Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

doi: 10.3791/53628 Published: April 5, 2016

Summary

Optogenetic yaklaşımlar yaygın nöral aktiviteyi işlemek ve beyin fonksiyonu için sonuçlarını değerlendirmek için kullanılır. Burada, bir teknik optik aktivatör channelrhodopsin in vivo tanımlanması üzerine, korku ile ilgili devreler özel uzun menzilli ve yerel sinirsel bağlantılar sinaptik özellikleri ex vivo analiz için izin verdiği gösterilmiştir.

Abstract

Optogenetic yaklaşımlar günümüzde yaygın ışığı ışık ile aktive olan protein ve nöral etkinlik sonraki manipülasyon hedeflenen ifade birleştirerek nöral popülasyonları ve devrelerin işlevini incelemek için kullanılır. Channelrhodopsins (CHRS) ışık geçişli katyon-kanal ve bir flüoresan proteinine olduğunda ekspresyon görselleştirme ve özel hücre tipleri aynı anda harekete geçirmek ve beynin belirli bölgelerde aksonal projeksiyonlar sağlar. Viral vektörlerin stereotaktik enjeksiyon yoluyla, CHR füzyon proteinleri yapısal olarak ya da koşullu tanımlanmış bir beyin bölgesi spesifik hücrelerde eksprese edilebilir, ve aksonal çıkıntılar daha sonra beyin kesitleri ex vivo Optogenetic aktivasyonu yoluyla anatomik ve fonksiyonel olarak incelenebilir. Geleneksel elektriksel stimülasyon yaklaşımlarla ele edilemeyen bağlantılarının sinaptik özelliklerini anlamak amacıyla bu, ya da roman AFFE belirlenmesinde özel bir öneme sahiptirkira ve daha önce çok az anlaşılmış oldu efferent bağlantısı. İşte bir kaç örnek bu teknik amigdala korku ile ilgili devreleri açıklık bu soruları araştırmak için nasıl uygulanabileceğini göstermektedir. amigdala korku ve duygusal anılar edinilmesi ve korku ifadesi ve depolama için bir anahtar bölgedir. kanıt kaç satır medial prefrontal korteks (MPFC) korku edinimi ve nesli farklı yönlerini katılır, ancak amigdala ile hassas bağlantı sadece anlaşılmalıdır başlıyor düşündürmektedir. Ex vivo Optogenetic aktivasyon bazolateral amigdala (bla) 'de MPFC afferent ve hedef hücreler arasındaki sinaptik iletişim yönlerini incelemek için nasıl kullanılabileceğini İlk olarak, gösterilmiştir. Bundan başka, bu ex vivo Optogenetic yaklaşım, amigdala GABAerjik nöronlar bir grup ile yeni bir bağlantı boyutlarını ölçen uygulanabilir kadar gösterilmiş olup, bir örnek olarak paracapsular birleştirilmiş zigot (mpITC).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

görselleştirme ve beyin bölgeleri ve nöronların belirli türleri arasında belirli bağlantı eşzamanlı aktivasyonu için hassas aletleri fonksiyonel bağlantı altta yatan sağlıklı beyin fonksiyonu ve hastalık durumları anlamada daha önemli hale gelmektedir. İdeal olarak, bu nöronlar iletişim tespit hangi hassas sinaptik özellikleri fizyolojik soruşturma gerektirir. Bu, tek bir akut beyin diliminde korunamaz beyin alanları arasında bağlantı için geçerlidir. Geçmişte, bu büyük ölçüde ayrı deneylerde elde edilmiştir. Bir yandan, nöral izleyiciler enjekte in vivo daha sonra ışık veya ön ve postsinaptik mümkün elektron mikroskopik analizi ile bir arada kullanılmıştır. Kalkış bölgesinden lif yollarının korunması ve dilim hazırlanmasında erişilebilir Diğer taraftan, elektrik stimülasyonu hedef bölgede hücrelerin sinaptik iletişim mekanizması değerlendirmek için kullanılmıştır.

Kendi görselleştirme ve post-hoc anatomik analiz 1- için izin verirken optogenetics gelişine, bu tür floresan proteinleri kaynaşmış Channelrhodopsins (Chrs) olarak ışık kapılı katyon kanalları, hedeflenen ifadesi, artık nöronlar ve onların aksonal yörüngeleri aktivasyonunu sağlar 4. Lif yolları belirli yörünge ayrılabilir olmadığı veya nedeni, 1) geleneksel elektrik stimülasyonu ile erişilebilir değildi beyin bölgelerinden girişleri değerlendirmek: Üst somata 5 kopmuş zaman CHR-ifade aksonlar bile teşvik edilebilir, çünkü beyin dilimleri mümkündür bilinmemektedir; 2) tümden öne ama eksik anlaşılmıştır belirli girdiler için menşe bölgeyi tanımlamak; ve 3) hem yerel hem de uzun menzilli projeksiyonlar, tanımlanan hücre tipleri arasında işlevsel bağlantı araştırmak. Çünkü avantajları bir dizi, beyin dilimleri devre Bu Optogenetic eşleme çapında olmuşturly son yıllarda kullanılan ve floresan etiketli CHRS ekspresyonu için viral vektörler, çeşitli ticari satıcılardan kolayca temin edilebilir. elektriksel stimülasyon da geçit veya diğer yakın hücrelerden ve eşit derecede hızlı ve zamansal hassas stimülasyon lifleri işe çünkü geleneksel elektrik stimülasyonu üzerinde optogenetic aktivasyonu bazı önemli avantajları nedeniyle stimülasyon elektrotları, fiber stimülasyon özgüllüğü yerleştirme dokuya hiçbir zarar vardır. Buna ek olarak, viral vektörlerin stereotaktik enjeksiyon kolayca Kre-bağımlı ekspresyonunu ve / veya özel promoterler 7 kullanılarak elde edilebilir, belirli beyin bölgelerinde 6 ve koşullu veya hücre tipi özel ifadesine hedeflenebilir. İşte, bu teknik korku sisteminde uzun menzilli haritalanması ve yerel devreleri için uygulanır.

Amigdala korku ve duygusal anıları 8,9 edinimi ve korku ifadesi ve depolama için bir anahtar bölgedir. Apart froamigdala m, medial prefrontal korteks (MPFC) ve hipokampus (HC), karşılıklı olarak amigdala bağlı yapılar, korku ve yok oluş anı 10,11 edinimi, konsolidasyon ve alma yönleri sorumlu tutulmaktadır. MPFC alt bölümleri aktivite 12,13 devletler, yüksek ve düşük hem de korku kontrolünde bir çift rol oynadığı düşünülmektedir. Bu kısmen amigdala aktivitesi ve çıkışını kontrol ediyorum amigdala için MPFC doğrudan bağlantıları aracılık olabilir. Bu nedenle, son yıllarda, bazı çalışmalar amigdala 14-17 yılında MPFC afferentleri ve belirli hedef hücreleri arasındaki sinaptik etkileşimlerini araştırmak için ex-vivo dilim deneyler başladı.

korku öğrenme sırasında, klimalı ve koşulsuz uyaranlara ilgili duyusal bilgiler belirli talamik ve kortikal bölgelerden projeksiyonlar aracılığıyla amigdala ulaşır. Başol lateral (LA) nöronlara bu girdilerin Plastisiteateral amigdala (BLA) korku klima 9,18 altında yatan önemli bir mekanizmadır. Artan kanıtlar amigdala paralel plastik süreçleri korku bellek 19 kontrol etmek için inhibitör unsurlar içerdiğini göstermektedir. Kümelenmiş inhibitör nöronların bir grup GABAerjik medial paracapsular enterkale hücreler (mpITCs) vardır, ama bunların kesin bağlantı ve fonksiyon tam olarak 20-22 anlaşılmaktadır. Burada, optogenetic devre haritalama mpITCs talamik ve kortikal röle istasyonları 23 doğrudan duyusal girdileri almak olduğunu gösteren, afferent ve efferent bu hücrelerin bağlantı ve amigdala hedef nöronlar üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılır. mpITCs veya BLA nöronlarda CHR spesifik ifadesi etkili bir BLA aktivitesini kontrol roman ileri beslemeli ve geri bildirim inhibitör devrelerde yerleştirerek, mpITCs engellediğini ortaya, yerel etkileşimlerin haritalama sağlar, aynı zamanda karşılıklı BLA ana nöronlar tarafından aktive edilir23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etik deyimi: Tüm deneysel prosedürleri araştırmalarda hayvanların kullanımına ilişkin AB direktifi uyarınca ve yerel Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (Regierungspräsidium Tuebingen, Baden-Württemberg, Almanya devlet) Tübingen Üniversitesi'nden sorumlu değildir.

1. Stereotaktik Enjeksiyon Yöntemi

  1. Bir sterilizatör kullanılarak steril aletler (makas, neşter, kelepçeler, matkap, iğneler, dikiş malzemesi) hazırlayın. Örneğin steril bir cerrahi örtü steril pamuk swap, dezenfektan, steril fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7.4) ve H2O 2 gibi steril araç ve diğer gerekli çözümler ve cerrahi malzemeleri düzenlemek.
  2. Üreticinin talimatlarına göre yatay bir mikroelektrot çektirmenin bir 3 mm genişliğinde kutu filament kullanarak enjeksiyonlar için cam mikropipetler (Şekil 1A, ek) çekin.
    Not: Derin enjeksiyonları için, elektrot konik yeterince olmalıventral en koordinatları ulaşmak için uzun (yaklaşık 5 mm;. koordinatlar için, 1.10 bakınız).
  3. Karışımlar virüsü çözeltisi 1 ul steril PBS içinde% 0.1 hızlı yeşil çözelti, 0.2 ul (cam pipet çözeltisi daha iyi görülmesi için). Ince ucu (Şekil 1A,) ile bir mikrolitre pipet kullanarak virüs çözümü ve hızlı yeşil karışımı ile cam pipetler doldurun.
    Not: rekombinant Adeno-ilişkili viral vektörler (rAAV) çalışma biyogüvenlik seviye 1 (BSL 1) çalışma olarak kabul edilir ve bir BSL 1 laboratuvarda yapılacak gerekiyor. Bu çalışmada, (Şekil 1C) kullanılan rAAVs vardı: 1) MPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (serotip 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (serotip 2/9) 23; 3) mpITC /: Bla, rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (serotip 2/1) 23
  4. küçük bir hayvan anestezi makinesi (: indüksiyon oksijen içinde% 3 İsofluranın) kullanarak bir fare anestezisi.
    Not: Bu çalışmada kullanılan Fare 4'ü -7 haftalık ve aşağıdaki suşlar ve genotiplerinin: (Şekil 2A ve 3A-D deney) C57BL6 / J yabani tip; GAD67-GFP 24 (Şekil 2B ve 3E-H deney); Tac2-Cre 25 (Şekil 2C ve 3I-J deney).
  5. kulak ve gözler arasındaki başını tıraş. pamuklu çubuklarla kullanarak traş kafa dezenfektan (tabanlı providon-iyot) uygulayın.
  6. anestezi sırasında gözlerin kurumasını önlemek için bir göz merhemi sürün. Deri altına analjezik ile (meloksikam göre 0.1 ml, 5 mg / ml solüsyon) fare enjekte edilir.
  7. (: Bakım için oksijen% 2 İsofluranın) stereotaktik çerçeve (Şekil 1A) fare yerleştirin ve bir gaz anestezi maske ile anestezi korumak. Devam etmeden önce ekstremite çekme refleksi ile anestezi derinliğini kontrol edin.
    Not: tüm cerrahi prosedür sırasında steril olarak mümkün olduğu kadar iyi korumak; tek kullanımlık yüz maskesi giymek, cerrahi gitmekVe eldiven wn.
  8. makas kullanarak başın üst deri kesi olun. Yavaşça H 2 O 2 ile kafatası yüzeyi ve temiz kafatası açığa çıkarmak için kelepçeler ile düzeltmek, künt forseps kullanarak tarafına cilt çekin.
  9. Her iki yarımkürede (Şekil 1B) için iyi bir ipucu kalıcı marker ve matkap delikleri kullanarak kafatası Mark enjeksiyon siteleri. MPFC: Bu çalışmada enjeksiyon (Bregma (mm)) vardır koordinatları anterior 1.9, 0.3 ± yan, ventral 2.1; MGM / PIN: 1.8 ± yan, 3.0 arka ventral 3.8; mpITC /: Bla 3.35 ve 4.75 ventral ± yan, 1.45 posterior.
  10. Bir basınçlı enjeksiyon cihazına bağlı stereotaktik çerçeve üzerine dolu cam pipet montaj ve Bregma pozisyonuna pipet getirmek.
  11. ince düz uçlu forseps kullanarak cam pipet ucu kesiyorum. virüs çözümü aerosol oluşumunu önlemek için yavaşça yapın. Pipet birkaç basınç darbeleri uygulayarak ve Viru damlalarının ekstrüzyon gözlemleyerek açık olduğundan emin olunsolüsyonu.
  12. İstenen enjeksiyon koordinatlarına gidin ve basınçlı enjeksiyon cihazda aşağıdaki ayarları kullanarak pipet içeriği (~ 0.5 ul) yarısı enjekte: Basınç: 20 psi, ortalama darbe uzunluğu: 30 ms, bakliyat ortalama sayısı: 50.
  13. bu geri çekme yavaş (1 mm / dakika) önce yaklaşık 1 dakika boyunca yer pipet bırakın.
    Not: pipet diğer yarımkürede aynı pipetle işlemi tekrarlamadan önce bloke olmadığından emin olun. Engellenen ucu durumunda, temiz ya da tekrar bregma ucu ve sıfır pipet konumunu kesiyorum.
  14. PBS (pH 7.4) ile temiz kafatası, yavaşça, kelepçeler kaldırmak birlikte cilt çekin ve bireysel düğme sütür ile kesi sütür (3-4 knot). yaranın etrafındaki dezenfektan (tabanlı providon-iyot) uygulayın.
  15. anestezi durdurmak ve tamamen uyanık kadar gözetimsiz fareyi bırakmayın. Tek muhafaza tutmak ya da tamamen iyileşti sadece diğer hayvanların şirkete geri dönün. Ameliyat sonrası sağlık durumunun izlemeye devam ve administer analjezik gerekirse. Yerel Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından ileri sürülen kurallara göre prosedürlerini takip edin.

Akut Dilimleri 2. Hazırlık

  1. ACSF, kesme çözüm aletleri (makas, neşter, pens, spatula, Pasteur pipeti) ve agar blokları hazırlayın.
    Not: Yapay beyin-omurilik sıvısı (ACSF) 1 L deney başına gerekli olan ve daha önce 16,23 yayınlanan iki kez damıtılmış H2O kimyasallar çözülmesiyle hazırlanır. Kesme solüsyon 2 M MgSO 4 stok çözeltisi 0.87 ml ACSF 200 ml ilave etmek suretiyle hazırlanır.
  2. Oksijenat ACSF ve% 95 O2 ve% 5 CO2 ile deney boyunca kesme çözeltisi.
  3. Derin izofluran kullanarak küçük bir hayvan anestezi makinesi (oksijen% 3) kullanarak fare uyutmak. Devam etmeden önce ekstremite çekme refleksi ile anestezi derinliğini kontrol edin.
  4. Büyük makas kullanarak fare başını kesmek ve hemen soğukbuz gibi soğuk kesim çözüm baş.
  5. kaudal gelen rostralinde ve tek orta hat kesi açık kafatası hafifçe forseps kullanarak yanlara kafatası parçaları itin. Hızla hafifçe küçük bir yuvarlak spatula ile kafatasının dışında çekerek beyin kaldırmak. neşter ile beyincik kesti. buz gibi soğuk kesim çözüm beyin yerleştirin.
  6. MPFC enjeksiyon siteleri için: (MPFC içeren) bir neşter kullanılarak beynin ön kısmı kesilmiş ve dilimleme kadar buz gibi soğuk kesim çözüm koymak.
  7. Bir filtre kağıdı ile aşırı kesim çözüm çıkarın ve vibratome sahneye beynin posterior bölümünü tutkal.
  8. Eğik amigdala dilimleri için, 35 ° açı (Şekil 1D, orta) bir agar bloğu (% 4) kesim üzerinde beyin tutkal. Koronal amigdala dilimleri, MGM / PIN enjeksiyon siteleri ve MPFC enjeksiyon siteleri için, (Şekil 1D, sol ve sağ) sahnede doğrudan beyin tutkal. dilimleme sırasında istikrar için beynin arkasındaki ek agar blok yerleştirin.
  9. Placbir soğutma birimi ile, 4 ° C'de muhafaza edilir, buz soğukluğunda oksijenli kesme çözeltisi ile bölme kesme e aşaması. Bir safir bıçak kullanarak amigdala (320 mikron) akut dilimleri hazırlayın. Oda sıcaklığında oksijenli ACSF ile birlikte bir ara bölmesi dilimleri yerleştirin.
  10. 45 dakika - Akut amigdala dilimleri hazırlanmasından sonra, 35 dilim kurtarmak için 36 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde ara yüz bölümü yerleştirin. Daha sonra, oda sıcaklığına ara yüz bölümü geri döner. Bu dilimler kayıt, adım 3.2 ile devam edin.
  11. Akut amigdala dilimleri (- 2.9 2.8 adımları) için daha önce açıklandığı gibi adım 2.10 başlamasından sırasında, enjeksiyon siteleri dilim kesti. su banyosu dilimler geçmesi burada gerekli değildir. İsteğe bağlı: hızlı, enjeksiyon yeri konumunu tahmin floresan lamba ve uygun filtre setleri ile donatılmış bir Stereoskop dilimleri gözlemlemek.
  12. iki filtre kağıtları ve Dalg arasına sandviç by-hoc sonrası analizi için enjeksiyon siteleri içeren dilimleri FixPBS çözeltisi O / N% 4 paraformaldehid (PFA) bunları dig. Enjeksiyon sitelerin analizi için adım 4.1 ile devam edin.

Presinaptik Liflerin 3. Görselleştirme ve Uyarım

  1. liflerin ve hücrelerin Optogenetic aktivasyonu için yama mikroskop hazırlanması:
    1. Işık teslimat yolunun üzerine monte ışık yayan diyot (LED) merkezi.
    2. arka odak düzlemi de ve 470 nm uygun dalga boyu seçiminde bir güç metre ile her bir amacın çıkışında LED ışık yoğunluğunu ölçün.
    3. MW / mm 2 ışık yoğunluğunu hesaplamak ve 470 nm dalga boyundaki için ölçülen değerler için her hedef için (ışık çıkışı (mW / mm2) karşı LED yoğunluğu (%)) bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
  2. Bir floresan lamba ile donatılmış dik mikroskop üzerine monte dilim odasında arayüz odası ve yerden akut amigdala dilim almak. dilim böyle dilim konumlandırmak için özenarayüz odasında yukarı bakacak e yüzeyi de kayıt odasında yukarı bakacak. ~ 31 ° C'lik bir sıcaklıkta, 2 ml / dak - 1 bir oranda taze oksijenli ASCF sahip dilim serpmek.
  3. ifade spesifik floresan proteini için uygun filtre setleri ile birlikte floresan lamba kullanarak dilim presinaptik liflerin gözlemleyin. Bir genel (Şekil 1 E) ve hedef alanı içinde lif yoğunluğu değerlendirmesi için 60x objektif elde etmek için 5x amacı kullanın.
    GFP ve YFP için, kullanım Filtre belirtilen MCherry "kırmızı" (Uyarma 560/40, ışın ayıracı 585, Emisyon 630/70) set filtre kullanın için "yeşil" (Uyarma 472/20, ışın ayıracı 495, Emisyon 490 LP) ayarlayın: Not malzemeler / ekipman tabloda.
  4. Aç veya deney (Şekil 2D) için arzu edildiği şekilde bir mikroskop ışık yolu diyaframı kısıtlar.
  5. Bir yama kayıt elde etmek için, iç çözümü ile bir yama pipet doldurmak ve ben montajn-elektrotu tutucu. yama pipet pozitif basınç uygulayın ve yavaş yavaş mikromanipülatör kullanarak dilim içine görsel kontrol altında ilk banyo çözeltisi içine ve sonra indirin.
    1. yan ve üstten yama pipet ile ilgi nöron yaklaşın. Pipet (hücre yüzeyinde girinti görünür) hücrenin yüzeyi üzerinde olduğunda, pozitif basınç serbest bırakın ve negatif basınç uygulanarak, bir "gigaseal" elde edilir.
    2. tam hücreli kayıt elde etmek için membran yama rüptüre daha emiş uygulayın. Daha sonra, hücreden elektrik yanıtları kaydederken Chr (470 nm) aktive etmek için uygun dalga boyu kullanılarak bağlanan LED ile etiketlenmiş lifleri uyarır.
    3. sinaptik stimülasyonu için düşük LED yoğunluğu ile başlar ve istenen sinaptik akım genliği ulaşılana kadar artar. Zamanlama ve darbe uzunluğu Şekil (örnekler kontrol etmek için veri toplama yazılımı dijital çıkışları yapılandırarak LED tetik3).
      Not: diğer yazılım ve / veya TTL üreten cihazlar LED tetiklemek için kullanılabilir.
  6. ve / veya belirli ilaçların mevcudiyetinde aşağıdaki kaydedilen hücre için arzu edildiği gibi mikroskop ışık yolu açılmış ya da sınırlı açıklığı (aşama 3.4) ile tekrar uyarılması.
  7. Kayıttan sonra, iki filtre kağıtları arasına sandviç ve% 4 PFA O / N onları daldırarak-hoc sonrası analizi için dilimleri düzeltin.
  8. elektrofizyolojik verileri analiz edin.
    Not: Uygun yazılım her uyarım çevrimdışı kaydedilen tarama verileri görselleştirmek için. ilaçların etkilerini analiz ederken, tüm bireysel tarama için sinaptik akım genlikleri uyuşturucu etkisinin zaman sürecini elde etmek için zirve algılama rutinleri kullanın. ilaç etkisi kararlı duruma ulaştığında belirleyin. Deneysel koşul başına ortalama ≥10 bireysel Piyango yazılım kullanın, rakamlar için temsili ortalama yanıtları hazırlamak için (cf Şekil 3B-D, FHJ sağ panel).
    Not: Birkaç alternatif yazılım paketleri veri analizi için kullanılabilir.

Enjeksiyon Siteleri 4. Post-hoc analizi

  1. ve (yeniden görüntüleme adımı 3,7, arzu edildiği takdirde), PBS içinde üç kez sitesi kayıt (adım 2.12) enjeksiyon bölgesi dilimleri yıkayın. Bu arka arkaya 10 dakika için bir döner sallayıcı üzerinde taze PBS ile üç kez çözelti değiştirerek yapılır.
  2. PBS içinde% 2 agar-agar çözeltisi hazırlayın ve ~ 65 ° C'ye kadar soğumaya bırakın. Bir küçük 30 mm çaplı petri altındaki düz yer dilimleri, agar-agar dilimleri gömmek ve katı kadar soğumasını bekleyin.
  3. Bir vibratome aşamasında gömülü dilim veya dilimleri ile bir agar bloğu Tutkal ve PBS ile odasını kesme sahne yerleştirin.
  4. Rezeksiyon 70 mikron kalınlığında dilim gömülü. İsteğe bağlı: rezeksiyon sonra, dilimler, hücre mimarisini (Şekil 3A, C) ortaya çıkarmak için NeuroTrace ile, yani lekeli olabilir ve / veya bYFP veya mCherry için y immünofloresan boyama Chr füzyon proteininden sinyalini arttırmak için.
  5. montaj medya ile slaytlar ve lamel üzerine monte dilimleri. Resim enjeksiyon bölgesi ve eğer istenirse, bir flüoresan mikroskop veya konfokal lazer tarama mikroskobu (Şekil 2A-C) projeksiyon alanlarda lifler ihtiva eden, aynı zamanda görüntü dilimleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu bölümde, duyusal ve modülatör BLA uzun menzilli projeksiyonlar ve mpITC nöronlar yanı sıra mpITC ve BLA arasında yerel bağlantı özelliklerinin fizyolojik özelliklerini araştırmak için bir ex vivo optogenetic yaklaşım ve farklı deneysel stratejiler temsili sonuçların akışını gösterir.

Fare beyin arzu edilen koordinatları için seçilen viral vektörün stereotaktik enjeksiyon sonrasında (Şekil 1A-C viral ekspresyon süresi 2-6 hafta, deneye bağlı olarak), amigdala enjeksiyon siteleri ve projeksiyon burada akut beyin kesitleri hazırlanır patch-kelepçe deneyler için ve enjeksiyon bölgelerine (Şekil 1D)-hoc sonrası analizi için enjekte edilen beyin bölgesinden uygun açıda. kayıtları ve optogenetic stimülasyon, floresan etiketli hücreleri veya aksonal pro başlamadan öncehedef alan (amigdala) 'de jections bağlı floresan lamba (Şekil 1E) kullanılarak yama-kelepçe kayıtları için dik mikroskop kontrol edilmelidir. Zaman noktası, aralık ve darbe uzunluğu ışık yayan diyot (LED) tetikleyen yama yazılımı aracılığıyla kontrol edilir dilim projeksiyon bölgesinde varsayımsal bir hedef hücreye kayıt yama-kelepçe elde sonra, ışık uyarımı başlatılır. Deneysel stratejiye bağlı olarak (Şekil 2A-C, sağ) floresan ışık yolu diyafram tamamen açık ya da (Şekil 2B) sınırlıdır ya. Darbe uzunluğu sabit ve olabildiğince kısa tutulması da (ideal ≤1 msn), LED çıkış yoğunluğu yavaş belirli bir deney (Şekil 2E) sinaptik tepkinin istenen genlik elde etmek için gerekli olan yoğunluğunun değerlendirmek için arttırılır. Kayıttan sonra, amigdala dilimleri sonradan tespit vardır. rezeksiyon ve opsiyonel üzerineboyama, enjeksiyon ve kayıt siteleri enjeksiyon yerini doğrulamak ve yersiz enjeksiyonlar verileri dışlamak için bir konfokal mikroskop görüntülü. Enjeksiyon sitelerin görüntüleri ve üç deneysel stratejiler amigdala ilişkili aksonal projeksiyonları (BLA için MPFC girişler mpITCs için talamik girdiler ve yerel mpITC aktivasyonu) Şekil 2A-C'de gösterilmiştir.

Şekil 3, kullanılan farklı deneysel stratejileri için ışık uyarılmış yanıtların özellikleri (Şekil 3A, E, I) gösteren BLA ana nöronların elde edilen temsili bir kayıt sonuçları, lokal BLA internöronlardan ve mpITC nöronlar gösterir. Kayıt için GABA'erjik nöronlar (yerel internöronlardan ve mpITCs) hedeflemek için, GAD67-GFP muhabiri fareler 24 kullanılmıştır. MPFC ve duyusal talamik projeksiyonlar, sinaptik iletim çeşitli yönleri ele alınabilir. ac zamansal hassastivation ve bu çalışmada kullanılan Chrs kinetik özellikleri 50 msn arası uyaran-aralıklarla eşleştirilmiş darbeleri ile güvenilir stimülasyon sağlar. Bu projeksiyon ve hedef hücre tipine bağlı olarak kolaylaştırıcı ya da iç karartıcı olabilir ve presinaptik bırakma olasılığı göstergeleri (Şekil 3B, F, H) olarak hizmet verebilir ya postsinaptik akımlar (PSC), eşleştirilmiş-nabız oranları (PPR) analizi için izin verir . Buna ek olarak, sinaptik gecikmeleri analizi farklı postsinaptik yanıt bileşenleri diseksiyon sağlar.

Bu örnekte, uyarıcı PSC (EPSC) bileşeninden karşılık önleyici PSC (IPSC) daha uzun gecikme süreleri, bir disinaptik ve monosinaptik giriş sırasıyla (Şekil 3C) göstermektedir. Diğer durumlarda, bu tür tepki titreme veya yanıt boyutu varyans katsayısı gibi ek EPSC özelliklerinin daha kapsamlı bir analiz, mono veya disyna üzerinde sonuçlara varmak için gerekli olabilirptic doğa 17,23. Bundan başka, belirli bir reseptör için farmakolojik blokerlerin uygulama PSC'lerin doğasını belirlemek (yani, glutamaterjik EPSC ve GABAerjik IPSC, Şekil 3C-D). Beklendiği gibi geç bileşen GABAerjik iken, MPFC girdi erken bileşeni glutamaterjik oldu. glutamat reseptör blokeri CNKX hem EPSC ve IPSC tam blok daha IPSC disinaptik olduğunu desteklemektedir. Optogenetically aktif liflerin sinaptik iletim modülasyonunu araştırmak için, genlik ve PPR ilgili metabotropik reseptörler için agonist ve antagonistlerinin etkisi (burada GABA B reseptörleri) öncesi ve sinaps sonrası alanları ile ilgili etkileri değerlendirmek için değerlendirilebilir. Bu örnekte, PPR bir artış ile amplitüd birlikte azalma ışık aktif liflerin (3G, lH) bir presinaptik modülasyonu göstergesidir. Son olarak, amigdala hücrelerin lokal etkileşimleri değerlendirilebilir, örneğin,Tac2 promoterinin 25 kontrolü altında CRE ekspres farenin çift floxed CHR ifade edici viral vektörle (Şekil 1C) ile enjekte edilir. Tac2 ve böylece, CHR mpITC ve merkezi amigdala (Şekil 2C) ifade edildiği için, ışık aktivasyon floresan ışık yolu açıklık (Şekil 2D) kapatarak mpITC ile sınırlandırılmıştır. Bu koşullar altında, hafif uyandırılan edim potansiyellerinin enfekte mpITCs de elde edebilir. BLA kısa gecikme önleyici sinaptik tepkiler mpITC ve BLA ana nöronlar arasında fonksiyonel önleyici bağlantı olduğunu göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1. Stereotaktik Enjeksiyonlar, Akut Beyin Dilimleri hazırlanması ve presinaptik Elyaf Görselleştirme. (A, B) Stereotaktik virüs enjeksiyonu. kafatası ile stereotaktik çerçeve yerleştirilir anestezi fare A) Resim maruz kalan veEnjeksiyon pipet. Ankastre: hızlı yeşil ile karışık virüs çözümü ile dolu enjeksiyon pipet resimde Yakınlaştırma. Ölçek çubuğu: 3 mm. Farklı enjeksiyon alanları için delme belirgin pozisyonları ile bir fare kafatası (B) şematik. (C) Şema Bu çalışmada kullanılan farklı viral yapıları gösteren. Koyu gri: promotör sekansı; mavi: Channelrhodopsin2 (ChR2 (H134R)); kırmızı, yeşil /: floresan protein. MPFC ve MGM / PIN gelen projeksiyonlar 6 hafta - İfade zaman yerel amigdala projeksiyonlar 2 hafta ve 4 oldu. Akut beyin dilimleri (D) preparasyonu: Şema farklı uygulama ve projeksiyon alanlarından dilimleri elde etmek için dilimleyici sahnede fare beyin yerleştirilmesini gösteren. (E) MGM / PIN ChR2 mCherry virüsü enjekte bir GAD67-GFP fare akut beyin dilimleri liflerin Görselleştirme. Resimler farklı filtre setleri ile dik yama mikroskop alınır: GAD67-GFP, orta; MGM / PIN lifleri MC ile etiketlenmişHerry, doğru. Ölçek çubuğu: 200 mikron. MPFC medial prefrontal korteks; mpITC medial paracapsular interkalate hücreleri; BLA, bazolateral amigdala; MGM, medial genikülat çekirdeği, medial kısmı; PIN, talamik nükleus intralaminar arka; LA, yanal amigdala; BA, bazal amigdala; CEA, amigdala merkezi çekirdeği. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. Enjeksiyon Sahası, Projeksiyon Alanları ve Aksonal Projeksiyonlar optogenetic stimülasyonu. (AC) BLA temsilcisi enjeksiyon siteleri ve projeksiyon alanlarının Konfokal görüntüleri ve deneysel stratejiler şemaları. Sol (A): NeuroTrace ile boyanmış C57BL / 6 farede MPFC enjeksiyon bölgesi. Ölçek çubuğu:500 um. Orta: Eğik bir amigdala dilim BLA projeksiyonlar gelir. Ölçek çubuğu: 200 mikron. Sağ: MPFC projeksiyonlar ve BLA nöron kayıt tüm alan aydınlatma şematik. Sol (B): Bir GAD67-GFP fare MGM / PIN enjeksiyon yeri. Ölçek çubuğu: 500 mikron. Orta: koronal amigdala dilim mpITC ve LA Sorumlu projeksiyonlar. Ölçek çubuğu: 200 mikron. Sağ: Bir mpITC nöronun MGM / PIN projeksiyonları ve kayıt tüm alan aydınlatma şematik. Sol (C): Bir Tac2-Cre fare NeuroTrace lekeli amigdala dilim ChR2 YFP Yerel ifadesi. Ölçek çubuğu: 200 mikron. Ankastre: Yakınlaştırma ChR2 YFP ifade mpITCs içinde. Ölçek çubuğu: 20 mikron. Sağ: Bir BLA nöronun mpITC küme ve kayıt sınırlı aydınlatma şematik. Açık ve sınırlı aper bir GAD67-GFP fare akut beyin dilimleri nöron ışık teslimat ve görüntü (mpITC küme) sırasında odasını kayıt (D) ResimleriTure. Ölçek çubuğu: 30 mikron. Farklı LED yoğunlukları (üst) ve ışık gücünün arsa uyandırdığı (E) eksitatuvar postsinaptik akımlar (EPSCs) karşı mgm / PIN liflerinin Optogenetic aktivasyonu üzerine bir temsili mpITC nöron EPSC genliği (alt) uyarılmış. Ölçek çubuğu: 100 pA / 10 milisaniye.
Not:. Şekil 2A referans # 23 referans # 16 ve Şekil 2C modifiye edilir , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Deneysel strateji Şekil Uzun Range ve Yerel Projeksiyonlar optogenetic aktivasyonu 3. Örnek sonuçları. (A) Programı (BD). (B) BLA ana nöron kaydedilen Temsilcisi EPSCs veMPFC gelen liflerin optogenetic eşleştirilmiş-darbe stimülasyon (50 msn arası uyaran-aralık) üzerine BLA interneuron sırasıyla darbe kolaylaştırma ve eşleştirilmiş nabız depresyon eşleştirilmiş yol açan. Ölçek çubuğu: 100 pA / 25 milisaniye. MPFC liflerinin (C) optogenetic aktivasyon ileri beslemeli engellenmesini ortaya çıkarmaktadır. Bir BLA asıl nöron (-70 mV) Temsilcisi EPSC ve (0 mV IPSC) inhibitör postsinaptik akımı: Sol. IPSC EPSC kıyasla daha uzun bir gecikme süresi sinaptik sahiptir. Ölçek çubukları: 200 pA / 10 msn ve 200 pA / 2 msn. Sağ: Işık ayrıca IPSC ve disinaptik doğasını destekleyen, AMPA / Kainat antagonisti CNKX (10 mikron) tarafından engellendi (-50 mV) bifazik EPSC / IPSC dizisi uyarılmış. Ölçek çubuğu: 50 pA / 5 ms. Kanal blokeri olarak da Pikrotoksinin (PTX, 100 uM) ve PTX + CNQX - Cl (-50 mV) EPSC / IPSC sekansının takip eden bloğun (D) etkileri. IPSC PTX ve CNQX kalan EPSC tarafından engellendi. Ölçek çubukları: 50 pA / 5 ms. (Deneysel strateji E) Şema (FH) hazırlandı. F) mpITC ve MGM / PIN gelen liflerin optogenetic eşleştirilmiş darbe stimülasyon üzerine bir BLA ana nöron kaydedilmiş Temsilcisi EPSCs. Ölçek çubuğu: 50 pA / 20 milisaniye. Başka mpITC nöron (G) EPSCs onlar sodyum kanal aktivitesine bağlı olduğunu gösteren, sodyum kanal blokörü Tetrodotoxin (TTX, 0.5 uM) tarafından engellenir. Ölçek çubuğu: 50 pA / 20 milisaniye. (H) mpITC nöronlara Talamik girdiler presinaptik GABA B reseptörleri tarafından modüle edilir. Kontrol koşulları altında EPSCs, GABAB agonistleri Baklofen (2 uM) uygulanması sırasında eşleştirilmiş darbe oranında EPSC genlik ve eşlik eden bir artış azaltılması ve her iki genlik kazanımı ve GABAB antagonisti CGP55845 birlikte uygulanması üzerine eşleştirilmiş darbe oranını başlangıç (10 uM). Bu değişiklikler, GABA B reseptörleri ile presinaptik modülasyonu göstergesidir. Ölçek çubuğu: 50 pA / 20 milisaniye. (J) için deneysel strateji (I) 'in Şema. (J) mpITC nöron ifade eden bir ChR2 YFP kaydedilen aksiyon potansiyelleri Işık uyarılmış. Farklı tutma potansiyelleri bir BLA asıl nöron kaydedilen ışık uyarılmış iPSCs (-90, -70, -50, -20 ve 0 mV) Cl için hesaplanan denge potansiyeli civarında ters -. Ölçek çubukları: 20 mV / 100 milisaniye ve 10 pA / 10 milisaniye. Not:. Şekil 3B-D Referans # 16 değiştirilmiş ve Şekil 3H ve J referans # 23 den olan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol değilse tüm kolayca çoğunda uygulanabilir nöral devreleri ve yerel bağlantı ex vivo optogenetic soruşturma için bir yöntem açıklanır, Epifloresans ışık limanda bir LED ~ 470 nm ile donatarak dik dilim patch-kelepçe kayıt kurulumları. dilimleri aksonal çıkıntıların Optogenetic uyarım önemli bir avantajı, mukabil lif yollarının bilinmemektedir açık bir şekilde tanımlanmış olup, ya da korunmuş değildi, çünkü belirli bir aktivasyonu ve konvansiyonel elektrik stimülasyonu ile erişilebilir değildi bağlantı özelliklerinin araştırılması için izin vermesidir tek bir beyin dilim. korku devreleri hakkında önemli bir örnek olarak, bu amigdalaya MPFC girişlerin özelliklerini incelemek için nasıl uygulanabileceğini gösterilmektedir.

Hatta elektrik lif yolu stimülasyon yoğun geçmiş çalışmalarda kullanılır olmuştur durumlarda, bu yollar genellikle kökenli farklı bölgelerinden lifleri taşıyan. Örneğin, öğrenme korku ile ilgili devrelerde, talamik çekirdekler veya kortikal bölgelerin farklı duyusal gelen projeksiyonlar sırasıyla iç ve dış kapsül ile iç içe çalıştırmak. Optogenetic stimülasyon avantajı belirli bir bölgeden bir elyaf alt-grup seçici aktivasyonunu mümkün kılmasıdır. Bu interkalate hücreler ve yanal amigdala ana hücrelere PIN ve MGM belirli talamik girişler için gösterilmiştir. Ayrıca, elektrik stimülasyonu, örneğin, hedef alanda lokal bağlantı yapabilir uyarıcı elektrot civarında geçit veya diğer hücre elyaf aktivasyonu ile ortaya çıkan sorunların üstesinden gelinebilir. Optogenetic Uyarım Elektriksel uyarım, eşit hızlıdır ancak bununla birlikte, güvenilir bir şekilde uygulanabilir stimülasyon frekansı ile ilgili sınırlamalar olabilir. Bu expressio gibi inaktivasyonu ve deinactivation kinetiğine ve kullanılmakta olan CHR varyantı 4 bağlıdırn seviyeleri ve yöntemleri ve hafif stimülasyon yöntemleri 26.

Işık uyarılması için floresans noktasına monte edilmiş bir LED kullanarak, belirli bir hedef görüş genellikle bütün alanı alanındaki tüm fiber ya da hücrelerinin aktivasyonu ve belli bir derinliğe içindeki neticede elde edilen, aydınlatılır. Bu sadece kısmen daha küçük bir bölge ile sınırlı veya etiketli hücrelerin ayarlanabilir (bu örnekte, mpITC) floresan ışık yolu 23,27 bir diyafram kullanarak. yüksek güç mavi LED'ler artık birçok üretici edinilebilir olarak LED'lerle, ışık gücü, bir sorun değildir. Fakat, emisyon spektrumu nanometre onlarca tam genişlikte yarı maksimum değerlerine sahiptir. bağlantı ve / veya tek renkli stimülasyon hücre içi haritalama için mekansal hassas uyarım ya istenen nedenle, LED'ler sınırlamaları oluşturmaktadır. Her iki tar etkinleştirmek daha karmaşık kurulumları ile tipik bir arada, ışık kaynağı olarak mavi lazerler kullanılarak geliştirilebilirgeting ve / veya küçük alanlarda kirişin tarama ve tanımlanmış doku derinliği (örn, 28 bakınız).

Ex vivo Optogenetic yaklaşım, burada açıklanan ile sinaptik iletim çeşitli özellikleri incelenebilir. Erken sinaptik tepki bileşeninin, gecikmeleri ve ayrıntılı bir analiz ve titreşim monosynapticity yanı sıra tepki genlik değişimini değerlendirmek için kaydedilen nöronlar (örn 16,17,23 bakınız) temsili bir numune üzerinde kullanılmalıdır. Ağ etkinliğinin aktivasyonu rol oynayabilir durumda, tercih edilen bir yöntemdir (potasyum kanal blokeri 4-aminopiridin ile kombinasyon halinde aksiyon potansiyelleri engellemek için tetrodotoxin (TTX) oluşan bir bileşime başvurarak doğrudan monosinaptik bileşenini izole etmek için, 4- AP) repolarizasyon 14,28,29 önlemek için. girişlerin mono- ve disinaptik bileşenleri reseptörlerin farmakolojik blokerler kullanılarak tespit edilebilir. FurthermorE, amigdala 23,30 bölgesindeki optogenetically aktive girdilerin presinaptik modülasyonu yönlerini incelemek mümkündür. Potansiyel bir uyarı ChR2 bir kalsiyum geçirgenliği 1,4 sahip presinaptik elyaf ve terminallerde aktivasyonu çeşitli mekanizmalarla 26,31 salım olasılığını değiştirmek için önerilmiştir olmasıdır. Bununla birlikte, amigdala eşleştirilmiş puls oranlarında hücreye özel farklar ve diğer beyin alanları 16,23,26,32 girdi-tanımlanması ve hedeflenmesinde için başarılı bir şekilde kullanılmıştır ChR2 ifade gösterilen örnekler ve aktivasyonu ile açma olasılığı Ayrıca gösterilen modülasyon dahil olmak üzere çeşitli çalışmalarda CHR aktivasyonu 23,30 engellemediği değildi presinaptik terminallerde belirli sinyal yollarının. Daha fazla destek gösteren hipokampus ve beyincik verilerden geldiği uygun CHR ifade yöntem ve hafif stimülasyon tekniği, serbest bırakılması ve sadakat o etkinliği de dahil olmak üzere fizyolojik yönleri ilef sinaptik iletim güvenilir 26 incelenebilir. Son olarak, optogenetic lif aktivasyonu de başarıyla sinaptik plastisite 31,33,34 neden stimülasyon protokolleri uygulamak için kullanılır olmuştur.

Çeşitli yönleri Bu yöntemin başarısı için kritik öneme sahiptir. Bir viral vektörlerin stereotaktik hedefleme hassas olduğunu. Nedenle, hızla kayıtları almadan önce enjeksiyon bölgesinde konumunu değerlendirmek ve daha sonra daha detaylı bir post-hoc analizi gerçekleştirmek için faydalıdır. mekansal hassas yanı sıra, enjeksiyon yerinde nöronların canlılığı başarılı bir deney için önemli bir belirleyicisi olan ve enjeksiyon tekniği bağlıdır. Uzun ve ince konik cam elektrotlar kullanılarak sunulan seçenek, yüzeysel ve derin beyin alanları hem de bu amaca hizmet eder, ama konik çok esnek dezavantaj olabilir. Bir alternatif, özellikle nörobilim (nöro-s stereotaksik teslimat için geliştirilen mikrolitre şırınga kullanmakyringes), küçük hacimli dağıtabilen daha sert iğne ile. Amigdala enterkale hücreler için gösterildiği gibi tanımlanır hücre tipleri ve bölgelere CHR-ifade hedefleme özgüllüğü, bundan başka, Cre-sistemi ile, örneğin, koşullu ifade 7 kullanılarak geliştirilebilir. Bu aynı zamanda, Kre-bağımlı viral vektörler, kuvvetli promotörlerin kullanımına izin verir.

Başka kritik bir yönü, viral vektör seçimdir. CHR ifade etmek gerekirse, rekombinant Adeno-ilişkili virüsler (rAAVs) diğer popüler viral sistemleri ile karşılaştırıldığında bir biyogüvenlik düzeyi 1 vektörleri olmanın avantajına sahip olan kullanıldı. rAAVs bir süre kullanılmış ve iyi nöral tropizm ve çok az veya hiç bağışıklık potansiyeli olan, güvenli ve güvenilir vektörler genellikle, ama onların ambalaj hacmi (yakl. 4-5 kb) 35 sınırlıdır. Bu özel deneylerde, 2/9 ve 2/1, sırasıyla, her yerde bulunan ve şartlı ekspresyon için kullanılmıştır serotipleri. Literatürde uygun olarak,se serotipleri hedef bölgedeki hücreleri nakletmek, ancak serotipleri 2/5 ve 2/6 36,37 aksine, etiket hücreleri retrograd için akson tarafından alınan gözükmemektedir. Ancak, ilk deneyler gibi MPFC ve amigdala gibi karşılıklı bağlı beyin bölgeleri incelenirken özellikle önemlidir enjeksiyon yerinde, projelendirme alanlarında CHR-etiketli hücre gövdeleri olduğunu dışlamak gerekir. Son zamanlarda yapılan bazı çalışmalar, farelerde ve sıçanlarda 36,38,39 farklı beyin bölgelerinde rAAV serotiplerinin etkilerinin karşılaştırılması. Yeni ortaya çıkan bir tema yeni serotipleri (örneğin, 2/1, 2/8 ve 2/9), genellikle daha verimli orijinal 2/2 serotip daha olmasıdır. Ayrıca dikkat, diğer yöntemlerin aksine, CHR rAAV aracılı ekspresyonu nedeniyle, hücrelerin ya da etiketlenmiş aksonlar 40 ifade eden zararlı etkilere neden olmadı. Gerekli ifade süre etkin fiber aktivasyonunu elde etmek için ex vivo olarak çalışılan projeksiyon mesafeye bağlı görünmektedir. Burada ve lite ile uyumlurature, etiketleme ve uzun menzilli bağlantılarının aktivasyonu fare (MPFC ve duyusal girdilerin), 4 ifadesidir zaman - 3 hafta olan - 2, amigdala daha kısa ifade süreleri yerel bağlantı eğitimi için ise gerekli olan 8 hafta 14-17,23,30,34 yeterlidir.

Hedef alanında optogenetically tetiklenen tepkiler kayıt için, iki faktör önemlidir: 1) Akut beyin kesiti kaliteli ve 2) uygun bir etiketli bir lif önemli miktarda korunması gereken olması gerekmektedir. dilim kalitesi dilimleme için safir bıçak kullanılarak geliştirilebilir. Işık yanıtların akson korunması ve böylece, boyut ve stabilite MPFC-amigdala çıkıntılar (Şekil 1B ve 2A) 16,34 için gösterildiği gibi, belirli bir açı ile dilim kesme iyileştirilebilir. Bununla birlikte, bu güçlü hedef bölgede ileticilerin yönlenmesine bağlıdır ve projeksiyon alanı ve ta her kombinasyonu için tespit edilmesi gerekecektirrYer bölgesi. Bu bağlamda, hedef bölgede çıkıntı post-hoc analizi yararlı olabilir. lif algılama ve istihdam edilebilir CHR füzyon proteinine floresan etiketi karşı immün, dilim uyarılması sırasında meydana gelmiş olabilir hileli ağartma artırmak için.

Genel olarak, optogenetic devre haritalama bu yöntem son zamanlarda sadece beyinde devreleri, ama birçok diğer sistemlerin korku uygulanmamıştır. Gelecekte, genetik olarak tadil edilmiş hücre soylarının ve şartlı viral vektörlerin artan bir dizi birleştirilerek subnuclei ve özel hücre tiplerinin hedeflenmesi özel yerel ve uzun vadeli devrelerinin fonksiyonel sinaptik özelliklerinin çeşitlilik daha da detaylı bir anlaşılmasını sağlayacaktır. Ayrıca, incelenen fonksiyonel bağlantıları floresan etiketli CHR'ın post-hoc immün ultrastrüktürel analizi ile kombine edilebilir (yani, elektron mikroskobik yöntemler kullanılarak) hassas mor içgörü sağlamak içinDaha önce aktive sinaps phological özellikleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585 Filters can be bought as set F46-008
                     (emission) AHF, Germany F47-630 Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (emission) AHF, Germany F76-490 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (24), 13940-13945 (2003).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13, (4), 251-266 (2012).
  4. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, (1), 9-34 (2011).
  5. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, (5), 663-668 (2007).
  6. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, (6), 3166-3173 (2006).
  7. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).
  8. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).
  9. Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90, (2), 419-463 (2010).
  10. Myers, K. M., Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12, (2), 120-150 (2007).
  11. Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33, (1), 56-72 (2008).
  12. Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13, (6), 728-733 (2006).
  13. Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36, (2), 529-538 (2011).
  14. Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80, (6), 1491-1507 (2013).
  15. Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34, (47), 15601-15609 (2014).
  16. Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).
  17. Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10, (9), 1435-1442 (2015).
  18. Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning. Neuropharmacology. 52, (1), 215-227 (2007).
  19. Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62, (6), 757-771 (2009).
  20. Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247, (2), 246-271 (1986).
  21. Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31, (13), 5131-5144 (2011).
  22. Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234 (2012).
  23. Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86, (2), 541-554 (2015).
  24. Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467, (1), 60-79 (2003).
  25. Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, (2012).
  26. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34, (22), 7704-7714 (2014).
  27. Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16, (3), 332-339 (2013).
  28. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, (7233), 1142-1145 (2009).
  29. Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79, (4), 658-664 (2013).
  30. Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32, (42), 14815-14820 (2012).
  31. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4, (2), 139-141 (2007).
  32. Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76, (4), 790-803 (2012).
  33. Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14, (11), 1413-1415 (2011).
  34. Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31, (1), 339-345 (2011).
  35. Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4, (5), 353-364 (2003).
  36. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8, (9), (2013).
  37. Salegio, E. A., et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20, (3), 348-352 (2013).
  38. Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, (2014).
  39. McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109, (3), 838-845 (2009).
  40. Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, (2013).
Beyin Dilimleri Korku Devre <em>Ex Vivo</em> optogenetic Diseksiyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).More

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter