Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Ex Vivo optogenetic Disseksjon av Fear kretser i hjernen skiver

doi: 10.3791/53628 Published: April 5, 2016

Summary

Optogenetic tilnærminger er mye brukt for å manipulere nevral aktivitet og vurdere konsekvenser for hjernefunksjonen. Her blir en teknikk skissert som ved in vivo-ekspresjon av det optiske aktivator Channelrhodopsin, gjør det mulig for ex vivo analyse av synaptiske egenskaper av spesifikk lang rekkevidde og lokale nerveforbindelser i frykt-relaterte kretser.

Abstract

Optogenetic tilnærminger er nå mye brukt for å studere funksjonen av nevrale populasjoner og kretser ved å kombinere målrettet ekspresjon av lys-aktiverte proteiner og påfølgende manipulering av nevral aktivitet av lys. Channelrhodopsins (CHRS) er lys-gated kation-kanaler, og da kondensert til en fluorescent protein deres ekspresjon tillater visualisering og samtidig aktivering av spesifikke celletyper og deres aksonale projeksjoner i definerte områder av hjernen. Via stereotaktisk injeksjon av virale vektorer, kan Chr fusjonsproteiner bli konstitutivt eller betinget uttrykt i bestemte celler i et definert hjernen regionen, og deres aksonale projeksjoner kan senere bli studert anatomisk og funksjonelt via ex vivo optogenetic aktivering i hjernen skiver. Dette er spesielt viktig når som mål å forstå synaptiske egenskaper av forbindelser som ikke kunne løses med konvensjonelle elektriske stimulerings tilnærminger, eller i å identifisere roman affeleie og efferente tilkobling som tidligere dårlig forstått. Her noen eksempler illustrerer hvordan denne teknikken kan brukes til å undersøke disse spørsmålene til å belyse frykt-relaterte kretser i amygdala. Amygdala er en viktig region for kjøp og uttrykk for frykt, og lagring av frykt og emosjonelle minner. Mange linjer av bevis tyder på at den mediale prefrontale cortex (MPFC) deltar i ulike aspekter av frykt oppkjøp og utryddelse, men dens presise tilkobling med amygdala er akkurat begynt å bli forstått. For det første er det vist hvordan ex vivo optogenetic aktivering kan brukes til å studere aspekter av synaptisk kommunikasjon mellom MPFC afferente og målceller i basolateral amygdala (BLA). Videre er det illustrert hvordan dette ex vivo optogenetic tilnærmingen kan brukes til å vurdere nye tilkoblings mønstre ved hjelp av en gruppe av GABAergiske neuroner i amygdala, den paracapsular interkalert celleklase (mpITC), som et eksempel.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Presise verktøy for visualisering og samtidig aktivering av spesifikke forbindelser mellom hjerneområder og spesifikke typer nerveceller blir mer viktig for å forstå de funksjonelle tilkoblingsunderliggende friske hjernens funksjon og sykdomstilstander. Ideelt sett innebærer dette fysiologiske undersøkelser av presise synaptiske egenskaper som er identifisert nerveceller kommuniserer. Dette gjelder særlig for forbindelser mellom hjerneområder som ikke kan ivaretas i en enkelt akutt hjerne skive. I det siste har dette blitt oppnådd i stor grad i separate forsøk. På den ene siden, neural tracere injiseres in vivo er blitt anvendt i kombinasjon med etterfølgende lys eller elektronmikroskopanalyse av pre- og postsynaptisk partnere. På den annen side, når fiber traktene fra regionen opprinnelse er bevart og er tilgjengelige under fremstillingen skive, elektrisk stimulering har vært brukt for å vurdere synaptiske mekanismer kommunikasjon med celler i målområdet.

Med bruk av optogenetics, målrettet uttrykk for lys-gated sjons-kanaler, for eksempel Channelrhodopsins (CHRS) smeltet til fluorescerende proteiner gjør nå aktivering av nevroner og deres aksonal baner samtidig som for sin visualisering og post-hoc anatomisk analyse 1- 4. Fordi CHR-uttrykk axoner kan stimuleres selv når skilt fra moder somata 5, er det mulig i hjerneskiver til: 1) å vurdere innganger fra hjerneområdet som ikke var tilgjengelig med vanlig elektrisk stimulering, fordi fiberkanalen ikke er separerbare eller den bestemte bane er ikke kjent; 2) utvetydig identifiserer regionen er utstedt på bestemte innganger som ble postulert men ufullstendig forstått; og 3) undersøke den funksjonelle tilkobling mellom definerte celletyper, både lokalt og i langtrekkende anslag. På grunn av en rekke fordeler, har denne optogenetic kartlegging av kretser i hjerneskiver blir bredly anvendt i de siste år, og en rekke virale vektorer for ekspresjon av fluorescently-merket CHRS er lett tilgjengelige fra kommersielle leverandører. Noen viktige fordeler med optogenetic aktivering over konvensjonelle elektrisk stimulering er ingen skade på vev på grunn av plassering av stimuleringselektroder, spesifisitet av fiber stimulering fordi elektrisk stimulering kan også rekruttere fibre av passasje eller andre nærliggende celler, og en like rask og timelig presis stimulering. I tillegg kan stereotaktisk injeksjon av virale vektorer lett bli målrettet til spesifikke hjerneområder 6 og betinget eller celletype-spesifikk ekspresjon kan oppnås ved hjelp av Cre-avhengig ekspresjon og / eller mer spesifikke aktivatorer 7. Her er denne teknikken brukes for kartlegging av langtrekkende og lokale kretser i frykt systemet.

Amygdala er en viktig region for kjøp og uttrykk for frykt, og lagring av frykt og emosjonelle minner 8,9. bortsett from amygdala, den mediale prefrontale cortex (MPFC) og hippocampus (HC), strukturer som er gjensidig knyttet til amygdala, er innblandet i aspekter av oppkjøp, konsolidering og gjenfinning av frykt og utryddelse minner 10,11. Aktivitet i underinndelinger av MPFC ser ut til å spille en dobbelt rolle i å kontrollere både høy og lav frykt fastslår 12,13. Dette kan delvis være mediert av direkte forbindelser fra MPFC til amygdala som ville kontrollere amygdala aktivitet og produksjon. Derfor, i de siste årene har flere studier startet i ex vivo slice eksperimenter for å undersøke synaptiske interaksjoner mellom MPFC afferente og bestemte målceller i amygdala 14-17.

Under frykt læring, sensorisk informasjon om betinget og ubetinget stimuli når amygdala via anslag fra bestemte thalamic og kortikale regioner. Plastisitet av disse inngangene til neuroner i sidedelen (LA) av Basolateral amygdala (BLA) er en viktig mekanisme underliggende frykt condition 9,18. Økende bevis tyder på at parallelle plast prosesser i amygdala involvere hemmende elementer for å kontrollere frykt minne 19. En gruppe av grupperte hemmende nerveceller er gabaergic mediale paracapsular Pilgrim celler (mpITCs), men deres nøyaktige tilkobling og funksjon er ufullstendig forstått 20-22. Her er optogenetic krets kartlegging brukes til å vurdere afferent og efferent tilkobling av disse cellene og deres innvirkning på målet nevroner i amygdala, som viser at mpITCs motta direkte sanseinntrykk fra thalamic og kortikale relé stasjoner 23. Spesifikk uttrykk for Chr i mpITCs eller BLA nevroner tillater kartlegging av lokale interaksjoner, avsløre at mpITCs hemme, men er også aktivert gjensidig av, BLA viktigste nevroner, plassere dem i nye feed-forward og tilbakemeldinger hemmende kretser som effektivt kontrollerer BLA aktivitet23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etikk uttalelse: Alle eksperimentelle prosedyrer var i samsvar med EU-direktiv om bruk av dyr i forskning og ble godkjent av den lokale Animal Care og bruk Committee (Regierungspräsidium Tübingen, state of Baden-Württemberg, Tyskland) ansvarlig for Universitetet i Tübingen.

1. Stereotactic injeksjonsprosedyren

  1. Forbered sterile verktøy (saks, skalpell, klemmer, drill, nåler, sutur materiale) med en sterilisator. Ordne sterile verktøy og andre nødvendige løsninger og kirurgi forsyninger som sterile bomullsbytter, desinfeksjonsmiddel, steril fosfatbufret saltløsning (PBS, pH 7,4), og H 2 O 2 på et sterilt operasjonslaken.
  2. Trekk glass mikropipetter for injeksjoner (figur 1A, innfelt) ved hjelp av en 3 mm bred boks filament på en horisontal microelectrode avtrekker i henhold til produsentens instruksjoner.
    Merk: For dype injeksjoner, bør elektroden taper være tilstrekkeliglang tid å nå de ventrale fleste koordinatene (ca. 5 mm;. for koordinater, se 1.10).
  3. Premiks 1 mL av virus løsning og 0,2 ul av 0,1% fast grønn oppløsning i steril PBS (for å bedre synligheten av oppløsning i glasset pipette). Fyll glass pipetter med blanding av virus løsning og rask grønn ved hjelp av en mikroliter pipette med en fin spiss (Figur 1A, innfelt).
    Merk: Arbeid med rekombinante adenoassosiert virale vektorer (rAAV) regnes biosikkerhetsnivå 1 (BSL 1) arbeid og må utføres i en BSL en laboratorium. rAAVs brukt i denne studien (figur 1C) var: 1) MPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (serotype 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (serotype 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (serotype 2/1) 23
  4. Anesthetize en mus ved hjelp av et lite dyr anestesi maskin (Isofluran: 3% i oksygen for induksjon).
    Merk: Mus brukt i denne studien var 4 -7 uker gamle og av følgende stammer og genotyper: C57BL6 / J villtype (eksperiment i figurene 2A og 3A-D); GAD67-GFP 24 (eksperiment i figurene 2B og 3E-H); Tac2-Cre 25 (eksperiment i figur 2C og 3I-J).
  5. Barbere hodet mellom ører og øyne. Påfør desinfeksjonsmiddel (providone-jod-basert) for å barbert hode ved hjelp av bomullspinner.
  6. Påfør et øye salve for å hindre uttørking av øynene under anestesi. Subkutant injisere mus med analgetisk (meloksikam basert, 0,1 ml 5 mg / ml oppløsning).
  7. Plassere musen i stereotaktisk ramme (figur 1A) og opprettholde anestesi via en gassanestesi maske (Isofluran: 2% i oksygen for vedlikehold). Sjekk anestesi dybde ved hjelp av lem tilbaketrekking refleks før du fortsetter.
    Merk: Oppretthold sterile forhold samt mulig gjennom hele kirurgisk prosedyre; slitasje disponibel ansiktsmaske, kirurgisk fartenwn og hansker.
  8. Gjør huden snitt på toppen av hodet med saks. Trekk huden til siden med butte pinsett, fikse med klemmer for å avsløre skallen overflaten, og ren hodeskalle med H 2 O 2.
  9. Marker injeksjonssteder skallen ved hjelp av en fin spiss permanent markør og bore hull for begge halvkuler (Figur 1b). Koordinater for injeksjoner i denne studien er (fra Bregma (mm)): MPFC: anterior 1.9, lateral ± 0,3, ventral 2.1; MGM / PIN: posterior 3.0, lateral ± 1,8, ventral 3.8; mpITC / BLA: posterior 1.45, lateral ± 3,35, og ventral 4,75.
  10. Montere fylt glass pipette på stereotaktisk ramme forbundet med en trykkinjiseringsanordningen og bringe pipetten til Bregma stilling.
  11. Bryt av tuppen av glass pipetten hjelp av gode straight-tip pinsett. Gjør dette forsiktig for å hindre aerosol generasjon av virus løsning. Kontroller at pipettespissen er åpen ved å bruke noen få trykk pulser og observere ekstrudering av dråper Virus løsning.
  12. Gå til de ønskede injeksjons koordinater og injisere halvparten av pipetten innhold (~ 0,5 mL) med følgende innstillinger på trykket injeksjonsutstyr: Pressure: 20 psi, gjennomsnittlig puls lengde: 30 ms, gjennomsnittlig antall pulser: 50.
  13. La pipette i stedet for ~ 1 min før langsomt (1 mm / min) trekke den.
    Merk: Kontroller at pipette ikke er blokkert før du gjentar prosedyren med samme pipette på annen halvkule. Ved blokkert spissen, ren eller bryte av tips og null pipette stilling ved Bregma igjen.
  14. Rengjør skallen med PBS (pH 7,4), fjerne klemmer, dra forsiktig huden sammen, og sy innsnitt med individuell knapp sutur (3 - 4 knop). Anvende desinfeksjonsmiddel (providone-jod-basert) rundt såret.
  15. Stopp anestesi og ikke la musen uten tilsyn før det er helt våken. Hold enkelt huses eller gå tilbake til selskap med andre dyr bare når det er fullt restituert. Postoperativt fortsette å overvåke helsetilstanden, og administer smertestillende hvis det er nødvendig. Følg prosedyrer i henhold til regelverket til den lokale Animal Care og bruk komité.

2. Utarbeidelse av Akutte Slices

  1. Forbered ACSF, kutte løsning, verktøy (saks, skalpell, tang, spatel, Pasteur pipette), og agar blokker.
    Merk: 1 liter kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) er nødvendig for hvert forsøk, og fremstilles ved å oppløse kjemikalier i dobbeltdestillert H2O som tidligere publisert 16,23. Skjære oppløsning fremstilles ved å supplere 200 ml ACSF med 0,87 ml 2 M MgSO4 stamløsning.
  2. Oksygenat ACSF og skjære oppløsning gjennom hele forsøket med 95% O2 og 5% CO2.
  3. Dypt bedøve mus ved hjelp av et lite dyr anestesi maskin med isofluran (3% i oksygen). Sjekk anestesi dybde ved hjelp av lem tilbaketrekking refleks før du fortsetter.
  4. Halshogge musen med store saks og umiddelbart slappehode i iskald skjæring løsning.
  5. Åpne skallen av en enkelt midtlinjen snitt fra hale til rostralt og presse forsiktig biter av skallen til sidene ved hjelp av tang. Raskt å fjerne hjernen ved forsiktig å løfte den ut av hodet ved hjelp av en liten spatel avrundet. Klipp av lillehjernen med skalpell. Sett hjernen i iskaldt skjæring løsning.
  6. For MPFC injeksjonssteder: avskåret fremre del av hjernen (som inneholder MPFC) ved hjelp av en skalpell og satt i iskaldt cutting løsning før slicing.
  7. Fjern overskudd av skjære oppløsning med et filterpapir og lime den bakre delen av hjernen på den vibratome trinnet.
  8. For skråstilte amygdala skiver, lim hjernen på en agar blokk (4%) kutt på en 35 ° vinkel (Figur 1D, midten). For koronale amygdala skiver, MGM / PIN injeksjonssteder og MPFC injeksjonssteder, lim hjernen direkte på scenen (figur 1D, venstre og høyre). Plassere en ekstra agar blokk bak hjernen for stabilitet under kutting.
  9. Place stadium i kappekammeret med iskald oksygenert skjære løsning som holdes ved 4 ° C ved anvendelse av en kjøleenhet. Forbered akutte skiver av amygdala (320 mm) ved hjelp av en safir blad. Plassere skivene i en grensesnitt kammer forsynes med oksygenert ACSF ved RT.
  10. Etter utarbeidelse av akutte amygdala skiver, legg grensesnittet kammer i et vannbad ved 36 ° C for å gjenopprette skiver for 35 - 45 min. Deretter returnerer grensesnittet kammeret til RT. For opptak fra disse skivene, fortsett med trinn 3.2.
  11. Under oppstart av trinn 2.10, skjære skiver av injeksjonssted som beskrevet tidligere for akutte amygdala skiver (trinn 2.8 til 2.9). Gjenoppretting av skiver i vannbad er ikke nødvendig her. Valgfritt: Hvis du raskt beregne injeksjonsstedet plassering, observere skiver på et stereoskop utstyrt med lysrør og passende filtersett.
  12. Fix skiver inneholder injeksjonssteder for post-hoc analyse ved å klemme dem mellom to filterpapir og submerging dem i 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS løsning O / N. For analyse av injeksjons fortsette med trinn 4.1.

3. Visualisering og Stimulering av Presynaptiske Fibers

  1. Forbered patch mikroskop for optogenetic aktivering av fibre og celler:
    1. Sentrer montert lysdiode (LED) på lyset banen.
    2. Mål LED lysintensiteten på baksiden fokusplanet og på utgangen av hvert objektiv med en kraftmåler velge riktig bølgelengde på 470 nm.
    3. Beregn lysintensiteten i mW / mm 2 og skape en kalibreringskurve (LED intensitet (%) versus lysmengde (mW / mm 2)) for hvert mål for verdiene som er målt for 470 nm bølgelengde.
  2. Hent en akutt amygdala skive fra grensesnittet kammer og plass i skive kammer montert på oppreist mikroskop utstyrt med et lysrør. Vær nøye med å plassere skive slik at SKIVEe vender oppover i grensesnittet kammeret er også vendt oppover i opptaket kammeret. Perfuse skive med friskt, oksygenrikt ASCF med en hastighet på 1 - 2 ml / min ved en temperatur på ~ 31 ° C.
  3. Observer presynaptiske fibre i stykket ved hjelp av lysrør i kombinasjon med passende filtersett for den spesifikke fluorescerende protein uttrykt. Bruk 5x mål å få en oversikt (figur 1E), og 60x objektiv for vurdering av fiber tetthet innenfor målområdet.
    Merk: For GFP og YFP, bruk filteret satt "grønn" (Magnetiseringsutkobling 472/20, stråledeler 495, Emission 490 LP) for mCherry bruke filter satt "rød" (Magnetiseringsutkobling 560/40, stråledeler 585, Emission 630/70) som spesifisert i materialer / utstyr tabellen.
  4. Åpne eller begrenser åpningen i mikroskop lysbanen etter ønske for eksperimentet (figur 2D).
  5. For å få en patch opptak, fylle en lapp pipette med intern løsning og montere jegn elektrodeholder. Påfør overtrykk til lappen pipette og sakte senke den først inn på badet løsning og deretter under visuell kontroll i stykket ved hjelp av micromanipulator.
    1. Approach nervecellen av interesse med lappen pipette fra siden og toppen. Slipp overtrykk når pipetten er på overflaten av cellen (fordypningen synlig på celleoverflaten) og oppnå en "gigaseal" ved påføring av negativt trykk.
    2. Gjelder ytterligere sug til å briste membranen lappen for å oppnå hel-celle-opptak. Deretter stimulere merkede fibre med den tilkoblede LED hjelp av passende bølgelengde for aktivering av chr (470 nm) ved opptak av elektriske svar fra cellen.
    3. For synaptisk stimulering starte med en lav LED intensitet og øke inntil den ønskede synaptiske strømamplituden er nådd. Trigger LED ved å konfigurere digitale utganger i datainnsamling programvare for å styre timing og pulslengden (eksempler i figur3).
      Merk: Andre programvare og / eller TTL-genererende enheter kan brukes til å utløse LED.
  6. Gjenta stimulering med åpnet eller begrenset åpning (trinn 3.4) i mikroskopet lysbanen som er ønsket for den neste celle registreres og / eller i nærvær av spesifikke medikamenter.
  7. Etter innspillingen, fikse skiver for post-hoc analyse ved å klemme dem mellom to filterpapir og senke dem i 4% PFA O / N.
  8. Analyser elektrofysiologiske data.
    Merk: Bruk egnet programvare for å visualisere innspilte feie data for hver enkelt stimulering offline. Ved å analysere effekten av narkotika, bruker peak detection rutiner for å få tiden løpet av narkotika effekt på synaptiske aktuelle amplituder for alle enkelt sweeps. Bestem når stoffet effekt når steady state. For å forberede representative gjennomsnitts svarene for tallene, bruke programvare til gjennomsnittlig ≥10 enkelte feier per eksperimentell tilstand (jf figur 3B-D, FH, J panel til høyre).
    Bemerk: flere alternative programvarepakker kan brukes for dataanalyse.

4. Post-hoc analyse av injeksjonssteder

  1. Vask skiver av injeksjonssteder (fra trinn 2.12) og opptak sider (hvis re-imaging er ønskelig, fra trinn 3.7) tre ganger i PBS. Dette gjøres ved gjentatte ganger å erstatte oppløsning med fersk PBS på en roterende ryste tre ganger i 10 min.
  2. Forbered 2% agar-agar løsning i PBS, og la den avkjøles til ~ 65 ° C. Plasser skiver flatt på bunnen av en liten 30 mm diameter petriskål, legge skiver i agar-agar og la det avkjøles til solid.
  3. Lim en agar blokk med innebygd skive eller skiver til scenen av en vibratome og plassere scenen i å kutte kammer med PBS.
  4. Reseksjon innebygd skiver til 70 mikrometer tykkelse. Valgfritt: Etter resectioning kan skiver være farget, dvs. med Neurotrace å avsløre cytoarchitecture (figur 3A, C), og / eller by immunfluorescens farging for YFP eller mCherry å forsterke signalet fra Chr fusjonsproteinet.
  5. Mount stykker på lysbilder og dekk med monterings medier. Bilde injeksjonssteder og, om ønsket, også bildesnitt inneholdende fibre i projeksjons områder ved hjelp av et fluorescensmikroskop eller en konfokal laser-scanning mikroskop (figur 2A-C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne delen viser arbeidsflyten av en ex vivo optogenetic tilnærming og representative resultater fra ulike eksperimentelle strategier for å undersøke fysiologiske egenskapene til sensoriske og regulerende langtrekkende anslag til BLA og mpITC nevroner samt egenskaper for lokal tilkobling mellom mpITC og BLA.

Etter stereotaktisk injeksjon av det valgte virale vektoren ved de ønskede koordinater inn i musehjerne (figur 1A-C, viral ekspresjon gang 2 - 6 uker, avhengig av eksperimentet), akutte hjernesnitt av injeksjonssted og projeksjonsområder i amygdala fremstilles på riktig vinkel for patch-clamp eksperimenter og fra den injiserte hjernen regionen for post-hoc analyse av injeksjonssteder (figur 1D). Før du starter opptak og optogenetic stimulering, fluorescensmerkede celler eller aksonal proskrivninger i målområdet (amygdala) skal kontrolleres på oppreist mikroskop for patch-clamp opptak ved bruk av vedlagte lysrør (figur 1E). Ved å få en patch-clamp opptak fra en antatt målcellen i prognose regionen i stykket, er lys stimulering starter mens tidspunkt, intervall, og pulslengde styres via lappen programvare som utløser lysdiode (LED). Avhengig av den eksperimentelle strategien (figur 2A-C, til høyre) i åpningen i det fluorescerende lyset banen er enten helt åpen eller begrenses (figur 2D). Samtidig som pulslengden konstant og så kort som mulig (ideelt sett ≤1 millisekunder), er LED utintensitet sakte økt til å vurdere hvilke intensitet er nødvendig for å oppnå den ønskede amplitude av den synaptiske respons i et spesielt eksperiment (figur 2E). Etter innspillingen amygdala skiver er etter fast. Ved resectioning og valgfrittflekker, injeksjon og opptaks nettsteder er avbildet på en konfokal mikroskop for å bekrefte injeksjon plassering og for å utelukke data fra feilplasserte injeksjoner. Bilder av injeksjonssted og tilhørende aksonal anslagene i amygdala for de tre eksperimentelle strategier (MPFC innganger til BLA, thalamic innganger til mpITCs, og lokale mpITC aktiverings) er vist i figur 2A-C.

Figur 3 viser representative opptak resultatene fra BLA viktigste nevroner, lokale BLA interneurons og mpITC nevroner som illustrerer egenskapene til lys-fremkalt svar for de ulike eksperimentelle strategier som brukes (figur 3A, E, jeg). For å målrette gabaergic nevroner (lokale interneurons og mpITCs) for opptak, ble GAD67-GFP reporter mus brukes 24. For MPFC og sensoriske thalamic anslag, kan flere aspekter av synaptisk overføring studeres. Den tidsmessige presisjon av acrings og de kinetiske egenskapene til CHRS brukt i denne studien muliggjøre pålitelig stimulering med sammenkoblede pulser ved en inter-stimulus-intervall på 50 ms. Dette åpner for analyse av parvise pulsforhold (PPR) av postsynaptiske strømmer (PSC avtaler), som enten kan være å legge til rette eller deprimerende avhengig projeksjon og målet celletype, og fungerer som indikatorer på presynaptisk frigjøring sannsynlighet (figur 3B, F, H) . I tillegg er analysen av synaptiske ventetider gjør det mulig for disseksjon av forskjellige postsynaptiske responskomponenter.

I dette eksempel lengre ventetider for den inhiberende PSC (IPSC) mot eksitatorisk PSC (EPSC) komponent indikerer en disynaptic og monosynaptisk inndata, henholdsvis (figur 3C). I andre tilfeller kan være behov for en mer inngående analyse av ytterligere EPSC egenskaper som reaksjon dirring eller koeffisienten for variansen av respons størrelse til å trekke slutninger om dens mono- eller disynaptic natur 17,23. Videre kan bruk av farmakologiske blokkere for spesifikke reseptorer identifisere innholdet i PSC avtaler (dvs. glutamatergic EPSC og GABAergic IPSC, figur 3C-D). Som forventet, den tidlige del av MPFC inngangs var glutamaterg, mens sen komponenten var GABAergic. Den komplette blokk av både EPSC og IPSC med glutamat reseptorblokker CNQX støtter videre at IPSC er disynaptic. For å undersøke modulering av synaptisk transmisjon ved optogenetically aktiverte fibre, kan virkningene av agonister og antagonister for metabotrope reseptorer (her GABAB-reseptorer) på amplitude og PPR-rute bli vurdert for å evaluere påvirkninger på pre- og postsynaptisk områder. I dette eksemplet er det samtidig reduksjon av amplitude med en økning i PPR indikativt for en presynaptisk modulering av lys aktiverte fibre (3 G, H). Endelig kan lokale interaksjoner mellom celler i amygdala bli vurdert, f.eksnår mus som uttrykker Cre under kontroll av Tac2 promoter 25 injiseres med en dobbel-floxed Chr uttrykke viral vektor (figur 1C). Fordi Tac2 og dermed er CHR uttrykt i mpITC og sentral amygdala (figur 2C), ble lysaktivering begrenset til mpITC ved å lukke den fluorescerende lysbanen åpning (figur 2D). Under disse forholdene, kan lys-fremkalt aksjonspotensialer oppnås hos infiserte mpITCs. Korte tidsforsinkelses hemmende synaptiske responser i BLA angir tilstedeværelsen av en funksjonell hemmende forbindelse mellom mpITC og BLA sentrale neuroner.

Figur 1
Figur 1. Stereo injeksjoner, Utarbeidelse av akutt hjerneskiver, og visualisering av Presynaptiske Fibers. (A, B) Stereo virus injeksjon. A) Bilde av bedøvet mus plassert i en stereotaktisk ramme med hodeskalle eksponert oginjeksjon pipette. Innfelt: Zoom inn bilde av injeksjon pipette fylt med virus løsning blandet med rask grønt. Skala: 3 mm. (B) Skjematisk av en mus hodeskalle med merkede posisjoner bore hull for ulike injeksjonsområder. (C) Reaksjonsskjema som viser forskjellige virale konstruksjoner brukt i denne studien. Mørk grå: promotersekvens; blå: Channelrhodopsin2 (ChR2 (H134R)); grønn / rød: fluorescerende protein. Expression tid var 2 uker for lokale amygdala projeksjoner og 4 - 6 uker for anslag fra MPFC og MGM / PIN-kode. (D) Fremstilling av akutte hjerneskiver: Reaksjonsskjema som viser plassering av musehjerne på kutte- trinn for oppnåelse av stykker fra forskjellige injeksjons og projeksjonsområder. (E) Visualisering av fiber i akutte hjerneskiver fra en GAD67-GFP mus injisert med ChR2-mCherry virus i MGM / PIN-kode. Bildene er tatt på oppreist lapp mikroskop med ulike filtersett: GAD67-GFP uttrykk, middel; MGM / PIN-fibre som er merket med mCHerry, høyre. Skala: 200 mikrometer. MPFC, medial prefrontal cortex; mpITC, mediale paracapsular interkalerte celler; BLA, basolateral amygdala; MGM, mediale geniculate kjernen, mediale del; PIN, posterior intralaminar thalamic kjerne; LA, lateral amygdala; BA, basal amygdala; CEA, sentrale kjernen i amygdala. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. injeksjonssteder, Projeksjonsområder, og optogenetic Stimulering av aksonal projeksjoner. (AC) Confocal bilder av representative injeksjonssteder og projeksjon områder i BLA, og ordninger for de eksperimentelle strategier. (A) Venstre: MPFC injeksjonsstedet i en C57BL / 6 mus farget med Neurotrace. Skala:500 um. Midten: tilsvarende anslag i BLA i en skrå amygdala skive. Skala: 200 mikrometer. Høyre: Skjematisk av hele feltet belysning av MPFC projeksjoner og opptak av nevroner i BLA. (B) Venstre: MGM / PIN injeksjonsstedet i en GAD67-GFP mus. Skala: 500 mikrometer. Midten: Tilsvarende anslag mpITC og LA for en koronale amygdala skive. Skala: 200 mikrometer. Høyre: Skjematisk av hele feltet belysning av MGM / PIN projeksjoner og opptak av en mpITC neuron. (C) Venstre: Lokal uttrykk for ChR2-YFP i en Neurotrace farget amygdala skive en Tac2-Cre mus. Skala: 200 mikrometer. Innfelt: Zoom inn av mpITCs uttrykker ChR2-YFP. Skala: 20 mikrometer. Høyre: Skjematisk av begrenset belysning av mpITC klynge og innspilling av et BLA nevron. (D) Bilder av opptaket kammer under lys levering og bilde av nevroner i akutte hjerneskiver (mpITC cluster) i en GAD67-GFP mus med åpen og begrenset aperture. Skala: 30 mikrometer. (E) Eksitatoriske postsynaptiske strømmer (EPSCs) fremkalt av forskjellige LED intensiteter (øverst) og plott av lys makt versus fremkalt EPSC amplitude (nederst) fra en representant mpITC nevron på optogenetic aktivering av fibre fra MGM / PIN-kode. Skala: 100 PA / 10 msek.
Merk:. Figur 2A er modifisert fra referanse # 16 og figur 2C fra referanse # 23 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Eksempler Resultater fra optogenetic Aktivering av Long Range og lokale Anslag. (A) Scheme av eksperimentell strategi for (BD). (B) Representative EPSCs tatt opp fra en BLA rektor nevron ogBLA interneuron på optogenetic parvise impuls stimulering (50 msek inter-stimulus-intervall) fibre fra MPFC utløse paret puls tilrettelegging og paret puls depresjon, henholdsvis. Skala: 100 PA / 25 msek. (C) optogenetic aktivering av fibre fra MPFC utløser feed-fremover-inhibering. Venstre: Representant EPSC (på -70 mV) og hemmende postsynaptiske strøm (IPSC, ved 0 mV) i en BLA rektor nevron. Den IPSC har en lengre synaptic ventetid i forhold til EPSC. Skala barer: 200 PA / 10 ms og 200 PA / 2 ms. Th: Lys fremkalt bifasisk EPSC / IPSC sekvens (ved -50 mV) er blokkert av AMPA / Kainat-antagonist CNQX (10 um), noe som ytterligere støtter disynaptic naturen av IPSC. Skala: 50 pA / 5 ms. (D) Virkninger av påfølgende blokk med EPSC / IPSC sekvens (ved -50 mV) av Cl - kanal blocker pikrotoksin (PTX, 100 mm) og PTX + CNQX. Den IPSC er blokkert av PTX og de resterende EPSC av CNQX. Skala barer: 50 PA / 5 ms. (E) Scheme av eksperimentell strategi for (FH). F) Representative EPSCs registrert hos mpITC og en BLA rektor nevron på optogenetic parvise puls stimulering av fibre fra MGM / PIN-kode. Skala: 50 PA / 20 ms. (G) EPSCs i en annen mpITC neuron er blokkert av natriumkanalblokkerings tetrodotoksin (TTX, 0,5 uM), som indikerer at de er avhengig av natriumkanalaktivitet. Skala: 50 PA / 20 ms. (H) talamiske innganger til mpITC neuroner er modulert av presynaptiske GABAB-reseptorer. EPSCs under kontroll tilstand, reduksjon av EPSC amplitude og samtidig økning i den sammenkoblede pulsforhold under påføring av GABAB agonist baklofen (2 uM), og utvinning av både amplitude og innledende sammenkoblet puls rasjon ved ko-anvendelse av GABAB-antagonist CGP55845 (10 mm). Disse endringene er en indikasjon på en presynaptisk modulering av GABAB-reseptorer. Skala: 50 PA / 20 ms. (I) Reaksjonsskjema eksperimentelle strategi for (J). (J) Lys-fremkalt aksjonspotensialer tatt opp fra en ChR2-YFP uttrykker mpITC neuron. Lys-fremkalt iPSCs tatt opp fra en BLA rektor nevron på ulike holding potensialer (-90, -70, -50, -20, og 0 mV) snu rundt den beregnede likevektspotensialet for Cl -. Skala barer: 20 mV / 100 msek og 10 pA / 10 ms. Merk:. 3B-D er endret fra Reference # 16, og figur 3 H og J fra referanse # 23 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokollen beskriver en metode for ex vivo optogenetic undersøkelse av nevrale kretser og lokal tilkobling som enkelt kan implementeres på de fleste, om ikke alle, oppreist slice patch-clamp opptak oppsett ved å utstyre dem med en ~ 470 nm LED ved epifluorescence lys port. En stor fordel med optogenetic stimulering av aksonal anslagene i skiver er at det gir mulighet for spesifikk aktivering og undersøkelse av egenskapene til forbindelser som ikke var tilgjengelig med konvensjonell elektrisk stimulering, fordi de tilsvarende fiber traktater ikke var kjent, ikke klart definert, eller ikke bevart i én hjerne skive. Som et sentralt eksempel relevant for frykt kretser, er det illustrert hvordan dette kan brukes til å dissekere egenskaper MPFC innganger til amygdala.

Selv i tilfeller hvor elektriske fiberkanal stimulering har vært mye brukt i tidligere studier, disse traktene ofte bære fibre fra ulike regioner av opprinnelse. For eksempel, i kretser knyttet til å frykte læring, anslag fra ulike sanse thalamic atomkjerner eller kortikale regioner kjøre blandet gjennom interne og eksterne kapsler, henholdsvis. Fordelen med optogenetic stimulering er at den muliggjør selektiv aktivering av en undergruppe av fibre fra et definert område. Dette illustreres for spesifikke thalamic innspill fra PIN og MGM til mellomlag celler og lateral amygdala viktigste celler. Videre kan problemer som oppstår med elektrisk stimulering, dvs. aktivering av andre fibre med passasje eller cellene i nærheten av den stimulerende elektrode som kan foreta lokale forbindelser i målområdet bli overvunnet. Imidlertid, mens optogenetic stimulering er like rask som elektrisk stimulering, kan det være begrensninger når det gjelder stimulering frekvens som kan måles pålitelig anvendes. Dette avhenger av inaktivering og deinactivation skinetikk og av varianten av chr som blir brukt, 4 samt expression nivåer og metoder, og lette stimuleringsmetoder 26.

Ved bruk av en lysdiode montert til fluorescens port for lys stimulering, blir typisk hele synsfeltet til et gitt mål er tent, noe som resulterer i aktivering av alle fibre eller celler i felten og i en viss dybde. Dette kan bare delvis begrenses til et mindre område eller et sett av merkede celler (i dette eksemplet, den mpITC) ved hjelp av en åpning i det fluorescerende lysbanen 23,27. Med lysdioder, er lys makt ikke er et problem, så høy effekt blå lysdioder er nå tilgjengelig fra mange produsenter. Imidlertid emisjonsspektra har full bredde halvt maksimum verdier i flere titalls nanometer. Derfor LED utgjøre begrensninger når enten romlig presis stimulering for subcellulære kartlegging av tilkobling og / eller monokromatisk stimulering er ønsket. Begge kan forbedres ved hjelp av blå lasere som lyskilder, typisk i kombinasjon med mer sofistikerte oppsett som muliggjør tjæregeting og / eller skanning av strålen i små områder og dybder definerte vev (for eksempel se 28).

Med ex vivo optogenetic tilnærming er beskrevet her, kan flere egenskaper synaptisk overføring studeres. For å vurdere monosynapticity fra tidlig synaptisk respons komponent, grundig analyse av ventetider og deres jitter, samt respons amplitude varians bør brukes på et representativt utvalg av innspilte nevroner (f.eks se 16,17,23). I de tilfeller hvor aktivering av nettverk aktivitet kan spille en rolle, metoden for valget er å isolere den direkte monosynaptiske komponent ved å anvende en kombinasjon av tetrodotoksin (TTX) for å blokkere aksjonspotensialer i kombinasjon med K + kanalblokk 4-aminopyridin (4- AP) for å hindre repolarisering 14,28,29. Reseptorene medier mono- og disynaptic komponenter innganger kan identifiseres ved hjelp av farmakologiske blokkere. Furthermore, er det mulig å studere aspekter av presynaptisk modulering av optogenetically-aktiverte innganger i amygdala 23,30. En potensiell forbeholdet er at ChR2 har noen kalsium permeabilitet 1,4 og dets aktivering i presynaptiske fibre og terminaler har blitt foreslått å endre utgivelsen sannsynligheten av ulike mekanismer 26,31. Likevel, flere studier blant eksemplene som er vist her vellykket ansatt ChR2 uttrykk for å identifisere inngangs- og målrette cellespesifikke forskjeller i parvise pulsforhold i amygdala og andre hjerneområder 16,23,26,32 og dessuten demonstrert modulering av utgivelsen sannsynlighet ved aktivering av spesifikke signalveier i presynaptiske terminaler som ikke ble utelukket av Chr aktivering 23,30. Ytterligere støtte kommer fra data i hippocampus og lillehjernen, som viser at med riktig Chr uttrykk metode og lys stimulering teknikk, fysiologiske aspekter, inkludert effekten av utslipp og troskap of synaptisk overføring kan bli pålitelig studert 26. Endelig optogenetic fiberaktivering har også blitt brukt til å søke stimuleringsregimer som induserer synaptisk plastisitet 31,33,34.

Flere aspekter er avgjørende for å lykkes med denne metoden. Den ene er presisjonen i stereo målretting av virale vektorer. Derfor er det nyttig å raskt vurdere injeksjonsstedet plassering før du skaffer opptak og deretter utføre en mer detaljert post-hoc analyse. I tillegg til romlig nøyaktighet, levedyktigheten av neuroner ved injeksjonsstedet er en viktig determinant for et vellykket forsøk og avhenger av injeksjonsteknikk. Den presenterte alternativet, ved hjelp av lange og tynne avsmalnende glasselektroder, tjener dette formålet godt for både overfladisk og dypere hjerneområder, men kan ha den ulempe at avsmalningen er meget fleksibel. Et alternativ er å bruke mikroliter sprøyter spesielt utviklet for stereotaktisk levering i nevrovitenskap (neuro-syringes) med mer stive nåler som kan dispensere små volumer. Spesifisiteten til målretting CHR-ekspresjon til definerte celletyper og regioner kan bli ytterligere forbedret ved å bruke betinget uttrykk 7, for eksempel med Cre-system som illustrert for amygdala interkalert celler. Dette gjør også bruk av sterke arrangører i Cre-avhengige virale vektorer.

Et annet viktig trekk er valget av den virale vektor. For å uttrykke CHR, ble rekombinante adenoassosiert virus (rAAVs) anvendes som har fordelen av å være et biosikkerhetsnivå 1 vektorer sammenlignet med andre populære virale systemer. rAAVs har vært brukt på en stund og er generelt trygge og pålitelige vektorer med god nevrale tropisme og lite eller ingen immunogenic potensial, men emballasjen volum er begrenset (ca. 4-5 kb) 35. I disse spesifikke eksperimenter, serotype 2/9 og 2/1 ble brukt for allestedsnærværende og betinget uttrykk, respektivt. I henhold til litteraturen, denSE serotyper transduce celler i målområdet, men synes ikke å bli tatt opp av aksoner til retrograd etikett celler, i motsetning til serotyper 2/5 og 2/6 36,37. Imidlertid bør innledende forsøk utelukke at det finnes CHR-merkede cellelegemene i områder som rager på injeksjonsstedet, noe som er spesielt viktig når man vil studere gjensidig forbundet hjerneregioner som MPFC og amygdala. Flere nyere studier sammenlignet effekten av rAAV serotyper i ulike hjerneområder i rotter og mus 36,38,39. En begynnende tema er at nyere serotyper (for eksempel 2/1, 2/8 og 2/9) er generelt mer effektivt enn det opprinnelige 2/2 serotype. Også verdt å merke, rAAV-mediert uttrykk for CHR, i motsetning til andre metoder, ikke føre til skadelige effekter på uttrykke celler eller merket axoner 40. Den nødvendige Uttrykket tid for å oppnå effektiv fiberaktivering ex vivo ser ut til å være avhengig av avstanden til projeksjonen studert. Her og i samsvar med litetemperaturen, for merking og aktivering av langtrekkende forbindelser i mus (MPFC og sanseinntrykk), et uttrykk på 4 - 8 uker er nødvendig, mens for å studere lokal tilkobling i amygdala, kortere uttrykk ganger av 2 - 3 uker er tilstrekkelig 14-17,23,30,34.

For innspilling av optogenetically-fremkalt respons i målområdet, to faktorer som er viktige: 1) den akutte hjerne skive må være av god kvalitet, og 2) en betydelig mengde av levedyktige merkede fibre må bli bevart. Kvaliteten på skiver kan forbedres ved hjelp av safir kniver for kutting. Bevaring av aksoner og dermed størrelsen og stabiliteten av lette responser kan forbedres ved å kutte stykker i en viss vinkel som vist for MPFC-amygdala fremspring (figur 1D og 2A) 16,34. Men denne sterkt avhenger av orienteringen av afferente i målregionen, og vil måtte bestemmes for hver kombinasjon av projeksjonsområdet og tarFå regionen. I denne forbindelse kan post-hoc analyse av anslagene i målområdet være nyttig. For å øke fiber deteksjon og omgå bleking som kan ha oppstått under skive stimulering, farging mot fluorescerende koden på Chr fusjonsproteinet kan benyttes.

Samlet denne metoden for optogenetic krets kartlegging har nylig ikke bare blitt anvendt til å frykte kretser, men mange andre systemer i hjernen. I fremtiden vil målretting av subnuclei og spesifikke celletyper ved å kombinere et økende utvalg av genmodifiserte mus linjer og betingede virale vektorer gi en enda mer detaljert forståelse av mangfoldet av funksjonelle synaptiske egenskapene til spesifikke lokale og langtrekkende kretser. Videre kan post-hoc immunolabeling av fluorescens-merket Chr i undersøkte funksjonelle forbindelser kombineres med ultra analyse (dvs. ved hjelp av elektron mikroskopiske metoder) for å gi innsikt i nøyaktig morphological egenskaper av tidligere aktiverte synapser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585 Filters can be bought as set F46-008
                     (emission) AHF, Germany F47-630 Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (emission) AHF, Germany F76-490 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (24), 13940-13945 (2003).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13, (4), 251-266 (2012).
  4. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, (1), 9-34 (2011).
  5. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, (5), 663-668 (2007).
  6. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, (6), 3166-3173 (2006).
  7. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).
  8. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).
  9. Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90, (2), 419-463 (2010).
  10. Myers, K. M., Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12, (2), 120-150 (2007).
  11. Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33, (1), 56-72 (2008).
  12. Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13, (6), 728-733 (2006).
  13. Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36, (2), 529-538 (2011).
  14. Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80, (6), 1491-1507 (2013).
  15. Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34, (47), 15601-15609 (2014).
  16. Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).
  17. Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10, (9), 1435-1442 (2015).
  18. Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning. Neuropharmacology. 52, (1), 215-227 (2007).
  19. Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62, (6), 757-771 (2009).
  20. Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247, (2), 246-271 (1986).
  21. Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31, (13), 5131-5144 (2011).
  22. Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234 (2012).
  23. Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86, (2), 541-554 (2015).
  24. Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467, (1), 60-79 (2003).
  25. Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, (2012).
  26. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34, (22), 7704-7714 (2014).
  27. Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16, (3), 332-339 (2013).
  28. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, (7233), 1142-1145 (2009).
  29. Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79, (4), 658-664 (2013).
  30. Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32, (42), 14815-14820 (2012).
  31. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4, (2), 139-141 (2007).
  32. Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76, (4), 790-803 (2012).
  33. Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14, (11), 1413-1415 (2011).
  34. Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31, (1), 339-345 (2011).
  35. Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4, (5), 353-364 (2003).
  36. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8, (9), (2013).
  37. Salegio, E. A., et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20, (3), 348-352 (2013).
  38. Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, (2014).
  39. McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109, (3), 838-845 (2009).
  40. Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, (2013).
<em>Ex Vivo</em> optogenetic Disseksjon av Fear kretser i hjernen skiver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).More

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter