Introduction
De zebravis (Danio rerio) is een vooraanstaande proefdier gebruikt in een groeiend aantal wetenschappelijke disciplines, waaronder maar niet beperkt tot ontwikkelingsstoornissen genetica, toxicologie, gedrag, aquacultuur, regeneratieve biologie, en het modelleren van vele menselijke aandoeningen 1-5. Hoewel de species relatief gemakkelijk in het laboratorium te handhaven, zijn er een aantal managementuitdagingen verband met hun cultuur 6. De meest prominente van deze is opkweek van larven, vooral wanneer de vissen eerst beginnen te voeden na gas blaas inflatie 7. Onder normale gecontroleerde omstandigheden, deze ontwikkelingsfase gebeurtenis bij ~ 5 dagen na de bevruchting (DPF), met de volgende 3 - 5 dagen kweek zijn bijzonder kritisch 7. De centrale technische moeilijkheid in deze fase is om adequaat te voldoen aan de nutritionele behoeften van de eerste voeding larven - feed items moet de juiste maat zijn, Digestible, aantrekkelijk, en beschikbaar op een bijna continue basis, zonder dat overmatige afval kweken tanks. Historisch gezien is dit meestal bereikt door het leveren van een groot aantal kleine hoeveelheden voer om de vis in tanks, samen met routine water uitwisseling 8,9. Hoewel deze methoden zijn tot op zekere hoogte succesvol, ze zijn inefficiënt, vereisen een hoge input van arbeid, en terug te keren enige variabele en beperkte de tarieven van de groei en overleving 10.
In de natuur, de zebravis larven vermoedelijk voeden met overvloedige kleine zoöplankton aanwezig in de waterkolom 11. Daarom larvicultuur protocollen die levend voer zoals Paramecium, raderdiertjes en artemia bevatten typisch efficiëntste 7. In 2010, Best en co-auteurs aangetoond dat het mogelijk was om larvale zebravis groeien statische, brak water met zout raderdiertjes de eerste 5 dagen van exogene voeding 12. Deze aanpak, die harnases de natuurlijke hoge productiviteit van rotifer culturen om een ruime, zeer voedzaam prooi te bieden zonder vervuiling van het water, levert zeer hoge tarieven van larvale groei en overleving met een lage input van arbeid 12,13. De laatste jaren hebben een toenemend aantal laboratoria wereldwijd variaties van dit protocol vastgesteld, en velen nu kweken raderdiertjes op continue wijze om de kweek systemen 14 ondersteunen.
In de afgelopen jaren hebben methoden voor zowel raderdiertje / zebravis polycultuur en raderdiertje productie is verfijnd en verbeterd om meer gestandaardiseerde en gemakkelijk schaalbaar geworden. Dit artikel bevat stap-voor-stap instructies voor het 1) continu en robuust rotifeer productie en 2) de oprichting van de rotifer / zebravis polycultuursysteem gebruikt om de sterke groei van de vis te ondersteunen voor de eerste 5 dagen van exogene voeding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rotifer Cultuur
- Basiscomponenten van een Cultuurstelsel met een 100 L kweekvat
- Verzamel alle onderdelen voor de raderdiertje cultuur setup. De raderdiertje cultuur opstelling bestaat uit een kweekvat (CV) aan de raderdiertjes groeien; een gelijkaardig schip feedout raderdiertjes (feedout kweekvat, FCV) te behouden; een ronde bodem uitkomen jar (voerreservoir, FR) voor opslag van de algen toevoermengsel (AFM); een luchttoevoer (AS) te beluchten de CV, FCV en de FR; een peristaltische pomp met een lichtmeettijd (PMT) om de levering van algen voeding in de CV en FCV controleren; floss en een roetfilter (FPF), dat zit in de CV.
LET OP: Een compleet overzicht van supplies en onderdelen wordt in de Materials List.
- Verzamel alle onderdelen voor de raderdiertje cultuur setup. De raderdiertje cultuur opstelling bestaat uit een kweekvat (CV) aan de raderdiertjes groeien; een gelijkaardig schip feedout raderdiertjes (feedout kweekvat, FCV) te behouden; een ronde bodem uitkomen jar (voerreservoir, FR) voor opslag van de algen toevoermengsel (AFM); een luchttoevoer (AS) te beluchten de CV, FCV en de FR; een peristaltische pomp met een lichtmeettijd (PMT) om de levering van algen voeding in de CV en FCV controleren; floss en een roetfilter (FPF), dat zit in de CV.
- Configuratie
- Verheffen de CV en FCV op een stand of tafel, zodat de culturen gemakkelijk via een afvoer passend in een verzameling vervolg kan worden geoogstainer (Figuur 1). Gebruik flexibele luchttoevoerslang de AS verbinden met een lengte van stijve buis in elk kweekvat. Zorg ervoor dat de slang lang genoeg is om lucht te leveren aan de onderkant van de CV of FCV.
- Gebruik een kleine capaciteit luchtleiding naar de AS verbinden met een lengte van stijve buis die zich uitstrekt tot de bodem van het FR die de AFM bevat. Installeer een klep in elke luchtleiding om de luchtstroom te regelen. Sluit de FR aan de PMT diervoeders levering slangen, en voer de slang van de PMT in een gat geboord in de zijkant van de CV / FCV, in de buurt van de top. Figuur 1.
- Beginnen
- Vul het kweekvat tot 90% van het beschikbare volume met omgekeerde osmose (RO). Als RO niet beschikbaar is, gebruik schone, gedechloreerd gemeentelijke water; Er moet echter een bioveiligheid risicobeoordeling worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er geen potentieel pathogene organismen aanwezig in de bron water. OPMERKING: Een dergelijke analyse kan worden uitgevoerddoor een gekwalificeerde water testlaboratorium.
- Dosis van de cultuur schip water met aquarium zout aan een zoutgehalte van 15 g / l te bereiken. Stel de luchtstroom in het vat, zodat het blijft een "kook", en dan langzaam voeg de gemeten hoeveelheid zout aan de cultuur vat totdat deze volledig is opgelost door de beluchting. Verder beluchten het water gedurende> 1 uur om te verzekeren dat deze goed zuurstof.
- Maak de algen toevoermengsel. Tot 3 L schoon, chloorvrij vers (0 ppm) water voeg 100 g NaHCO 3 en 100 g ammonia neutralisatiemiddel (natrium hydroxymethylsulfonate). Dit laatste reagens biedt het extra voordeel van het neutraliseren van eventuele resterende chloor uit het leidingwater of bleekmiddel residuen van het zuiveren van de cultuur-apparatuur. Het is cruciaal om te waarborgen dat deze verbindingen volledig opgelost. Voeg vervolgens 1 liter algenconcentraat (biomassa drooggewicht ~ 15%). Voeg het voedingsmengsel aan de FR en bewaar bij 4 ° C.
- Voeg een voorgerecht cultuur van 5-10.000.000
- Schakel de PMT en beginnen met het pompen van de algen voeding in de raderdiertje cultuur schip. Met de functie timer van de PMT, stelt de levering tarief van algen voedingsmengsel zodat ~ 1,6 ml van algen toevoermengsel wordt geleverd per miljoen raderdiertjes in de cultuur, per dag. Verdeel voeder in kleine porties op regelmatige tijdstippen in de loop van een periode van 24 uur; hoe frequenter de voedingen, hoe beter.
- Kalibreer het debiet van de pomp door met de hand inschakelen van de PMT voor een bepaalde periode (bijvoorbeeld 1 min) en verzamel de algen die pompt in die periode in een maatcilinder of bekerglas. Als bijvoorbeeld de PMT doses 5 ml algen in 1 min, vervolgens de dosering zou5 ml algen / min.
- Bereken de vereiste dagelijkse voeding tarief door het aantal raderdiertjes aanwezig te vermenigvuldigen, in miljoenen, met 1,6 ml. Bijvoorbeeld, zou een rotifer cultuur met een populatiegrootte van 100 miljoen raderdiertjes vereisen ~ 160 ml voer per dag (100 x 1,6 ml).
- Stel de PMT aan de totale dagelijkse voeding eis regelmatig dosis gedurende een periode van 24 uur. Bijvoorbeeld kan toediening van een totale dagelijkse toevoer van 160 ml worden geleverd in porties eens 3 uur gedurende een periode van 24 uur met een PMT set met een doseerpomp snelheid van 5 ml / min gedurende 4 min, 8 maal daags (5 ml / min x 4 min = 20 ml x 8 voedingen = 160 ml).
- Laat de kweek groeien totdat genereert de gewenste populatie, typisch van 48 - 72 uur vóór het oogsten. 24 uur na de start, voeg de floss roetfilters om de cultuur vat en begint normaal onderhoud.
- Onderhoud
LET OP: De cultuur werkt op een continue basis en vereist routine onderhoud dat idealiter tegelijkertijd worden uitgevoerd elke dag, in deze volgorde.- Vul het FCV tot 90% van het beschikbare volume met schone, gedechloreerd zoet water, gedoseerd met 10 g / l aquarium zouten. Zorg ervoor dat het water goed gemengd is, en dat al het zout volledig is opgelost. Stel de luchtstroom in het vat, zodat het blijft een "kook". Meet het zoutgehalte met een refractometer en ervoor te zorgen dat het zoutgehalte is 10 g / l. Is het essentieel om dit doel te bereiken en niet te overschrijden.
- Proef de raderdiertjes in het CV: Zorg ervoor dat de cultuur is goed gemengd, verzamel dan 3 monsters van een 2-3 elk met een transfer pipet of autopipettor ml, uit verschillende delen van de cultuur. Combineer deze monsters in een buis of flesje van handige formaat (bv 10 ml).
- Overdracht 1 - 2 ml van het gecombineerde monster in een petrischaal, zodat deze kan worden gevisualiseerd onder een stereomicroscoop. Controleer de kwaliteit van de cultuur (zwemmen gedrag van deraderdiertjes, aanwezigheid van vrijstaande eieren, verontreinigende protozoa).
- Immobiliseer de raderdiertjes in de resterende gecombineerde monster door het toevoegen van 100 pl 50% Lugols joodoplossing het monster. Binnen enkele seconden na toevoeging van de Lugols, observeert de raderdiertjes zwemmen stoppen. Nu, gemakkelijk te tellen de raderdiertjes.
OPMERKING: Ethanol, verdunde bleekwater of azijn kan worden gebruikt in plaats van Lugols. Azijn (2 druppels / 10 ml) biedt de voordelen van niet-gevaarlijk, sterkte niet verliezen bij opslag bleekmiddel en jodium oplossingen en niet optimaal raderdiertjes contract, zodat de corona van cilia en de "voet" blijven uitgebreid en dieren er natuurlijker uitzien. - Zorg ervoor dat het monster goed gemengd (geïmmobiliseerd raderdiertjes zal snel te regelen), dan snel een ~ 2 ml subgroep in een plastic pipet en afzien 1 ml in een Sedgewick-Rafter tellen slide (20 x 50 1-mm vierkantjes) (figuur 2 ). Met behulp van een dissectie of samengestelde microscoop, de telling van de intacte raderdiertjes en de total aantal eieren verbonden aan deze raderdiertjes (figuur 2). Tellen als een groot deel van de dia gebied als nodig is om ~ tellen 100 raderdiertjes. Bereken het aantal raderdiertjes per ml en noteer deze in een spreadsheet of logboek.
- Oogst ~ 30% van het volume van de raderdiertjes in het CV: Verwijder de luchttoevoer en floss filter, langzaam de klep aan de onderzijde van de CV en laat het water stromen in een plankton collector met een 53 urn mesh zeef. Verzamel het water dat uit de onderkant van de collector na verfijning in een emmer of afvoer. Gebruik een milde tot matige stroom om te voorkomen dat schade aan de raderdiertjes. Sta niet toe dat de raderdiertjes te drogen op het scherm.
- Om redenen van consistentie, is het raadzaam om de FCV vast te stellen met een standaard aantal raderdiertjes elke dag. Daarom, gebaseerd op de bekende CV rotifer dichtheid en oogsten volume stelt het totale volume FCV een consistente uiteindelijke dichtheid te bereiken (bijv., 1500 raderdiertjes / ml). Voeg de geoogste rotifers aan de FCV: voorzichtig overdracht van de raderdiertjes uit de collectie scherm met behulp van een wassen fles gevuld met schoon zout water (10 - 15 g / l). Omkeren het scherm over de FCV en was de raderdiertjes in de FCV met een zachte stroom van zout water. Start de PMT om voer te leveren (~ 1,57 ml per miljoen raderdiertjes per dag) naar de FCV.
- Schrob de gehele binnenkant van de CV met een schone, zachte nylon borstel of scrub pad.
- Nieuwe combinatie van 15 g / l water door toevoeging van de juiste hoeveelheid zout tot een afgemeten hoeveelheid schone RO water in een 5 gallon emmer ter vervanging van de hoeveelheid water verloren te oogsten. Voeg het zout aan het water in de emmer en roer krachtig tot het volledig is opgelost, en vervolgens toe te voegen aan de CV.
- Met behulp van een hoge-druk-spray in een wastafel, spoel de floss filter totdat het vrij is van vuil, en dan terug naar het CV.
- Pas toevoersnelheden van algen door het veranderen van de duur van elke dosering evenement om CV afgeleverd volgens de dagelijkse telling van raderdiertjes / ml.Gebruik de berekeningen die in stap 1.3.8, hierboven om de juiste hoeveelheid voeder te leveren bepalen.
- Ongeveer 24 uur later, herhaal het proces. Begin met het oogsten van de raderdiertjes nog in de FCV (die niet noodzakelijk zijn voor de vorige dag) op dezelfde wijze als hierboven beschreven (stap 1.4.2 - 1.4.10). Concentreren ze in 2 liter vers, schoon gedechloreerd water (5 g / l zout). Deze kunnen bij 4 ° C worden bewaard als backup supply of gebruikt voor latere stadia van visvoer, dan wordt beschreven in dit protocol.
NB: Dit protocol maakt tot 2-3 dagen minder onderhoud cultuur (met een normale automatische voeding), omdat de raderdiertjes in het CV weglaten van oogsten kunnen verdragen zonder ernstige gevolgen.
2. polycultuur
- Opstelling
- Verzamelen zebravis embryo's uit een paai evenement door het gieten was aanleiding tot embryo's door middel van een thee-zeef en vervolgens voorzichtig spoelen met steriele fish water (of een andere niet-verontreinigde bron van de juiste geconditioneerde oplossing, bijvoorbeeld, embryo medium, E3, enz.) uit een wassen fles in petrischaaltjes.
- Incubeer de embryo's bij 25 - 28 ° C in petrischalen met een dichtheid van 40 - 50 embryo's per plaat gedurende 5 dagen.
- Begin de polycultuur fase op dag 5 na de bevruchting, of wanneer meer dan 90% van de uitgekomen larven zijn actief zwemmen in de waterkolom.
- Inenting
- Voeg 500 ml rotifer cultuur rechtstreeks van de FCV een 3,5 L kwekerij tank; opneming van rotifer cultuur water biedt algenvoeding dat de voedingswaarde van de raderdiertjes tijdens polycultuur onderhoudt.
- Giet de larven van de ene petrischaal in de kwekerij tank. Zorg dat er geen larven blijven in de schotel.
- Voeg 500 ml van schone, geconditioneerde vis water uit een recirculatiesysteem of dedicated waterbron naar de tank tot een eindvolume van 1 L en een uiteindelijke s bereiktalinity van 5 g / l.
LET OP: Deze zoutgehalte is van cruciaal belang, omdat de zebravis larven overleven zal negatief worden beïnvloed als zoutgehalte> 7 g / L en raderdiertje overleven zal negatief worden beïnvloed als het zoutgehalte <2 g / l.
- Polycultuur fase
LET OP: De polyculture fase moet duren tot 4 dagen na de inenting (een totaal van 5 dagen, wat overeenkomt met 5-9 dagen na de bevruchting).- Let op de polycultuur tank ten minste eenmaal per dag gedurende deze periode om ervoor te zorgen dat raderdiertjes en vis aanwezig en groeiende zijn. Zorg ervoor dat de raderdiertjes zijn de hele waterkolom zichtbaar. Zorg ervoor dat de de fishs zijn ook zichtbaar in de waterkolom, zwemmen onder de raderdiertjes.
- Het normale waterstroom door de tank. Plaats een scherm of baffle via afvoeropening opdat larven niet gespoeld uit de tank.
Opmerking: Aan het einde van deze fase, de vissen groot genoeg om grotere prooien zoals Artemia consumerennauplii of verwerkt feed items in de orde van grootte van 75-125 urn.
Opmerking: De dynamiek raderdiertje populatie binnen een representatieve polycultuur tank werden gemeten door bemonstering / tellen raderdiertjes uit de tank op dezelfde wijze als beschreven in stappen 1.4.2 - 1.4.5. Dit werd eenmaal per dag uitgevoerd vanaf het begin van de polyculture fase totdat het voltooid was.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De continue rotifer kweeksysteem beschreven is dynamisch en het is normaal dat rotifer aantallen fluctueren geringe mate in de tijd wanneer er variaties in de dagelijkse voeding en exploitatiehoeveelheden. De bevolking van de raderdiertjes in een van de actieve culturen in de aquacultuur faciliteiten Boston Children's Hospital, gehandhaafd op de hierboven beschreven werd gedurende 30 dagen (figuur 3). De gemiddelde kweekdichtheid deze periode was 932 raderdiertjes / mL, met een maximum van 1330 raderdiertjes / ml en minimaal 510 raderdiertjes / ml. Dit vertegenwoordigt de typische prestaties van een rotifer cultuur onderhouden in overeenstemming met dit protocol.
De dynamiek van de rotifer bevolking in een tank met polycultuur zebravis is weergegeven in figuur 4. Een 3,5 L aquarium werd geënt met 500 ml van rotifer kweek van FCV, 500 ml gesteriliseerde fish water, en 40 5-dagen oude wild-type (stam Tübingen) larven, om aan te tonen hoe raderdiertjes en zebravis presteren in een typisch polycultuur tank. De raderdiertje bevolking in de polyculture tank piekte op de tweede dag met een dichtheid van 747 raderdiertjes / ml (Figuur 4). De dichtheid van de raderdiertjes in het polyculture tank afgenomen over de 5 dagen polyculture periode met een minimum van 481 raderdiertjes / ml op dag 5. Echter, de gemiddelde rotifer dichtheid gedurende de gehele periode was 589,4 raderdiertjes / ml, en de minimale waarde van 481 raderdiertjes / ml ~ 10 keer die van de rotifer dichtheid bij het einde van de polyculture periode eerder gepubliceerd werk 12.
Zebravis groei gedurende de periode van vijf dagen wordt getoond in figuur 5. De vis een gestage groei per dag, van een gemiddelde totale lengte van 3,904 mm ± 0,063 SEM toen ze naar de polyculture tank toegevoegd tot een gemiddelde lengte van 5,423 ± 0,063 SEM opde laatste dag van de polycultuur fase. Overleving was 95% (38/40).
Waterkwaliteitsparameters werden dagelijks gemeten in de representatieve polyculture tank, en worden getoond in tabel 1. De waarden van deze parameters zijn vergelijkbaar met eerder gepubliceerd werk 12, en omstandigheden die bevorderlijk zijn voor de groei en overleving van zowel de raderdiertjes en vis vertegenwoordigen gedurende de periode van 5 dagen van de polycultuur.
| Dag | Dag | Zoutgehalte | BRUINEN | NO 2 | NO 3 | pH | Alkaliniteit | Hardheid | Temperatuur |
| (Actual) | (post-bevruchting) | g / l | mg / l | mg / l | mg / l | mg / l (CaCO 3) | mg / l (CaCO 3) | ° Celsius </ td> | |
| maandag | 5 | 5 | 2 | 0 | 0 | 8.4 | 120 | 425 | 23.2 |
| dinsdag | 6 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 180 | 425 | 23.3 |
| woensdag | 7 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.3 | 240 | 425 | 22.3 |
| donderdag | 8 | 6 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 240 | 425 | 22.8 |
| vrijdag | 9 | 7 | 3 | 0 | 0 | 7.9 | 240 | 425 | 22.2 |
Tabel 1. Waterkwaliteit Parameters ina Vertegenwoordiger zebravis polycultuur Tank.
Figuur 1. Rotifer Cultuur Setup Legend:. Cultuur Vessel (CV), feedout Cultuur Vessel (FCV), Air Supply (AS), Floss Particle Filter (FPF), Algen Feed Mengsel (AFM), Feed Reservoir (FR), Programmeerbare Metering timer (PMT). Ononderbroken lijnen vertegenwoordigen algen voeden levering. Gestippelde lijnen geven de lucht levering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Het vullen van een Sedgewick-Rafter Counting Slide. Klik hier om te bekijkengrotere versie van deze figuur.
. Figuur 3. Rotifer Population Dynamics in cultuur gedurende een 30 dagen periode Legenda: Het aantal getelde raderdiertjes (vrouwtjes + eieren) per ml op de x-as. Het aantal dagen in cultuur is op de y-as. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Rotifer Population Dynamics gedurende een 5 dagen polycultuur Legende:. Het aantal getelde raderdiertjes (vrouwtjes + eieren) per ml op de x-as. Het aantal dagen in polycultuur is op de y-as. Klik hier om view een grotere versie van deze figuur.
. Figuur 5. zebravis Growth tijdens een 5 daagse polycultuur Legend: Waarden zijn gemiddelde totale lengte in mm; foutbalken vertegenwoordigen standaardafwijking van het gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Succesvolle implementatie van de rotifer polyculture methode voor het voeden van de vroege larvale zebravis vereist een effectieve protocollen voor twee taken: het opzetten en onderhouden van een continu rotifer kweeksysteem te voeden de vis, en het kweken van de eerste voeden zebravis larven samen met raderdiertjes in dezelfde tank.
De opstelling voor continue zoutwater rotifer productiesysteem voor zebravis laboratoria eerst beschreven door Lawrence en co-auteurs 14 is gewijzigd en aangevuld op een aantal manieren om het zowel robuuster en universeel aanvraag. Het nieuwe protocol bevat verbeteringen in zowel de apparatuur en methodologie.
Het opslagsysteem voor de algen voedingsmengsel telt nu uitkomen potten gebruikt in meerval productiesystemen 15. Opslag van het voer in deze rondbodem potten vergemakkelijkt grondig mengen van algen voer zodat deze niet stratificeren en klonteren en tot verstoppenGing van levering lijnen, een probleem dat vaak geplaagd het oorspronkelijke protocol. Ook het gebruik van een alles-in-één programmeerbare timer / doseerpomp vermindert het aantal onderdelen en vereenvoudigt de gedoseerde afgifte van voeding naar de raderdiertjes. Het maakt ook de dosering van voeding naar de raderdiertjes op uurbasis over de 24-uurs periode, die de voorkeur verdient minder, maar grotere voedingen omdat het voer efficiënter wordt geassimileerd.
Een methode voor het tellen van raderdiertjes die fine-tuning van voer levering aan de raderdiertje cultuur toelaat is opgenomen in dit protocol. Het voeden van de raderdiertjes gebaseerd op een nauwkeurige, real-time beoordeling van de omvang van de bevolking zorgt voor stabiele, high-level productie. Een secundaire feedout Cultuur Vessel is ook toegevoegd aan het protocol. Een continu kweeksysteem kan dagelijks meer dan tientallen miljoenen raderdiertjes dan wat nodig is, zelfs voor een grote kwekerij werking te produceren, als gevolg van variaties in de kwekerij activiteit. Dit feedout Culture vaartuig wordt gebruikt voor raderdiertjes houden voor dagelijkse inoculatie van polycultures, en de resterende raderdiertjes kan worden toegevoerd als een hoogwaardig voedingssupplement later larvale en vroege ontwikkelingsstadia van vis. De verminderde zoutgehalte (10 g / l) in de FCV ook vooraf acclimates de raderdiertjes om de omstandigheden in de polycultuur tanks, zodat ze behouden krachtige zwemmen activiteit wanneer overgebracht.
Belangrijk is dat deze wijzigingen in de raderdiertje kweken protocol leiden tot directe verbetering van de polycultuur aanpak, met name met betrekking tot de input van arbeid. De vorige methode gepubliceerd door Best en co-auteurs betrokken niet alleen een eerste inenting van raderdiertjes op dag 5, maar ook dagelijks toevoegingen van raderdiertjes totdat de statische polyculture fase eindigde op dag 9 12. Gemiddelde raderdiertje dichtheden in deze periode piekte op 333 raderdiertjes / ml op de dag van inoculatie en onder 50 raderdiertjes / ml eindigde na afloop van de polyculture fase op dag 9 12. In tegenstelling, Het huidige protocol onderhoudt veel hogere dichtheden in, meestal beginnend bij ~ 665 raderdiertjes / ml, en eindigend met ~ 481 raderdiertjes / ml op dag 9.
Er zijn twee factoren waardoor deze veel hoger raderdiertje dichtheden. 1) De algemene robuustheid van de rotifer kweek gebruikt voor enting is veel groter. Bovendien is de herziene stap van het inoculeren polyculture met gelijke volumes algen / raderdiertjes bij 10 g / l zoutgehalte ~ 0 g / l zoutgehalte fish water, resulteert in een tussenliggende saliniteit van 5 g / l die heel polycultuursysteem wordt gehandhaafd. Beginnend met een grotere totale hoeveelheid water (1 l) tevens is bevorderlijk voor de groei en overleving rotifer in de polyculture tanks. In de eerder gepubliceerde methode, lagere start rotifer dichtheden in een kleiner volume noodzakelijk dagelijkse toevoegingen van raderdiertjes om verliezen door natuurlijk verloop te vullen (vermoedelijk als gevolg van slechte kwaliteit van water) en de consumptie door het ontwikkelen van vislarven. De resultaten van deze aanpassingen aan het protocol Dramattisch verminderen arbeid ingangen (één voeding meer dan 4 dagen in vergelijking met 4 voedingen in 4 dagen met de vorige methode). Larvale groei en overleving prestaties over de eerste 5 dagen polyculture periode vergelijkbaar met die eerder 12 gepubliceerd.
De productiviteit van rotifer culturen is noodzakelijkerwijs beperkt door de toevoer ingang. Rotifer dichtheden van 2000 - 3000 / ml kan worden bereikt met deze methoden alleen door meer voedingsafgifte. Bij rotifer opbrengst per eenheid voeder bekend, kan voeding worden aangepast rotifer productie geprojecteerde behoeften. In het weekend en op feestdagen, kan voeden worden verminderd en oogsten weggelaten voor een dag of twee zonder nadelige gevolgen voor de raderdiertjes, hoewel hun productieve potentieel suboptimale tot de normale dagelijkse voeding zal zijn en oogsten routine hervat.
Bij een onverwachte behoefte aan meer raderdiertjes dan normaal, kan een groter deel van de bevolking zonder nadelige gevolgen voor de cul worden geoogsttuur, maar afhankelijk van de grootte van de oogst de kweek kan een dag of meer nodig zijn gebruikelijke dichtheid herstellen. Als de vraag rotifer wordt verlaagd langer dan twee dagen, wordt de productie best verminderd door de voedingsafgifte plaats van het verminderen van de oogst. Een oogst van ten minste 25% / dag handhaaft een jongere leeftijd rotifer profiel, zodat de raderdiertjes zijn krachtiger en vruchtbaar, het verbeteren van hun prestaties in de polyculture tanks.
Dit protocol geeft ruimte aan kleinere schalen voor kleinere zebravis faciliteiten. Bijvoorbeeld, een 15 L kweek, die gemakkelijk kan worden ingesteld in een standaard 5 US gallon (20 L) emmer met de hand toevoeren tweemaal per dag, gemakkelijk bereiken van een dichtheid van 1000 raderdiertjes / ml. Het gebruik van een feed pomp maakt dichtheden van 2.000-3.000 / ml. Eén emmer geoogst bij 30% / dag kan daarom voorzien 5-15.000.000 raderdiertjes / dag, voldoende om 10 te starten - 30 polycultures. Twee emmers kunnen worden gebruikt in dezelfde CV + FCV protocol beschreven eenbove. Een algen + ammoniak controller + pH buffer pre-mix feed beschikbaar is (zie Tabel van specifieke reagentia / Equipment), die is geschikt voor kleinschalige toepassingen. Zij voldoende viscositeit dat de algen cellen niet bezinkt snel en dus niet continu mengen in de toevoer reservoir nodig.
Als de productiviteit raderdiertje cultuur afneemt, of een ongewone opeenhoping van dode raderdiertjes wordt gevonden in de cultuur, alle parameters voor de waterkwaliteit (temperatuur, zoutgehalte, pH, NH 3 concentratie) moet worden gecontroleerd. Brachionus plicatilis draagt normaal gesproken haar eieren tot ze uitkomen, en de aanwezigheid van vele losse eieren (die meestal niet uitkomen) in kweek is een teken van stress, meestal vanwege opgebouwde ammonia.
Als de raderdiertje cultuur water is een meer intense groen dan normaal, dan is ofwel de voeding te hoog is of de raderdiertjes niet consumeren van voedsel op hun gebruikelijke tarief. Meestal is dit cagebruikt door ofwel een stressfactor of de cultuur is overbevist zonder het aanpassen van voeding op basis van de beperkte populatie. In dichte culturen is het normaal dat een bruinverkleuring te accumuleren in het water als algen pigmenten worden gemetaboliseerd door de raderdiertjes.
Het gebruik van zoutwater raderdiertjes tijdens de eerste voeding fase is op grote schaal aangenomen over de zebravis onderzoeksgemeenschap sinds de methode voor het eerst werd gepubliceerd in 2010 12 van de wijzigingen aan de polyculture houderijsysteem die worden beschreven in dit protocol zal een nog groter aantal mogelijk te maken. laboratoria om deze aanpak te nemen, ongeacht de omvang. Deze voorschotten zijn tijd; ontwikkelingen in de gen-knockout-technologie (bijv., CRISPR, Talens, etc.) voor de zebravis zal gestroomlijnde en efficiënte opfok protocollen nodig hebben om duizenden nieuwe stammen van genetisch gemodificeerde vis te kweken voor gebruik op verschillende gebieden van de wetenschap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
EG Henry is in dienst van Reed Mariculture, Inc., een bedrijf dat raderdiertjes, algen concentraten en andere benodigdheden levert aan de aquacultuur en vis hobbyist markten.
Acknowledgments
De zorg en het gebruik van vis gegenereerd voor representatieve resultaten beschreven in dit protocol werd uitgevoerd in volledige overeenstemming met de uiteengezet door de Institutional Animal Care en gebruik Comite in Boston Children's Hospital, het protocol # 14-05-2673R richtlijnen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 L Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| RG Complete | Reed Mariculture | RG Complete 6 oz bottle | All in one microalgae based feed for small scale cultures |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
- Ribas, L., Piferrer, F. The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research. Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). , CRC Press. (2010).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish, A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. (2007).
- Carvalho, P., Arau, L. Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance. Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).
- Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis). Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).
- Lawrence, C. Advances in zebrafish husbandry and management. Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).
- Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-146 (2012).
- Biology and Culture of Channel Catfish. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. 34, 634-657 (2004).
