Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Yetiştirme İlk Besleme Zebra balığı için komple ve Güncelleme "Rotifer Polikültür Metodu"

Published: January 17, 2016 doi: 10.3791/53629

Introduction

Zebra balığı (Danio rerio), bilimsel disiplinlerin giderek artan sayıda kullanılan bir seçkin laboratuvar hayvanları da dahil olmak üzere, ancak gelişim genetiği, toksikoloji, davranış, yetiştiricilik, rejeneratif biyoloji ve birçok insan bozukluklarının 1 modellenmesi ile sınırlı değildir - 5. Türlerin laboratuarda bakımı nispeten kolay olmasına rağmen, kendi kültürlerine 6 ile ilgili yönetim zorlukları bir dizi vardır. Bunların en göze çarpan balık ilk gaz mesane enflasyon 7 sonraki beslemeye başlar, özellikle larva yetiştiriciliği olduğunu. Büyüme 5 gün özellikle kritik 7 olmak - Normal, kontrollü koşullar altında, bu gelişimsel olay aşağıdaki 3 5 ~ at gün sonrası döllenme (dpf) oluşur. Yem öğeleri, Diges uygun büyüklükte olmalıdır - bu aşamada merkezi teknik zorluk yeterince birinci besleme larvaların beslenme ihtiyaçlarını karşılamak içinkültür tankları aşırı atık oluşturmadan neredeyse sürekli olarak cazip ve uygun ludur,. Tarihsel bu rutin su değişimi 8,9 ile birlikte, tanklarda balık yem sayısız küçük miktarlarda sunarak genellikle elde edilmiştir. Bu yöntemler, bir dereceye kadar başarılı olsa da, bunlar, verimsiz yüksek işçilik girdileri gerektirir ve sadece değişken ve büyüme ve hayatta kalma 10 sınırlı fiyat döndürür.

Doğada, Zebra balığı larvaları muhtemelen su kolonu 11 bol küçük zooplankton mevcut beslenirler. Bu nedenle, bu tür Paramecium, rotifer ve Artemia olarak canlı yayınları dahil larva protokolleri genellikle 7 en verimli. 2010 yılında, En İyi ve ortak yazarlar bu eksojen beslenme 12 ilk 5 gün tuzlu su rotifer ile birlikte statik, tuzlu suda larva zebrafish büyümek mümkün olduğunu gösterdi. Koşum Bu yaklaşım,es rotifer kültürlerin doğal yüksek verimlilik, düşük emek girdisi 12,13 ile larva büyüme ve hayatta kalma verimleri çok yüksek fiyatlar, su kirletmeden bol, oldukça besleyici av sağlamak. Son yıllarda, tüm dünyada laboratuvarlar giderek artan sayıda, bu protokolün varyasyonlarını benimsemiş ve birçok şimdi yetiştirme sistemlerinin 14 desteklemek için sürekli bir şekilde rotifer kültüre edilir.

Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, rotifer / Zebra balığı polyculture ve rotifer üretimi hem yöntemleri rafine ve daha standart ve kolayca ölçeklenebilir olma geliştirilmiştir. Bu makalede, 1 için adım adım yönergeler) sürekli ve sağlam rotifer üretimi ve 2) eksojen beslenmenin ilk 5 gün balık sağlam büyümeyi desteklemek için kullanılan rotifer / Zebra balığı polikültür sisteminin kurulmasını sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rotifer Kültürü

  1. 100 L Kültür Gemi kullanarak Kültür Sisteminin Temel Bileşenleri
    1. Rotifer kültür kurulumu için tüm bileşenleri toplayın. Rotifer kültür kurulum rotifer büyümek için bir kültür kabına (CV) oluşur; Benzer bir kap çıktıya da rotatorların (çıktıya da kültür kabı, FCV) korumak; yuvarlak dipli bir kuluçka kavanoz yosun yem karışımı (AFM) depolanması için (Reservoir, FR Yem); bir hava beslemesi (AS) CV, FCV'nin ve FR havalandırmak için; CV ve FCV içine yosun yem verilmesini kontrol etmek için bir ölçüm zamanlayıcısı (PMT) ile bir peristaltik pompa; ve CV içinde oturur bir ipi partikül filtresi (FPF).
      NOT: malzeme ve bileşenlerinin tam listesi Malzeme Listesi'nde sağlanmaktadır.
  2. Yapılandırma
    1. Kültürler kolayca toplama cont içine uydurma bir drenaj yoluyla hasat edilebilir ve böylece bir stand veya masa üzerinde CV ve FCV ElevateAiner (Şekil 1). Her bir kültür kabı içinde sert bir boru uzunluğu konusundaki bağlamak için esnek bir hava besleme hortumu kullanın. Boru CV veya FCV altına hava sağlamak için yeterince uzun olduğundan emin olun.
    2. AFM içeren FR altına uzanan sert bir boru uzunluğu AS bağlanmak için bir küçük kapasiteli hava hattı kullanın. Hava akışını düzenleyen, her hava hattına bir valf takın. Besleme boru ile PMT ile FR bağlayın ve üstüne yakın, CV / FCV'nin tarafına açılan bir deliğe PMT hortumunu çalıştırın. Şekil 1.
  3. Başlamak
    1. Ters osmoz, su (RO) ile birlikte kullanılabilir hacmi% 90 kültür kabı doldurun. RO mevcut değilse, temiz, dechlorinated belediye su kullanın; Bununla birlikte, bir biyo-güvenlik risk değerlendirmesi herhangi bir potansiyel olarak patojenik organizmalar kaynağı, su içinde mevcut olmasını sağlamak için gerçekleştirilmelidir. NOT: Bu tür bir analiz gerçekleştirilebilirHerhangi bir yetkili su test laboratuarı tarafından.
    2. 15 g / L tuzluluk ulaşmak için akvaryum tuz ile kültür gemi su Doz. Bir "yuvarlanan kaynama" korur, böylece teknenin içine hava akışını alan ve tamamen havalandırma ile eriyene kadar yavaşça kültür teknesine tuz ölçülen miktarını ekleyin. Tam oksijen sağlamak için> 1 saat boyunca su havalandırma devam edin.
    3. Yosun yem karışımı olun. Temiz 3 L için taze (0 ppm) suda NaHCO 3 100 g ve amonyak nötrleştirici (sodyum hydroxymethylsulfonate) 100 g ilave kloru giderilmiş. Bu son reajanı kültürü ekipman sterilize musluk suyu ya da ağartma kalıntılarından herhangi bir kalıntı klor nötrleştirme edilmesi ilave yararını sağlarlar. Bu bileşiklerin tamamen eriyene olduğundan emin olmak için önemlidir. Daha sonra yosun konsantresi (biyokütle kuru ağırlık ~% 15) 1 L ilave edin. 4 ° C 'de FR ve saklamak için besleme karışımı ekleyin.
    4. 10 milyon - 5 marş kültürü ekle
    5. PMT açın ve rotifer kültürü kabına yosun besleme pompalamaya başlar. PMT zamanlayıcı özelliğini kullanarak, o ~ yosun yem karışımı 1.6 ml günde, kültürde milyon rotifer başına teslim edilir, böylece yosun besleme karışımının doğum hızını ayarlamak. 24 saatlik bir süre boyunca düzenli aralıklarla küçük porsiyonlar halinde beslenmeye dağıtın; besleme daha sık, daha iyi.
    6. El belirli bir süre (örneğin, 1 dakika) için PMT açarak pompanın teslim oranını kalibre ve bir silindire veya behere bu aralık sırasında pompalar yosun toplamak. Örneğin, PMT dozlarının alg 5 ml 1 dakika içinde, o doz hızı olurdu5 ml yosun / dakika.
    7. 1.6 ml, milyonlarca, mevcut rotifer sayısı çarpılarak gerekli günlük beslenme oranını hesaplayın. Örneğin, 100,000,000 rotifer bir popülasyon ile Rotifer kültürü ~ gün (100 x 1.6 mi) başına besleme 160 ml gerektirecektir.
    8. 24 saatlik bir süre boyunca düzenli aralıklarla günlük toplam yem ihtiyacını doz PMT ayarlayın. Örneğin, 160 ml'lik bir toplam günlük besleme miktarı teslim kısımlar halinde teslim edilebilmektedir kez 8 kez günlük 4 dakika boyunca 5 ml / dk'lık bir dozlama pompası oranı ile bir PMT seti kullanılarak bir 24 saatlik bir süre boyunca her 3 st (5 ml / dakika x 4 dak = 20 ml x 8 besleme = 160 ml) eklenmiştir.
    9. Hasat öncesi, 72 saat - bu gerekli nüfus üretir kadar kültür 48, tipik, büyümeye izin verin. 24 saatte, yukarı post-başlatmak kültür kabına ipi parçacık filtreleri eklemek ve normal bakım başlar.
  4. Bakım
    NOT: Kültür sürekli olarak çalışır ve rutin gerektirirİdeal aşağıdaki sırayla, her gün aynı saatte yapılmalıdır e bakım.
    1. Temiz mevcut hacmin% 90 FCV'nin doldurun, 10 g / L akvaryum tuzları ile dozda tatlı su, kloru giderilmiş. Su kuyusu karışık olduğunu ve tuz hepsi tamamen çözülür emin olun. Bir "yuvarlanan kaynatın" korur, böylece damar içine hava akışını ayarlayın. Bir refraktometre ile tuzluluk ölçün ve tuzluluk 10 g / L olduğundan emin olun. Bunu aşmak için bu hedefe ulaşmak değil, kritik öneme sahiptir.
    2. Kültür farklı bölgelerinden gelen, 3 ml bir transfer pipet veya autopipettor kullanarak her - daha sonra 2 3 örnekleri toplamak, kültür, iyi karışmış olduğundan emin olun: CV rotifer tadına bakın. Bir tüp içinde, bu örnekleri birleştirin ve uygun boyutu (örneğin, 10 mi) şişesine yerleştirilir.
    3. Aktarım 1 - bir petri kabı üzerine birleştirilen numunenin 2 ml bir tahlil mikroskobu altında görüntülendi böylece. Kültür kalitesini kontrol edin (davranışını yüzmerotiferler, müstakil yumurta varlığı, kirletici protozoa).
    4. Örnek 50% Lugols iyot solüsyonu 100 ul ekleyerek kalan Birleştirilen numunede rotatorların hareketsiz. Saniyeler içinde Lugols eklenmesinden sonra, yüzme durdurmak için rotifer gözlemlemek. Şimdi, kolayca rotifer saymak.
      Not: Etanol, seyreltik ağartma ya da sirke Lugols yerine kullanılabilir. Sirke (2 damla / 10 ml) olmanın avantajları vardır tehlikesiz, ve rotifer sözleşme yapma olamaz ağartıcı ve iyot çözümleri gibi depolama gücünü kaybetme, böylece kirpikler corona ve "ayak" genişletilmiş kalır ve hayvanlar daha doğal görünüyor.
    5. Daha sonra hızlı bir plastik pipet bir ~ 2 ml'lik alt örnek almak, (hareketsiz rotiferler hızla yerleşmek) numune iyice karıştırılır olduğundan emin olun ve bir Sedgewick-Mertek sayma slayt içine 1 ml dağıtmak (20 x 50 1 mm kareler) (Şekil 2 ). Diseksiyon veya bileşik mikroskop kullanarak, bozulmamış rotifer ve t saymakBu rotifer bağlı yumurta otal numarası (Şekil 2). ~ 100 rotifer saymak için gerekli olarak slayt alanının kadar sayın. Ml başına rotifer sayısını hesaplayın ve bir elektronik tablo veya defterine bu kaydedin.
    6. Hasat ~ CV rotifer hacminin% 30: yavaşça CV altındaki vanayı açın, hava temini ve diş ipi filtresini çıkarın ve su 53 mikron elek ile birlikte bir plankton toplayıcıya akmasını sağlayın. Bir kova ya da drenaja filtreleme sonra kolektör altından dışarı akan suyu toplamak. Rotifer zarar görmesini önlemek için orta akışına nazik kullanın. Rotifer ekranda kurumasına izin vermeyin.
    7. Tutarlılık nedenlerden dolayı, rotiferler standart bir sayıda, her gün FCV oluşturulması tavsiye edilir. Bu nedenle, bilinen CV rotifer yoğunluğu ve hasat hacmine göre, tutarlı bir nihai yoğunluk elde etmek FCV toplam hacmini ayarlamak (örn., 1500 rotiferler / ml). Hasat roti ekleFCV için fers: (- 15 g / L 10) yavaşça temiz tuzlu su dolu bir yıkama şişesi kullanılarak tahsilat ekranından rotifer aktarın. FCV üzerinde ekranı ters çevirin ve tuzlu su hafif bir akım ile FCV'nin içine rotifer yıkayın. FCV için (~ günde milyon rotifer başına 1.57 ml) beslemeyi sağlamak için PMT başlatın.
    8. Temiz, yumuşak bir naylon fırça veya ovma pad ile CV tüm içini fırçalayın.
    9. Suyun hacmi, hasat kaybı karşılamak üzere, bir 5 galonluk bir kova temiz RO su ölçülü bir miktarda tuz, uygun miktarının ilave edilmesi ile 15 g / L su için yeni bir karışımını yapın. Kova su tuz ekleyin ve tamamen eriyene kadar kuvvetlice karıştırın ve sonra CV ekleyin.
    10. Bir lavaboda bir yüksek basınçlı püskürtme kullanarak, enkaz serbest kalıncaya kadar ipi filtreyi durulayın ve ardından CV iade.
    11. Rotifer / ml günlük sayımına göre, her dozlama olayın süresini değiştirerek CV teslim alglerin yem oranlarını ayarlayın.Teslim edilecek besleme uygun miktarını belirlemek için, yukarıdaki aşama 1.3.8 verilen hesaplamalar kullanın.
    12. Yaklaşık 24 saat sonra, işlemi tekrarlayın. Yukarıda tarif edilen (- 1.4.10 1.4.2 adımları) ile aynı şekilde (bir önceki gün için gerekli değil) FCV kalan rotatorların hasat başlayın. Taze ve temiz kloru giderilmiş su (5 g / L tuz) 2 L bunları konsantre edin. Bu yedek kaynağı olarak 4 ° C'de saklandı veya bu protokolde tarif edilenin ötesinde, balık sonraki aşamalarını beslemek için de kullanılabilir.
      NOT: Bu protokol 2 kadar izin - CV rotifer ciddi sonuçları olmadan hasat atlandığını tahammül çünkü, (normal otomatik besleme) ile azaltılmış kültür bakımı 3 gün.

2. Polikültür

  1. Kurmak
    1. Nazikçe steril fis ile durulama ardından çay-süzgecinden kökenli embriyolar dökülmesi ve bir yumurtlama olayı Zebra balığı embriyolar toplayınh su (veya uygun koşullu çözümün herhangi diğer non-kontamine kaynak; örneğin, embriyo orta, E3, vb) petri kutularının içine bir yıkama şişesinden.
    2. 5 gün süre ile çanak başına 50 embriyo - 40 arasında bir yoğunlukta petri kaplarına 28 ° C - 25 ° embriyolar inkübe edin.
    3. 5 gün sonrası fertilizasyon veya yumurtadan larva% 90 daha aktif su kolonunda kadar yüzme üzerindeki polikültür fazı başlayın.
  2. Aşılama
    1. Doğrudan 3.5 L kreş tankına FCV'nin gelen rotifer kültürü 500 ml ekleyin; Rotifer kültür suyun dahil polyculture sırasında rotifer besin içeriği tutar alg besleme sağlar.
    2. Yavaşça kreş tankına tek petri larvaları dökün. Hiçbir larvalar çanak kalmadığından emin olun.
    3. 1 L'lik bir son hacim ve son bir s ulaşmak için tanka bir sirkülasyon sisteminde veya özel su kaynağından, temiz durumunu balık suyu 500 ml ilave edilir5 g / L alinity.
      NOT: Bu tuzluluk Zebra balığı larvaları hayatta olumsuz tuzluluk olumsuz etkiledi olacak> 7 g / L ve rotifer hayatta ise etkilenecek çünkü kritik tuzluluk <2 g / L ise.
  3. Polikültür aşaması
    NOT: polikültür fazı (gün 5-9 sonrası fertilizasyon karşılık, 5 gün toplam) en fazla 4 gün sonrası aşılama için sürmelidir.
    1. Rotifer ve balık mevcut ve büyüyen olduğundan emin olmak için, bu dönemde en az bir kez günde polikültür tankı gözlemleyin. Rotifer su kolonu boyunca görünür olduğundan emin olun. Fishs rotifer arasında yüzme, su sütunu içinde de görünür olduğundan emin olun.
    2. Tanktan normal su akışını başlatın. Bir ekran yerleştirin veya tankın dışarı atılır olmadığını larvaların sağlamak için drenaj portu üzerinden bölme.
      NOT: Bu fazın sonunda, balık, Artemia gibi daha büyük avlarını tüketmek için yeterince büyük olacak125 mikron - 75 boyut aralığında nauplii veya işlenmiş yem öğeler.
      Not: Örnek polyculture tankı içindeki rotiferin popülasyon dinamikleri adımları 1.4.2 tarif edildiği gibi aynı şekilde tanktan rotatorların / sayma örnekleme ile ölçüldü - 1.4.5. Tamamlanana kadar bu polyculture aşamasının başından itibaren günde bir kez yapılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada açıklanan sürekli rotifer kültürü sistemi dinamik ve günlük beslenme ve hasat oranlarında farklılıklar varsa rotifer numaraları zamanla küçük bir ölçüde dalgalanması için normaldir. Boston Çocuk Hastanesi su tesislerinde aktif kültürlerin bir rotiferler nüfusu, yukarıda tarif edilen şekilde hazırlanmış, 30 gün (Şekil 3) izlendi. Bu süre içinde ortalama kültür yoğunluğu 1.330 rotiferler / ml'lik bir maksimum ve 510 rotiferler / ml'lik bir minimum, 932 rotiferler / ml olmuştur. Bu, bu protokole uygun olarak tutulan bir rotifer kültürü tipik bir performans gösterir.

Zebrabalıkları bir polyculture tankında rotiferin nüfusun dinamikleri, Şekil 4 'de gösterilmiştir. Bir 3.5 L akvaryum FCV gelen rotiferin kültürü 500 ml steril f 500 ml aşılandıish su ve 40 5 gün eski vahşi tip (Tübingen suşu) larvaları, rotiferler ve zebra balığı tipik polikültür tankında nasıl performans göstermek için. Polikültür tankında rotiferin popülasyon 747 rotiferler / ml (Şekil 4) bir yoğunluğa sahip ikinci günde zirve yapmıştır. Polikültür tankında rotiferler yoğunluğu Ancak 5. günde 481 rotiferler / ml'lik bir minimum 5 günlük bir süre boyunca azaldığı polyculture, tüm süre boyunca ortalama rotiferi yoğunluğu 589,4 rotiferler / ml ve 481 en az bir değer rotiferler / ml ~ önce yayınlanmış çalışmadan 12 polyculture döneminin sonunda rotiferin yoğunluğunun 10 kat daha fazladır.

Beş günlük bir süre boyunca bir büyüme balığı, Şekil 5 'de gösterilmiştir. Balık 0,063 ± SEM 3,904 mm ortalama toplam uzunluğu, her bir günlük sürekli büyüme gösterdi da 5,423 ± 0,063 SEM ortalama toplam uzunluğuna polyculture tankına ilave edilmiştir; üzerindepolikültür aşamasının son günü. Hayatta kalma% 95 (38/40) olmuştur.

Su kalite parametreleri için temsili polyculture tankında günlük olarak ölçülmüştür ve Tablo 1 'de gösterilmiştir. Bu parametreler değerleri, daha önce yayımlanmış çalışma 12 benzer, ve rotiferlere ve balık hem büyüme ve hayatta kalma için elverişli koşulları temsil polyculture 5 gün süresince.

Gün Gün Tuzluluk TAN NO 2 NO 3 pH Alkalinite Sertlik Isı
(Gerçek) (post-fertilizasyon) g / L mg / L mg / L mg / L mg / L (CaCO 3) mg / L (CaCO 3) ° Celsius </ td>
Pazartesi 5 5 2 0 0 8.4 120 425 23.2
Salı 6 5 3 0 0 8.4 180 425 23.3
Çarşamba 7 5 3 0 0 8.3 240 425 22.3
Perşembe 8 6 3 0 0 8.4 240 425 22.8
Cuma 9 7 3 0 0 7.9 240 425 22.2

Tablo 1. Su Kalitesi Parametreleri ina Temsilcisi Zebra balığı Polikültür Tank.

figür 1
Şekil 1. Rotifer Kültürü Kur Yetkiler:. Kültür Gemi (CV), çıktıya da Kültür Gemi (FCV), Hava İkmal (AS), ipi Partikül Filtresi (FPF), Yosun Yem karışımı (AFM), Rezervuar (FR), Programlanabilir Ölçme Yem Timer (PMT). Düz çizgiler yosun yem teslim etmektedir. Kesik çizgiler, hava teslim etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil bir Sedgewick-Mertek Sayma Slide 2. Dolum. Bir görüntülemek için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonu.

Şekil 3,
. Şekil 30 günlük Dönemi boyunca Kültür 3. Rotifer Nüfus Dinamiği Efsane: ml başına sayılan rotifer (kadın + yumurta) sayısı x ekseni üzerindedir. Kültürde gün sayısı y ekseni üzerindedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
. 5 gün polyculture Legend sırasında Şekil 4. Rotifer Nüfus Dinamikleri: ml başına sayılan rotifer (kadın + yumurta) sayısı x-ekseni üzerindedir. Polyculture gün sayısı y ekseni üzerindedir. Vi için tıklayınızBu rakamın büyük bir sürümünü Ew.

Şekil 5,
. 5 gün polyculture sırasında Şekil 5. Zebra balığı Büyüme Yetkiler: Değerler mm ortalama toplam uzunluğu vardır; Hata çubukları ortalama (SEM) standart hata temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aynı tankta rotifer birlikte Zebra balığı larvaları ilk besleme balık beslemek için sürekli rotifer kültürü sisteminin kurulması ve bakımı ve kültüre: erken larva zebrafish beslenmesi için rotifer polikültür yönteminin başarılı bir şekilde uygulanması etkili iki görevler için protokoller gerektirir.

İlk Lawrence ve yazarları 14 tarafından açıklanan Zebra balığı laboratuvarlar için sürekli bir tuzlu su rotifer üretim sistemi kurulum değiştirilmiş ve uygulamada hem daha sağlam ve evrensel hale getirmenin yollarını bir dizi geliştirilmiştir. Yeni protokol ekipman ve metodoloji hem de iyileştirmeler içeriyor.

Yosun yem karışımı için depolama sistemi artık yayın balığı üretim sistemlerinde 15 kullanılan kavanoz kuluçka kullanır. O tabakalandırmak veya kümelenir ve yapışmasına yol açmaz, böylece bu yuvarlak dipli kavanozlarda yem depolama yosun yem iyice karışmasını kolaylaştırırTeslimat hatlarının ging, sıklıkla orijinal protokol boğulmuş bir sorun. Benzer şekilde, bir all-in-one programlanabilir zamanlayıcı / ölçme pompasının kullanımı bileşenlerinin toplam sayısını azaltır ve rotiferlere yem ölçülü teslim kolaylaştırır. Ayrıca yem daha verimli asimile çünkü daha az, daha büyük beslenme tercih edilmektedir 24 saatlik bir süre üzerinde bir saatlik bazda rotiferlere yem doz izin verir.

Rotifer kültürü besleme teslim ince ayar izin rotifer sayma için bir yöntem, bu protokolde dahil edilmiştir. Nüfus büyüklüklerine doğru, gerçek zamanlı değerlendirmesine dayalı rotifer Besleme istikrarlı, yüksek düzeyde üretimini sağlamaktadır. İkincil bir çıktıya da Kültür Gemi ayrıca protokol eklenmiştir. Sürekli kültür sistemi nedeniyle kreş etkinliği farklılıklar nedeniyle, hatta büyük bir kreş çalışması için gerekli ötesinde onlarca rotifer milyonlarca günlük fazlalığı üretebilir. Bu çıktıya da Culture Gemi polycultures günlük aşılama için rotatorların tutmak için kullanılır ve geri kalan rotiferler balık sonra larva ve erken yavru aşamalarına yüksek kaliteli bir besin takviyesi olarak beslenebilir. Transfer zaman güçlü bir yüzme etkinliği muhafaza eden ve böylece FCV azaltılmış tuzluluk (10 g / L), aynı zamanda, polyculture tanklarında koşulları rotatorların önceden alıştığı.

Önemlisi, rotifer kültür protokolü kurşun bu değişiklikler, özellikle emek girişine ilişkin, polikültür yaklaşımı gelişmeleri yönlendirmek. Bu dönemde 333 rotifer zirve yaptı sırasında En iyi ve ilgili yazarları sadece bir günde 5 de rotifer ilk aşılama, ama aynı zamanda statik polikültür faz günde 9 12 tarihinde sona kadar rotifer günlük eklemeler tarafından yayınlanan bir önceki yöntem. Rotifer yoğunlukları ortalama / inokülasyon gün ml 9. günde 12 polyculture aşamasında sona aşağıda 50 rotiferler / ml sona erdi. aksineMevcut protokol genellikle ~ 665 rotifer / ml başlayan ve gün 9 481 ~ ile rotifer / ml biten boyunca çok daha yüksek yoğunluklar tutar.

Bu çok daha yüksek rotifer yoğunlukları sağlayan iki etken vardır. 1) aşılama için kullanılan rotifer kültürü genel sağlamlığı çok daha büyüktür. Bundan başka, eşit 10 g / L tuzlulukta yosun / rotiferlere hacim ve • 0 g / L tuzluluk balık suyu, 5 g / polyculture boyunca korunur L nin bir ara tuzluluğunun sonuçlarla Polikültür inoküle gözden geçirilmiş bir adım. Daha büyük bir su toplam hacmi ile başlayarak (1 L), aynı zamanda polyculture tanklarında rotifer büyüme ve hayatta kalma için daha elverişli. Daha önce yayınlanmış yöntemde, küçük bir hacimde düşük başlangıç ​​rotifer yoğunlukları balık larvalarını geliştirerek ve tüketim (muhtemelen zayıf su kalitesi) yıpratma yoluyla kayıpları doldurmak için rotifer günlük eklemeler gerektirmiştir. Protokol dramat bu ayarlamalar sonuçlarıically (önceki yöntemle 4 gün içinde 4 beslenme kıyasla 4 gün boyunca tek beslenmesini) işgücü girdilerini azaltmak. İlk 5 günlük bir süre boyunca polyculture Larvaların büyüme ve sağ kalma performansı, daha önce, 12 geçme ile karşılaştırılabilir.

Rotifer kültürleri verimlilik mutlaka besleme girişi ile sınırlıdır. 2,000 Rotifer yoğunlukları - 3000 / ml, sadece besleme arttırarak, bu yöntemler ile elde edilebilir. Besleme birimi başına rotiferin verimi bilindiğinde, besleme hızı tahmin ihtiyaçlarına Rotiferle eşleşmesi için ayarlanabilir. Hafta sonları ve tatillerde, beslenme azaltılabilir ve olabilir üretken potansiyeli normal günlük beslenme kadar optimal olması ve rutin özgeçmiş hasat rağmen, rotifer zarar vermeden bir veya iki gün için atlanmış hasadın.

Normalden daha fazla rotifer için beklenmeyen bir ihtiyaç olduğunda, nüfusun büyük bir kısmı cul zarar vermeden hasat edilebilirTure ama hasat boyutuna bağlı olarak, kültür, her zamanki yoğunluğu kurtarmak için bir gün ya da daha fazla gerektirebilir. Rotifer talebi bir veya iki gün fazla azalacaktır ise üretim iyi yem teslim azaltarak, yerine hasat azaltarak azalır. En az% 25 / gün bir hasat oranı polikültür tanklarında onların performansını artırmak, rotiferler daha dinç ve bereketli böylece daha genç bir rotifer yaş profili korur.

Bu protokol kolayca küçük Zebra balığı tesisleri için küçük ölçeklerde uyarlanmıştır. Örneğin, uygun bir günde iki defa elle besleme ile standart bir 5 US galon (20 L) kova ayarlanabilir bir 15 L'lik kültür, hali hazırda 1000 rotiferler / ml'lik bir yoğunluğa elde edilebilir. Bir besleme pompasının kullanımı 2.000-3.000 / ml yoğunluğu sağlar. 30 polycultures - Tek kova nedenle 10 başlatmak için yeterli 5-15.000.000 rotifer / gün, sağlayabilir / gün% 30 hasat. Tarif edildiği gibi iki Kepçe aynı CV + FCV protokolünde kullanılan birBove. Bir yosun + amonyak kontrolörü + pH tampon ön karışımı besleme (Belirli Reaktifler / Ekipman Tablo) küçük ölçekli uygulamalar için uygun olduğunu mevcuttur. Yosun hücreleri hızlı bir şekilde yerleşmek yoktur ve bu nedenle besleme deposundan sürekli karıştırma gerektirmeyen yeterli viskoziteye sahiptir.

Rotifer kültür verimlilik düşer, ya da ölü rotifer alışılmadık bir birikim kültüründe bulunursa, tüm su kalite parametreleri (sıcaklık, tuzluluk, pH, NH 3 konsantrasyon) onlar yumurtadan kadar Brachionus plicatilis normalde yumurtalarını taşır. Kontrol edilmeli ve kültürde (genellikle yumurtadan değil) birçok bekâr yumurta varlığı birikmiş amonyak nedeniyle en sık stres belirtisi vardır.

Rotifer kültür suyu normalden daha yoğun yeşil ise, her iki besleme oranı çok yüksek veya rotifer olağan hızında gıda tüketen değil. Genellikle bu cabir stres faktörü, ya da kültür ya tarafından kullanılan indirgenmiş nüfusuna göre besleme hızını ayarlama yapmadan overharvested edilmiştir. Yoğun kültürlerde bu alg pigmentler rotifer tarafından metabolize olarak kahverengi renklenme, su birikmesine normaldir.

İlk besleme aşamasında tuzlu su rotifer kullanımı yaygın yöntemi ilk 2010 12 yılında yayımlandı beri Zebra balığı araştırma topluluğu karşısında kabul edilmiştir. Bu protokol özetlenmiştir polikültür yetiştirme yöntemine yapılan değişiklikler daha da fazla sayıda izin verecek laboratuarlar Ölçeği ne olursa olsun, bu yaklaşım benimsemek. Bu gelişmeler zamanında olduğu; Gen nakavt teknolojisindeki gelişmeler (örneğin., CRISPR, Talens, vb) bilim çeşitli alanlarında kullanım için genetiği değiştirilmiş balık yeni suşları binlerce büyümeye akıcı ve verimli yetiştirme protokollerini gerektirir zebrabalıkları için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

AK Henry Reed kültür balıkçılığı, Inc., su ürünleri yetiştiriciliği ve balık hobisi pazarlara rotifer, alg konsantreleri ve diğer malzemeleri sağlayan bir şirket tarafından istihdam edilmektedir.

Acknowledgments

Bakım ve bu protokolü açıklanan temsilcisi sonuçları için oluşturulan balık kullanım Boston Çocuk Hastanesi'nde, protokol # 14-05-2673R Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara tam uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rotifer Culture Infrastructure
100 L Culture Vessel Aquaneering Custom Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve
5 Gallon Culture Bucket Kit Reed Mariculture CCS Starter Kit Small volume culture vessel for small facilities
Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” Pentair Aquatic Ecosystems 16025 Rigid clear tubing for air delivery
Mesh tube Pentair Aquatic Ecosystems RT444X Mesh tube support for floss filter
Rotifer Floss Reed Mariculture Rotifer floss 12” x 42” Particulate waste trap
Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD Grainger 38M003  Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) Coral Vue SKU: IC-LQD-DSR Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Silicone Tubing  Cole Parmer Tubing for algae delivery to rotifer vessel
Rigid Clear Tubing " O.D.,36” Pentair Aquatic Ecosystems 16025 Rigid clear tubing for air delivery to algae paste
Rigid Clear Tubing O.D., 36” Pentair Aquatic Ecosystems 16025 Rigid clear tubing for algae delivery
Rotifers
Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L Reed Mariculture Type L 5 million Rotifer stock culture for system startup
Rotifer Feed
Sodium hydroxymethylsulfonate Reed Mariculture ClorAm-X® 1lb tub Ammonia reducer for algae feed mix
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S25533B pH buffer for algae feed mix
Microalgae concentrate Reed Mariculture Rotigrow Plus® 1 liter bag Nutritionally optimized rotifer feed
RG Complete Reed Mariculture RG Complete 6 oz bottle All in one microalgae based feed for small scale cultures
Water Preparation
 Reef Crystals Reef Salt That Fish Place 198210 Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). 
Refractometer Pentair Aquatic Ecosystems SR6 measuring salinity
Rotifer Culture Equipment
Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns Pentair Aquatic Ecosystems BBPC20 Mesh screen for collecting rotifers
Scrub Pads Pentair Aquatic Ecosystems SCR-58 Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels
Scrub Brush
Bucket Grainger Supply  43Y530 Graduated bucket for mixing culture water
Hatching Jar Pentair Aquatic Ecosystems J30 Storage of algae feed mix
Lugol’s Solution, Dilute Fisher Scientific S99481 Agent used to immobilize live rotifers for counting
Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid  Pentair Aquatic Eco-Systems M415 Counting rotifers
Miscelleneous
Tea Strainer Kitchenworks 971972 Used for collecting zebrafish embryos after spawning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ribas, L., Piferrer, F. The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research. Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).
  2. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).
  3. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).
  4. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
  5. Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
  6. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
  7. Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). , CRC Press. (2010).
  8. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish, A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  9. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. (2007).
  10. Carvalho, P., Arau, L. Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance. Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).
  11. Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).
  12. Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis). Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).
  13. Lawrence, C. Advances in zebrafish husbandry and management. Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).
  14. Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-146 (2012).
  15. Biology and Culture of Channel Catfish. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. 34, 634-657 (2004).

Tags

Gelişimsel Biyoloji ilk Sayı 107 Zebra balığı rotifer polikültür beslenme larva
Yetiştirme İlk Besleme Zebra balığı için komple ve Güncelleme &quot;Rotifer Polikültür Metodu&quot;
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lawrence, C., Best, J., Cockington,More

Lawrence, C., Best, J., Cockington, J., Henry, E. C., Hurley, S., James, A., Lapointe, C., Maloney, K., Sanders, E. The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish. J. Vis. Exp. (107), e53629, doi:10.3791/53629 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter