Introduction
斑马鱼（ 斑马鱼 ）是一个卓越的实验动物在越来越多的科学学科的利用，包括但不限于发育遗传学，毒理学，行为，水产养殖，再生生物学，以及许多人类疾病1的造型- 5。虽然品种相对容易在实验室中保持，有许多与它们培养6相关联的管理的挑战。最突出的是苗种培育，特别是当鱼第一次开始喂气膀胱充气7其后。在正常，控制的条件下，此发育事件发生在〜5天后受精（DPF），但有以下3 -生长5天是特别关键的7。在这一阶段的中心技术难度是充分满足第一馈送幼虫的营养需求 - 饲料项目必须适当尺寸，diges1149，有吸引力，并在几乎连续的基础上提供，而不在培养罐产生过多的浪费。历史上，这已经达到一般通过提供大量的少量饲料鱼的坦克，以及常规的水交换8,9。虽然这些方法有一定程度的成功，它们是效率低下的，要求高劳动投入，并返回唯一的变量和生长和存活10的速率限制。
在自然界中，斑马鱼幼体想必饲料丰富的小礼物在水体中浮游动物11。出于这个原因，结合了活饲料如草履虫 ，轮虫和卤虫 larviculture协议通常是最有效的7。 2010年，百思及其合作者表明，它是可能的静态，苦咸水以及海水轮虫的第5天的外源性饲养12幼虫生长的斑马鱼。这种方法，它利用ES轮虫培养的天然高生产率，以提供充足的，高营养的猎物，不污染水，幼虫生长和存活的低劳动力投入12,13的收益率非常高的速度。近年来，越来越多的世界各地的实验室都采用这个协议的变化，现在很多都培养轮虫以连续的方式来支持育苗系统14。
在过去的几年中，为轮虫/斑马鱼混养和轮虫的生产方式进行了细化和改进，变得更加标准化和轻松扩展。本文提供了一步一步的说明1）连续和强大的轮虫生产及2）建立用于支持鱼类生长健壮的第5天的外源性摄食轮虫/斑马鱼混养系统。
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Protocol
1.轮虫文化
- 文化系统使用的是100升培养容器基本组件
- 收集所有组件的轮虫培养设置。轮虫培养装置由一个培养容器（CV）发展壮大的轮虫;类似的船只，以保持喂料轮虫（喂料培养容器，FCV）;圆底孵化缸（订阅水库，FR），用于存储所述藻类饲料混合物（AFM）的;气源（AS），以充气的简历，燃料电池汽车和FR;蠕动泵计量定时器（PMT）来控制藻类交付饲料进入CV和燃料电池汽车;和牙线微粒过滤器（FPF），坐落在简历里面。
注 ：耗材和组件的完整列表中的材料清单提供。
- 收集所有组件的轮虫培养设置。轮虫培养装置由一个培养容器（CV）发展壮大的轮虫;类似的船只，以保持喂料轮虫（喂料培养容器，FCV）;圆底孵化缸（订阅水库，FR），用于存储所述藻类饲料混合物（AFM）的;气源（AS），以充气的简历，燃料电池汽车和FR;蠕动泵计量定时器（PMT）来控制藻类交付饲料进入CV和燃料电池汽车;和牙线微粒过滤器（FPF），坐落在简历里面。
- 组态
- 提升支架上或桌子上的简历和燃料电池汽车，这样的文化可以通过排水管装修成一个集合续轻松收获ainer（ 图1）。使用灵活的送风管到AS连接到每个培养容器的长度刚性管。确保管足够长以将空气输送到CV或燃料电池汽车的底部。
- 使用小容量的空气线到AS连接到一个长度刚性管的延伸到包含AFM对FR的底部。安装一个阀门到每个空气管路调节风量。帧中继连接到与饲料输送管的PMT和运行从PMT的管导入钻入CV / FCV的一侧，在顶部附近的孔。 图1。
- 启动
- 培养容器填充到90％的可用容量与反渗透水（RO）的。如果RO不可用，使用清洁，脱氯市政供水;然而，应该执行一个生物安全风险评估，以确保没有潜在的致病微生物存在于水源。注：这种分析，可以执行任何资质的水质检测实验室。
- 剂量的培养容器水与水族箱盐达到15克/升的盐度。置的空气流进入容器，使得它保持一个“滚动沸腾”，然后慢慢盐的测定量添加到培养容器，直到它完全被曝气溶解。继续曝气水为> 1小时，以确保其完全氧化。
- 使藻类进料混合物。向3升的干净，脱氯鲜（0ppm的）水加入100克碳酸氢钠和100克的氨中和剂（钠hydroxymethylsulfonate）。这最后的试剂提供中和从自来水或漂白残基的任何残余的氯从消毒的培养设备的额外的好处。以确保这些化合物完全溶解，这一点至关重要。然后加入1升藻浓缩液（生物干重〜15％）。添加进料混合物，以FR和储存在4℃。
- 加5的首发文化年 - 1000万元
- 打开PMT，并开始抽藻送入轮虫培养容器。使用PMT的定时器功能，设置藻类饲料混合物的排出流量，使得〜1.6 ml的藻类饲料混合物的每百万轮虫在培养递送，每天。分布在一小部分的喂食定期超过24小时的周期过程;越频繁喂食，效果更佳。
- 通过手动开启PMT为在设定时间内（例如，1分钟）校 准泵的输出率，并收集它此间隔成量筒或烧杯中泵藻类。例如，如果该PMT剂量5 ml的藻类中1分钟，然后将剂量率将是5 ml的藻类/分钟。
- 乘以本轮虫的数以百万，1.6 ml的计算所需的日常饲养率。例如，对于在100万轮虫人口尺寸的轮虫培养需要〜160 ml的饲料，每天（100×1.6毫升）的。
- 设置的PMT，在整个24小时内的剂量以规则间隔的总日饲料需求。例如，递送的160毫升的总日饲料量可以以能够部分被递送一次，每3小时，在24小时内使用的PMT组为5毫升/分钟4分钟，每日8次的计量泵速率（5毫升/分钟×4分钟= 20毫升×8喂食= 160毫升）。
- 让文化成长，直到它生成所需的人口，一般为48 - 72小时，收获前。在24小时后启动，添加牙线粒子滤波器到培养容器中，并开始正常的维护。
- 保养
注：培养运行在一个连续的基础上，并要求routin而理想地应在同一时间的每一天进行，按照以下顺序ë维修。- 燃料电池汽车填充到90％的有效量的清洁，脱氯淡水，给药10克/升的水族馆的盐。确保水充分混合，并且所有的盐的完全溶解。置的空气流进入容器，使得它保持一个“滚动沸腾”。测量盐度用折射并确保盐度为10克/升。要达到这个目标，不要超过它，这一点至关重要。
- 样品中的CV轮虫：确保培养充分混合，然后收集3个样本的2 - 3各自使用一个移液管或autopipettor毫升，从培养的不同部分。结合这些样品中的管或小瓶方便的大小（例如，10ml）中的。
- 转移1 - 2毫升组合样本的上一个培养皿，以便它可以在解剖显微镜下观察。检查文化素质（游泳的行为轮虫，存在脱落的鸡蛋，污染原生动物）。
- 通过加入100微升50％Lugols碘溶液到样品固定剩余组合的样品中的轮虫。在几秒钟内加入Lugols后，观察轮虫停止游泳。现在，很容易算轮虫。
注：乙醇，稀漂白剂，或醋可以代替Lugols的使用。醋（2滴/ 10毫升）中有被优点无危险，没有失去强度中存储作为漂白和碘溶液可以，并没有使轮虫合同，所以纤毛的电晕和“脚”保持伸出并且动物看起来更自然。 - 确保样品充分混合（固定轮虫会沉淀迅速），然后迅速采取约2ml的子样本在一个塑料吸管和分配1 ml的成塞奇威克-拉夫特计数滑动件（20×50 1毫米正方形）（图2 ）。使用解剖或复合式显微镜，算上完整轮虫和Total号码附着到这些轮虫蛋（图2）。计数一样多的滑动面积的必要来算〜100轮虫。计算每毫升轮虫的数量，并在电子表格或日志记录此。
- 收获〜于CV轮虫的体积的30％：除去空气供应和牙线过滤，慢慢在CV的底部打开阀并允许水流入一个浮游生物集电极与一个53微米网状筛。收集过滤成桶或漏极后流出收集器的底部的水。使用温和到中等流量，以免损坏轮虫。不要让轮虫干在屏幕上。
- 出于一致性的原因，建议建立与燃料电池汽车的每一天，标准号轮虫。因此，基于已知的CV轮虫密度和收获量，调整燃料电池汽车总体积达到一致的最终密度（例如，1500轮虫/毫升）。添加收获烤肉FERS到FCV：（ - 24 g / L的10），轻轻地从采集窗口使用的是洗瓶子装满干净的盐水转移轮虫。反转屏幕在燃料电池汽车，并用食盐水的温柔流洗轮虫到燃料电池汽车。启动PMT提供饲料（〜每天每百万轮虫1.57毫升）的燃料电池汽车。
- 磨砂CV的整个内部用干净，柔软的尼龙刷或擦洗垫。
- 使加入盐的适量的清洁RO水测定量在5加仑桶取代的水的体积丢失收获15克/升的水一新的组合。的盐添加到水在水桶和剧烈搅拌，直至其完全溶解，然后添加到CV。
- 在水槽采用高压喷淋，冲洗绒毛过滤器，直到它是免费的碎片，然后将其返回到CV。
- 调整藻类通过改变每个给药事件的持续时间递送到CV的进料速率，根据轮虫/毫升每日计数。使用在步骤1.3.8提供的计算，上述确定进料待递送的适当的量。
- 约24小时后，重复上述过程。开始通过收获残留在燃料电池汽车（即没有所需的前一天）的轮虫中相同的方式，如上所述（步骤1.4.2 - 10年1月4日）。集中起来在2升的新鲜，洁净的脱氯水（5克/升的盐）。这些可以存储在4℃下作为备用电源，或用于饲料的鱼后期阶段，超出了在该协议描述。
注意：此协议允许高达2 - 3天减压培养维护（与正常的自动喂养），因为在CV轮虫可以容忍收成遗漏无严重的后果。
2.混养
- 建立
- 通过茶型过滤器浇催生的胚胎，然后用无菌FIS轻轻漂洗收集从产卵事件斑马鱼胚胎h进水（或适当地调节溶液的其它任何未污染源;例如，胚胎培养基，E3等）从一个洗涤瓶入培养皿中。
- 孵育胚胎在25 - 28℃下在培养皿中在40密度 - 每皿50胚胎5天。
- 开始第5天受精后，或当大于90％的孵幼虫的正在积极游动在水柱混养相。
- 接种
- 添加500毫升轮虫培养直接从FCV到3.5升育苗池;列入轮虫养殖水体藻类提供饲料用于维护轮虫混养过程中的营养成分。
- 从一个培养皿中的幼虫轻轻倒入幼儿园坦克。确保没有幼虫留在菜。
- 从再循环系统或专用水源加入500毫升干净，空调鱼水到容器达到1升的终体积和最终的小号alinity 5克/升。
注意：因为如果盐度是> 7克/升和轮虫生存将受到负面影响，斑马鱼幼体生存将受到负面影响这盐度是至关重要的，如果盐度<2克/升。
- 混养阶段
注：混养相应持续长达4天接种后（共5天，对应于天5-9受精后）。- 在此期间观察混养罐至少每天一次，以确保轮虫和鱼存在和生长。确保轮虫在整个水柱可见。确保了fishs也是可见的水柱内，轮虫中游泳。
- 开始正常的水流量通过罐。放置一个屏幕或挡板在泄油口，以确保幼虫不会被清理出的坦克。
注：在此阶段结束时，鱼会大到足以消耗较大的猎物如卤虫125微米 - 在75的尺寸范围内的无节幼体或饲料加工物品。
注意：一代表混养罐内的轮虫种群动态通过取样测定/如步骤1.4.2描述计数从以相同的方式将罐轮虫 - 1.4.5。这是从混养阶段开始，直到完成完成每天一次。
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Representative Results
这里所描述的连续轮虫培养系统是动态的，这是正常的轮虫数量的波动在小范围内随着时间的推移，如果有变化，日常饲养和收获率。在水产养殖设施在波士顿儿童医院的活性培养物中的一个的轮虫的人口，保持在上述的方式，进行30 天 （图3）监控。在此期间，平均培养密度为932轮虫/毫升，最大为1330轮虫/ ml和至少510轮虫/毫升。这代表保持按照本协议的轮虫文化的典型表现。
轮虫人口混养罐斑马鱼的动力学显示在图4。阿3.5升鱼缸接种用500ml轮虫培养从燃料电池汽车500毫升灭菌的F肥胖型水，和40 5天龄的野生型（宾株）幼虫，以说明如何轮虫和斑马鱼在典型混养罐进行。轮虫种群在混养罐见顶第二天以747轮虫/毫升（ 图4）的密度。轮虫在混养罐中的密度降低在5天期间混养到最小的。然而5.天481轮虫/毫升，在整个期间，平均轮虫密度为589.4轮虫/毫升，和481中的最小值轮虫/毫升为〜10倍，轮虫密度在以前发表的著作12混养期间结束。
在5天期间的斑马鱼生长示于图5的鱼显示出稳定增长 的每一天，从3.904毫米的平均总长度±0.063 SEM的时候被加入到混养罐的5.423±0.063的SEM的平均总长度上混养阶段的最后一天。生存率为95％（38/40）。
水质量参数是在代表混养罐每天测量，并示于表1中。这些参数的值类似于先前发表的作品12，和代表有利于两个轮虫和鱼的生长和存活的条件在混养的5天时间。
| 日 | 日 | 盐度 | 谭 | NO 2 | NO 3 | pH值 | 碱度 | 硬度 | 温度 |
| （实际） | （受精后） | 克/升 | 毫克/升 | 毫克/升 | 毫克/升 | 毫克/升（ 碳酸钙 ） | 毫克/升（ 碳酸钙 ） | 摄氏度</ TD> | |
| 星期一 | 五 | 五 | 2 | 0 | 0 | 8.4 | 120 | 425 | 23.2 |
| 星期二 | 6 | 五 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 180 | 425 | 23.3 |
| 星期三 | 7 | 五 | 3 | 0 | 0 | 8.3 | 240 | 425 | 22.3 |
| 星期四 | 8 | 6 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 240 | 425 | 22.8 |
| 星期五 | 9 | 7 | 3 | 0 | 0 | 7.9 | 240 | 425 | 22.2 |
表1. 水质参数我NA代表斑马鱼混养坦克。
图1.轮虫文化设置图注：培养容器（CV），喂料培养容器（FCV），供气（AS），肉松粒子滤波（FPF），藻类原料混合物（AFM），供料罐（FR），可编程测量计时器（PMT）。实线表示藻类饲料交货。虚线代表空气输送。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 填充塞奇威克椽计数滑坡。 请点击此处查看更大的版本这个数字。
图中的文化3.轮虫种群动态在30天的期限传说：每毫升计数轮虫（女性+鸡蛋）的数量在x轴上。在文化的天数是关于y轴。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.轮虫种群动态在5天混养图注：每毫升计数轮虫（女性+鸡蛋）的数量是x轴。在混养的天数是关于y轴。 请点击此处为viEW这个图的放大版本。
图5.斑马鱼生长在5天混养图注：值是平均值的总长度毫米;误差线代表平均值（SEM）的标准误差。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
成功实施轮虫混养方法喂养早期幼虫的斑马鱼，需要有效的协议两个任务：第一喂养以及在同一水箱轮虫斑马鱼幼体连续轮虫培养体系的建立和维护喂鱼，和培养。
设置用于连续盐水轮虫生产系统首先由劳伦斯和共同作者14所述斑马鱼的实验室已被修改和增强的多种方法，使得它更加在应用健壮和普遍。新的协议包含改进都在设备和方法。
存储系统的藻类饲料混合现拥有员工孵化鲶鱼生产系统15使用的罐子。在原料中这些圆底罐的存储利于藻类饲料的充分混合，使得它不分层或聚集，导致堵塞更改送线，一个问题，经常困扰着原始协议。同样，使用的所有功能于一身的可编程定时器/计量泵的减少了部件的总数量，并简化了计量输送饲料的轮虫。它也允许进料轮虫的剂量超过24小时的时间内，这是优选的更少，更大的喂食因为进料同化更有效地以小时为单位。
一种计数轮虫的方法，允许微调进料输送到轮虫文化已被列入该协议。饲喂根据其人口规模的准确，实时评估的轮虫可确保稳定的，高层次的生产。二次喂料培养容器也被添加到协议。连续培养系统可以产生每天超过数千万轮虫超出需要的是什么，即使一个大型苗圃运行中，由于变化的幼儿园活动。这喂料铜lture船只用于保存轮虫日常接种混养的，剩下的轮虫可以供给作为高品质的营养补充到鱼存货幼虫和早幼阶段。在燃料电池汽车的降低盐度（10克/升）也预acclimates轮虫在混养坦克的条件，让他们保持旺盛的游泳活动转移时。
重要的是，这些变化对轮虫培养协议引线直接改善混养方法，特别是有关劳动力投入。以前的方法，百思及其合作者参与轮虫在第5天，不仅最初的接种，而且每天还补充轮虫，直到9月12日的静态混养阶段结束的公布，平均轮虫密度在此期间最高达到333轮虫/毫升对接种的当天和低于50轮虫/毫升结束在第9天12混养相位的终止。相反，当前协议保持高得多的密度在整个，典型地开始于〜665轮虫/毫升，并在第9天结束与〜481轮虫/毫升。
有两个因素使得这些高得多轮虫密度。 1）用于接种轮虫培养的整体鲁棒性大得多。此外，接种混养与藻类/轮虫在10g / L的盐度等体积和〜0克/升盐度鱼水，结果在5克/是保持整个混养升的中间盐度订正步骤。与水有较大总量开始（1L），也更有利于轮虫生长和存活的混养坦克。在先前公布的方法，在一个更小的体积较低的起始轮虫密度必要每天增加轮虫补充减员的损失（大概是由于水质差）和消费量发展鱼苗。这些调整的结果到协议dramat（相比于4喂养的4天以前的方法的一个饲养4天以上）ically减少人工投入。幼虫的生长和存活的性能比初始5天混养期是可比以前12出版。
轮虫培养物的生产率必然由馈送输入限制。 2000轮虫密度 - 3000 /毫升可使用这些方法简单地通过增加进料输送来实现。当每单位饲料的轮虫产量是已知的，进料速率可以调整，以匹配轮虫生产到预计的需求。在周末和节假日，喂养可以减少，收成省略了一两天不损害轮虫，虽然他们的生产潜力将是最理想的，直到正常的日常饲养和收获常规的简历。
当有未预料到的需要比平常更轮虫，人口的较大部分可以在不损害该小路收获TURE，但根据收获的大小的培养可能需要一天以上来恢复其通常的密度。如果轮虫的需求将减少超过一两天，生产最好通过降低饲料运输，而不是减少收成减少。至少25％/天的收获率保持一个年轻的轮虫年龄分布，使得轮虫是更具活力，肥沃，提高其在混养坦克的性能。
这个协议是很容易地适应较小尺度较小的斑马鱼设施。例如，一个15升培养，可以方便地设置在一标准5加仑（20升）桶，每天手喂养两次，可以容易地实现1000轮虫/ ml的密度。用进料泵使2000-3000 / ml的密度。单桶收获30％/天，因此可以提供5-15万元轮虫/日，足以启动10 - 30混养。两个桶可以以相同的CV + FCV协议描述中使用的波夫。藻类+氨控制器+ pH缓冲预混合饲料可用（ 见表特定试剂/设备 ），它是便于小规模的应用。它有足够的粘度，该藻类细胞不沉淀出来迅速，因此它不要求连续混合在进料储存器。
如果轮虫文化生产力下降，或死轮虫的一个不寻常的积累在文化中发现，所有的水质参数（温度，盐度，pH值， 氨浓度）应进行检查。 褶皱臂尾轮虫的正常进行的鸡蛋，直到它们孵化，和许多独立的鸡蛋（其通常不孵化）在培养的存在是应力因累计氨的标志，最频繁。
如果轮虫培养水是一种更强烈的绿色比平常，那么无论是进给速度过高或轮虫是不是自己平时的速度消耗的食物。通常这是CA所使用的任一个应力因子，或培养已被大量地捕捞没有根据降低的人口调整进给速率。在密集培养它是正常的棕色着色积聚在水作为藻类颜料由轮虫代谢。
盐水轮虫在第一馈送阶段的使用已经横跨斑马鱼研究界，因为该方法在2010年12年首次出版被广泛采用。为能够在这个协议中所概述的混养饲养方法所做的修改将允许更大数目的实验室采用这种方式，无论规模如何。这些进展是及时的;发展基因敲除技术（例如，CRISPR，TALENS等），斑马鱼，需要精简高效饲养协议种植成千上万的转基因鱼的新品种的使用在科学的各个领域。
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Disclosures
EC亨利是由芦苇海水养殖公司，该公司提供的轮虫，藻类的浓缩，和其他物资，以水产养殖和鱼类爱好者市场就业。
Acknowledgments
在保健和本协议描述的代表性结果产生鱼的使用是完全按照规定的机构动物护理和使用委员会在波士顿儿童医院，协议＃14-05-2673R的指导方针进行。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 L Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| RG Complete | Reed Mariculture | RG Complete 6 oz bottle | All in one microalgae based feed for small scale cultures |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
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