。 mPFC、内側前頭前皮質; mpITC、内側paracapsularインターカレート細胞; BLA、基底外側扁桃体。 MGM、内側膝状核、内側部; PIN、視床核髄板内後部; LA、横扁桃体。 BA、基底扁桃体。 CEA、扁桃体の中心核が。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2. 注射部位、投影領域、および軸索投射の光遺伝学刺激。(AC)BLAにおける代表的な注射部位と投影領域の共焦点画像、及び実験戦略のスキーム。左(A):Neurotraceで染色されたC57BL / 6マウスでのmPFCの注射部位。スケールバー:500ミクロン。ミドル:傾斜扁桃体スライスにBLAで突起部を対応します。スケールバー:200μmです。右:のmPFC突起とBLAにおけるニューロンの記録の全視野照明の模式図。左(B):GAD67-GFPマウスのMGM / PINの注射部位。スケールバー:500μmで。ミドル:mpITCと冠状扁桃体スライスのLAでの対応の投影。スケールバー:200μmです。右:mpITCニューロンのMGM / PINの突起及び記録の全視野照明の模式図。 (C)左:TAC2-のCreマウスのNeurotrace染色扁桃体スライス内のChR2-YFPのローカル式。スケールバー:200μmです。挿入図:ズームにChR2-YFPを発現しているmpITCsのインチスケールバー:20μmです。右:BLAニューロンのmpITCクラスタと記録の制限された照明光の概略図。オープンで制限APERとGAD67-GFPマウスにおける急性脳スライスにおけるニューロンの光伝送および画像(mpITCクラスタ)中にチャンバを記録する(D)の写真チャー。スケールバー:30μmです。異なるLED強度(上)とMGM / PINからの繊維の光遺伝学活性化の際に代表mpITCニューロンから誘発EPSC振幅(下)対光パワーのプロットにより誘発される(E)興奮性シナプス後電流(EPSCs)。スケールバー:100 PA / 10ミリ秒。
図2Aは、参照番号23からの基準#16および図2Cから変更されます注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
光遺伝学ロングレンジの活性化と地域突起から図3.代表的な結果。(BD)のための実験戦略の(A)スキーム。 (B)BLA主要なニューロンから記録された代表EPSCsとそれぞれ、対のパルスの円滑化と対になっパルスうつ病を誘発するのmPFCからの繊維の光遺伝学ペアのパルス刺激(50ミリ秒刺激間間隔)時のBLA介在ニューロン。スケールバー:100 PA / 25ミリ秒。 (C)のmPFCからの繊維の光遺伝学活性化は、フィードフォワード抑制を誘発します。左:代表(-70 mVの時)EPSCとBLAプリンシパルニューロンにおける抑制性シナプス後電流(0 mVのでIPSCを、)。 IPSCは、EPSCに比べ長いシナプス待ち時間を有します。スケールバー:200 PA / 10ミリ秒と200 PA / 2ミリ秒。右:光はさらにIPSCのdisynaptic性質をサポートする、AMPA /カイニン酸拮抗薬CNQX(10ミクロン)によってブロックされている(-50 mVの時)二相性EPSC / IPSCシーケンスを誘発しました。スケールバー:50 PA / 5ミリ秒。 (D)CLにより(-50 mVの時)EPSC / IPSCシーケンスの次のブロックの影響-チャネルブロッカーピクロトキシン(PTX、100μM)及びPTX + CNQX。 IPSCはPTXとCNQXによって残りのEPSCによってブロックされています。スケールバー:50 PA / 5ミリ秒。 (以下のための実験戦略のE)スキーム(FH)。 F)mpITCおよびMGM / PINからの繊維の光遺伝学ペアのパルス刺激によるBLA主要なニューロンから記録された代表的EPSCs。スケールバー:50 PA / 20ミリ秒。別のmpITCニューロンにおける(G)EPSCsは、それらがナトリウムチャネルの活性に依存していることを示す、ナトリウムチャネル遮断薬テトロドトキシン(TTX、0.5μM)によってブロックされます。スケールバー:50 PA / 20ミリ秒。 (H)mpITCニューロンへの視床入力はシナプス前 GABA B受容体によって調節されています。制御条件の下でEPSCs、GABA Bアゴニストバクロフェン(2μM)の適用時にペアリングパルス比のEPSC振幅と同時増加の減少、および両方の振幅の回復とのGABA Bアンタゴニスト CGP55845の同時適用時にペアリングパルス比を初期(10μM)。これらの変化は、GABA B受容体によるシナプス前調節の指標です。スケールバー:50 PA / 20ミリ秒。 (J)の実験戦略(I)スキーム。 ChR2-YFPを発現mpITCニューロンから記録(J)光誘発活動電位。異なる保持電位でBLAの主要なニューロンから記録された光誘発性IPSC(-90、-70、-50、-20、および0 mVの)のClのための計算された平衡電位の周りに逆- 。スケールバー:20 mVの/ 100ミリ秒と10 PA / 10ミリ秒。図3B-Dが基準#23からリファレンス#16、および図3H及びJから変更されます注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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このプロトコルは、すべてではない簡単に、最も上に実装することができ、神経回路やローカル接続のex vivo光遺伝学調査のための方法を説明し、落射蛍光光ポートのLED〜470 nmのとそれらを装備することにより、直立スライスパッチクランプ記録のセットアップ。スライスにおける軸索突起の光遺伝学刺激の主な利点は、対応する線維路が明確に定義されていない、またはに保存されない、知られていなかったので、それは、特定の活性化と、従来の電気刺激とアクセスできませんでした接続の特性の調査を可能にすることです単一の脳切片。恐怖回路に関連する重要な一例として、扁桃体へのmPFC入力の特性を分析するために適用することができる方法を例示します。

電気的な線維トラクト刺激が広く、過去の研究に使用されている場合であっても、これらの管は、多くの場合、起源の異なる領域からの繊維を運びます。例えば、学習を恐れるように関連する回路には、視床核や皮質領域の異なる感覚からの突起がそれぞれ、内部および外部のカプセルを通じて混在して実行します。光遺伝学刺激の利点は、それが定義された領域からの繊維のサブセットの選択的活性化を可能にすることです。これは、インターカレートされた細胞と横扁桃体の主要な細胞へのPINとMGMからの特定の視床入力のために示されています。また、電気刺激、 すなわち 、標的領域内のローカル接続を行うことができる刺激電極の近傍内の通路またはセルの他の繊維の活性化に起因する問題を克服することができます。光遺伝学刺激は、電気刺激と同等に迅速であるが、確実に適用することができる刺激周波数に関する制限があってもよいです。これは、不活性化およびdeinactivation動力学にと使用されているCHRの変形に依存4と同様にexpression個のレベルや方法、および光刺激法26。

光刺激用の蛍光ポートに取り付けられたLEDを使用する場合、典型的には、与えられた対物レンズの視野全体は、フィールドおよび特定の深さ内のすべての繊維または細胞の活性化をもたらす、照明されます。これは、部分的にのみ小さな領域に限定または標識された細胞を設定することができる(この例では、mpITC)蛍光路23,27の開口を使用して。ハイパワー青色LEDは、現在、多くの製造業者から入手可能であるようにLEDを、光パワーは、問題ではありません。しかしながら、発光スペクトルは、数十ナノメートルの全幅半最大値を有します。接続および/または単色刺激の細胞内マッピングのための空間的に正確な刺激のいずれかが必要なときにそのため、LEDは、制限を課します。両方は、典型的には、タールを有効に、より洗練されたセットアップと組み合わせて、光源として青色レーザを使用することによって改善することができますgetingおよび/ ​​または小領域におけるビームの走査と定義された組織の深さ( 例えば 、28を参照てください)。

エクスビボ光遺伝学アプローチは、ここで説明すると、シナプス伝達のいくつかの特性を研究することができます。初期のシナプス応答成分、待ち時間の徹底的な分析とそのジッタのmonosynapticityだけでなく、応答振幅の分散を評価するために記録したニューロン( 例えば 、16,17,23を参照のこと )の代表的なサンプルで使用する必要があります。ネットワーク活動の活性化が役割を果たし得る場合には、選択の方法は、(K +チャネルブロッカー4-アミノピリジンと組み合わせて活動電位を遮断するためのテトロドトキシン(TTX)の組み合わせを適用することによって直接単シナプスの成分を分離するために4- AP)は、再分極14,28,29を防止します。入力のモノとdisynapticコンポーネントを媒介する受容体は、薬理学的遮断薬を用いて同定することができます。 FurthermorEは、扁桃体23,30にoptogenetically活性化入力のシナプス前調節の側面を研究することが可能です。潜在的な注意点はにChR2は、いくつかのカルシウム透過性1,4を有しており、シナプス前繊維と端末におけるその活性化は、様々な機構26,31によって放出確率を変更することが提案されていることです。それにもかかわらず、実施例を含め、いくつかの研究では、就業のChR2発現インプット識別し、扁桃体や他の脳領域16,23,26,32における対になったパルス比で細胞特異的な違いをターゲットに成功し、ここで示されており、さらに活性化によって放出確率の変調を実証しましたCHR活性化23,30によって排除されなかったシナプス前終末における特定のシグナル伝達経路の。さらにサポートが適切なCHRの表現方法と光刺激法でいることを示す海馬および小脳内のデータ、リリースの有効性と忠実度oを含む生理的な側面から来ていますFシナプス伝達は確実に26を研究することができます。最後に、光遺伝学繊維の活性化は、正常なシナプス可塑性31,33,34を誘導する刺激プロトコルを適用するために使用されています。

いくつかの態様は、この方法の成功のために重要です。一つは、ウイルスベクターの定位ターゲティングの精度です。したがって、迅速に記録を取得する前に注射部位の位置を評価し、次に、より詳細な事後分析を実行するために有用です。空間的な精度に加えて、注射部位でのニューロンの生存性は、成功した実験の主要な決定因子であり、注入法に依存します。長くて細いテーパ状のガラス電極を使用して提示オプションは、表在性とより深い脳領域の両方のためにも、この目的を果たしますが、テーパーが非常に柔軟であるという欠点を有していてもよいです。代替案は、特に神経科学(神経s内の定位送達のために開発されたマイクロリットルの注射器を使用することですyringes)小さな体積を分配することができ、より剛性の針を持ちます。扁桃体インターカレー細胞について示されているように定義された細胞型と地域にCHR発現を標的とする特異性をさらにCreをシステムで、例えば、条件式7を使用して向上させることができます。これはまた、Cre依存ウイルスベクターでの強力なプロモーターを使用することができます。

もう一つの重要な側面は、ウイルスベクターの選択です。 CHRを発現させるために、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAVs)は、他の人気のあるウイルス系に比べてバイオセーフティーレベル1のベクトルであることの利点を持っているものを用いました。 rAAVsはいくつかの時間のために使用されており、良好な神経向性とほとんど、あるいは全く免疫原性と安全性と信頼性ベクターは、一般的であるが、それらの包装ボリュームが(約4〜5 KB)35制限されています。これらの特定の実験では、血清型2/9及び2/1は、それぞれ、ユビキタスかつ条件式に使用しました。文献によれば、SEの血清型は、標的領域内の細胞を形質導入するが、血清型2/5及び2/6 36,37とは異なり、標識細胞を逆行する軸索によって取り込まれないように見えます。しかし、最初の実験では、このようなのmPFCや扁桃体などの相互に接続された脳の領域を研究する際に特に重要である注射部位に突出した領域におけるCHR標識細胞体が存在することを除外してください。いくつかの最近の研究は、ラットおよびマウス36,38,39中の異なる脳領域でのrAAV血清型の有効性を比較しました。新興テーマは新しい血清型( 例えば 、2/1、2/8と2/9)は、一般的に、元の2/2の血清型よりも効率的であるということです。またノートの、CHRののrAAV媒介発現は、他の方法とは対照的に、細胞または標識軸索40を表現するに有害な影響を引き起こしませんでした。 ex vivoで有効繊維の活性化を達成するために必要な発現時間を研究突起の距離に依存するように思われます。こことライトと一致してマウス(のmPFCと感覚入力)での長距離接続の標識及び活性化のためrature、4の発現時間 - 8週間が必要とされ、扁桃体でのローカル接続性を研究するために、2の短い発現時間に対し - 3週間がされています14-17,23,30,34十分。

対象地域のoptogenetically誘発応答の記録のために、2つの要因が重要である:1)急性脳スライスは良い品質と2)実行可能なラベルされた繊維のかなりの量を保存する必要があることが必要です。スライスの品質をスライスするためのサファイアブレードを使用することによって改善することができます。光反応の軸索の維持、従って、大きさ及び安定性のmPFC-扁桃体突起( 図1Dおよび図2A)16,34のために示されているように一定の角度でスライスを切断することによって改善することができます。しかし、これは、強く、標的領域内の求心性神経の方向に依存し、投影領域およびTAの各組み合わせについて決定されなければなりません目標確認地域。この点において、標的領域における凸部の事後分析が有用であることができます。繊維の検出を強化し、スライス刺激中に発生した漂白を回避するために、CHR融合タンパク質に蛍光タグに対する免疫染色を用いることができます。

全体的に、光遺伝学回路マッピングのこの方法は、最近だけで脳内の回路が、他の多くのシステムを恐れるように適用されていません。将来的には、遺伝的に改変されたマウス系統および条件付きウイルスベクターの増加配列を組み合わせることによりsubnuclei、特定の細胞型の標的化は、特定のローカル及び長距離回路の機能的シナプスの性質の多様性のより一層詳細な理解を提供するであろう。また、調査し、機能の接続における蛍光タグ付きCHRの事後免疫標識は、超微細構造解析と組み合わせることができる( すなわち 、電子顕微鏡法を使用して)正確なMORへの洞察を提供するために、以前に有効にシナプスのphological特性。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585 Filters can be bought as set F46-008
                     (emission) AHF, Germany F47-630 Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (emission) AHF, Germany F76-490 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

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References

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脳スライスにおける恐怖回路の<em>ex vivo</em>光遺伝学解剖
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Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).More

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

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