Introduction
Le poisson zèbre (Danio rerio) est un animal de laboratoire prééminente utilisé dans un nombre croissant de disciplines scientifiques, y compris mais non limité à la génétique du développement, de la toxicologie, de comportement, de l'aquaculture, de la biologie régénérative, et la modélisation de nombreux troubles humains 1 - 5. Bien que l'espèce est relativement facile à maintenir dans le laboratoire, il ya un certain nombre de défis de gestion associés à leur culture 6. Le plus important d'entre eux est l'élevage des larves, en particulier lorsque le poisson commence d'abord à nourrir à la suite de la vessie de gaz de l'inflation 7. Dans des conditions normales, contrôlées, cet événement se produit au développement ~ 5 jours après la fécondation (DPF), avec les 3 suivants - 5 jours de la croissance étant particulièrement critique 7. La difficulté technique central lors de cette étape est de répondre adéquatement aux besoins nutritionnels de la première larves d'alimentation - articles d'alimentation doivent être de taille appropriée, Digestible, attrayant, et disponible sur une base presque continue, sans créer trop de déchets dans des bacs de culture. Historiquement cela a été réalisé généralement en fournissant de nombreuses petites quantités d'aliments pour les poissons dans des réservoirs, avec la routine 8,9 d'échange de l'eau. Bien que ces méthodes sont à un certain degré de succès, ils sont inefficaces, nécessitent des apports élevés de main-d'œuvre, et ne retournent taux variables et limitées de croissance et la survie 10.
Dans la nature, larves de poisson zèbre nourrir vraisemblablement sur abondante petit zooplancton présents dans la colonne d'eau 11. Pour cette raison, les protocoles de larviculture qui intègrent des aliments vivants tels que la paramécie, rotifères et Artemia sont généralement plus efficace 7. En 2010, Best et co-auteurs ont démontré qu'il était possible de cultiver du poisson zèbre larvaire, l'eau saumâtre statique avec rotifères d'eau salée pour les 5 premiers jours de l'alimentation exogène 12. Cette approche, qui exploiteres la productivité naturelle élevée des cultures de rotifères pour assurer assez proie, très nutritif sans polluer l'eau, les rendements des taux très élevés de croissance et la survie des larves avec l'apport du travail faible 12,13. Au cours des dernières années, un nombre croissant de laboratoires dans le monde ont adopté des variantes de ce protocole, et beaucoup sont maintenant en culture de rotifères de façon continue de soutenir les systèmes de pépinières 14.
Au cours des dernières années, des méthodes à la fois pour rotifères / polyculture poisson zèbre et la production de rotifères ont été affinée et améliorée pour devenir plus normalisé et facilement évolutive. Cet article fournit des instructions étape-par-étape pour 1) la production de rotifères continu et robuste et 2) l'établissement de la / système de polyculture poisson zèbre de rotifères utilisée pour soutenir la croissance robuste de poissons pour les 5 premiers jours de l'alimentation exogène.
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Protocol
1. Rotifer Culture
- Composants de base d'un système de culture à l'aide d'un navire de 100 L Culture
- Rassemblez tous les composants nécessaires à l'installation de culture de rotifères. L'installation de culture de rotifères se compose d'un récipient de culture (CV) pour faire croître les rotifères; un navire similaire à maintenir rotifères avance matière (avance matière de navires de la culture, FCV); un pot à fond rond éclosion (Flux Reservoir, FR) pour le stockage du mélange d'alimentation des algues (AFM); une alimentation en air (AS) pour aérer le CV, CVF et le FR; une pompe péristaltique avec un temps de mesure (PMT) pour contrôler la livraison des aliments pour animaux d'algues dans le CV et FCV; et un filtre à particules fil (FPF) qui se trouve à l'intérieur du CV.
NOTE: Une liste complète des fournitures et des composants est prévue dans la liste des matières.
- Rassemblez tous les composants nécessaires à l'installation de culture de rotifères. L'installation de culture de rotifères se compose d'un récipient de culture (CV) pour faire croître les rotifères; un navire similaire à maintenir rotifères avance matière (avance matière de navires de la culture, FCV); un pot à fond rond éclosion (Flux Reservoir, FR) pour le stockage du mélange d'alimentation des algues (AFM); une alimentation en air (AS) pour aérer le CV, CVF et le FR; une pompe péristaltique avec un temps de mesure (PMT) pour contrôler la livraison des aliments pour animaux d'algues dans le CV et FCV; et un filtre à particules fil (FPF) qui se trouve à l'intérieur du CV.
- Configuration
- Élever le CV et FCV sur un stand ou une table afin que les cultures peuvent être facilement récoltées via un montage dans une collection suite vidangeAINER (Figure 1). Utiliser des tubes d'alimentation en air flexible pour relier les AS à une longueur de tube rigide dans chaque récipient de culture. Assurez-vous que le tuyau est suffisamment long pour fournir de l'air au fond du CV ou de FCV.
- Utiliser une conduite d'air de petite capacité pour connecter les AS à une longueur de tube rigide qui se prolonge vers le bas de la FR qui contient l'AFM. Installez une vanne dans chaque ligne de l'air pour réguler le débit d'air. Branchez le FR à la PMT avec des tubes de distribution d'aliments, et exécuter le tube de la PMT dans un trou percé dans le côté de la CV / FCV, près du sommet. Figure 1.
- Commencez
- Remplir le récipient de culture à 90% du volume disponible à l'eau d'osmose inverse (RO). Si RO ne sont pas disponibles, utiliser de l'eau municipale propre, sans chlore; Toutefois, une évaluation des risques en matière de biosécurité doit être effectuée pour s'assurer qu'aucun organismes potentiellement pathogènes sont présents dans l'eau de source. NOTE: Une telle analyse peut être effectuéepar tout laboratoire d'analyse de l'eau qualifié.
- Doser la culture de l'eau de la cuve avec le sel d'aquarium pour atteindre une salinité de 15 g / L. Régler le débit d'air dans le récipient de sorte qu'il maintient un "ébullition", puis ajouter lentement la quantité mesurée de sel dans le récipient de culture jusqu'à ce qu'il soit complètement dissous par l'aération. Continuer aération de l'eau pendant> 1 heure pour s'assurer qu'il est bien oxygéné.
- Ajouter le mélange d'alimentation d'algues. Pour 3 L de propre, déchloré (0 ppm) de l'eau fraîche, ajouter 100 g de NaHCO 3 et 100 g d'ammoniac neutralisant (hydroxymethylsulfonate de sodium). Ce dernier réactif offre l'avantage supplémentaire de neutraliser le chlore résiduel à partir de résidus de l'eau du robinet ou eau de Javel à la désinfection de l'équipement de culture. Il est essentiel de veiller à ce que ces composés sont complètement dissous. Puis ajouter 1 L de concentré d'algues (biomasse poids sec ~ 15%). Ajouter le mélange d'alimentation de la FR et conserver à 4 ° C.
- Ajouter une culture de départ de 5-10000000
- Allumez le PMT et commencer à pomper l'alimentation des algues dans la cuve de culture de rotifères. Utilisation de la fonction de la minuterie du PMT, fixer le taux de mélange d'alimentation des algues de livraison afin que ~ 1,6 ml de mélange d'alimentation des algues est livré par million de rotifères dans la culture, par jour. Distribuer les tétées en petites portions à intervalles réguliers au cours d'une période de 24 heures; la plus fréquente des tétées, le meilleur.
- Calibrer le débit de la pompe d'alimentation en tournant manuellement sur le PMT pour une période déterminée (par exemple, 1 min) et de ramasser les algues qu'il pompe pendant cet intervalle dans un cylindre ou gobelet gradué. Par exemple, si les doses PMT 5 ml d'algues en 1 min, puis le débit de dose serait5 ml d'algues / min.
- Calculer le taux d'alimentation journalière requise en multipliant le nombre de rotifères présents, en millions, de 1,6 ml. Par exemple, une culture de rotifères avec une taille de population de 100 millions de rotifères exigerait ~ 160 ml d'aliment par jour (100 x 1,6 ml).
- Régler le PMT de doser l'exigence d'alimentation quotidienne totale à intervalles réguliers tout au long d'une période de 24 heures. Par exemple, la livraison d'une quantité d'alimentation quotidienne totale de 160 ml pourrait être livré dans les parties une fois toutes les 3 heures sur une période de 24 heures en utilisant un ensemble de PMT avec un débit de la pompe de dosage de 5 ml / min pendant 4 min, 8 fois par jour (5 ml / min x 4 min = 20 ml x 8 tétées = 160 ml).
- Laisser la culture de se développer jusqu'à ce qu'il génère la population requise, généralement pour 48 à 72 h, avant la récolte. À 24 h post-démarrage, ajouter les filtres à particules soie à la cuve de la culture et de commencer l'entretien normal.
- entretien
REMARQUE: La culture fonctionne sur une base continue et nécessite routinmaintien de e qui devrait idéalement être effectuée à la même heure chaque jour, dans l'ordre suivant.- Remplissez le FCV à 90% du volume disponible avec propre, sans chlore de l'eau fraîche, à la dose de 10 g / l de sels d'aquarium. Assurez-vous que l'eau est bien mélangée, et que tout le sel est complètement dissous. Régler le débit d'air dans le récipient de sorte qu'il maintient un "ébullition". Mesurer la salinité avec un réfractomètre et veiller à ce que la salinité est de 10 g / L. Il est essentiel pour atteindre cet objectif et de ne pas dépasser.
- Goûtez les rotifères dans le CV: Assurez-vous que la culture est bien mélangé, puis recueillir 3 échantillons d'un 2 - 3 ml chacun utilisant une pipette de transfert ou autopipettor, provenant de différentes parties de la culture. Combinez ces échantillons dans un tube ou un flacon de format pratique (par exemple, 10 ml).
- Transfer 1 - 2 ml de l'échantillon combiné sur une boîte de Pétri de façon à pouvoir être visualisé sous un microscope à dissection. Vérifier la qualité de la culture (natation comportement de larotifères, présence d'œufs détachés, protozoaires contamination).
- Immobiliser les rotifères de l'échantillon combiné restant par addition de 100 ul de solution à 50% d'iode Lugols à l'échantillon. En quelques secondes après l'addition des Lugols, observer les rotifères pour arrêter la natation. Maintenant, comptez facilement les rotifères.
REMARQUE: éthanol, eau de Javel diluée, ou de vinaigre peuvent être utilisés à la place de Lugols. Vinaigre (2 gouttes / 10 ml) a l'avantage d'être non-dangereux, ne pas perdre de la force dans le stockage en tant que solutions de blanchiment et d'iode peut, et ne pas faire le contrat de rotifères, de sorte que la couronne de cils et le "pied" rester étendu et le animaux apparence plus naturelle. - Veiller à ce que l'échantillon est bien mélangé (rotifères immobilisés vont se déposer rapidement), puis prendre rapidement un ml sous-échantillon ~ 2 dans une pipette en plastique et distribuer 1 ml dans une lame de comptage Sedgewick-Rafter (20 x 50 1 mm carrés) (Figure 2 ). Utilisation d'un composé ou dissection microscope, compter les rotifères intactes et la tNuméro otal des oeufs attachés à ces rotifères (Figure 2). Comptent autant de la zone de diapositive que faut compter ~ 100 rotifères. Calculer le nombre de rotifères par ml, et d'enregistrer cela dans un tableur ou un journal de bord.
- Récolte ~ 30% du volume des rotifères dans le CV: Retirez l'alimentation en air et le filtre de la soie, ouvrir lentement la vanne de fond du CV et de permettre à l'eau de circuler dans un collecteur de plancton avec un tamis à mailles de 53 um. Recueillir l'eau sortant de la partie inférieure du collecteur après filtration dans un seau ou un drain. Utilisez un doux au flux modérée pour éviter d'endommager les rotifères. Ne laissez pas les rotifères à sécher sur l'écran.
- Pour des raisons de cohérence, il est conseillé d'établir le FCV avec un nombre standard de rotifères chaque jour. Par conséquent, basé sur le volume de la densité de rotifères de CV et la récolte connue, régler le volume FCV totale pour obtenir une densité finale conséquente (par ex., 1500 rotifères / ml). Ajouter le roti récoltésréfère à l'FCV: transférer délicatement les rotifères partir de l'écran de collection à l'aide d'une pissette remplie d'eau salée propre (10 - 15 g / L). Inversez l'écran au cours de la FCV et laver les rotifères dans le FCV avec un léger courant d'eau salée. Démarrez le PMT à livrer les aliments (~ 1,57 ml par million rotifères par jour) pour le FCV.
- Frotter tout l'intérieur du CV avec un chiffon propre, brosse douce en nylon ou tampon à récurer.
- Faire un nouveau mélange de 15 g / L d'eau en ajoutant la quantité appropriée de sel à une quantité mesurée d'eau RO propre dans un seau de 5 gallons pour remplacer le volume d'eau perdu à récolter. Ajouter le sel à l'eau dans le seau et mélanger vigoureusement jusqu'à ce qu'il soit complètement dissous, puis ajouter au CV.
- L'utilisation d'un jet à haute pression dans un évier, rincer la soie filtre jusqu'à ce qu'il soit exempt de débris, puis le retourner au CV.
- Ajuster les taux d'algues délivrée à la CV en changeant la durée de chaque événement de dosage d'alimentation, selon le nombre quotidien de rotifères / ml.Utilisez les calculs prévus à l'étape 1.3.8, ci-dessus pour déterminer la quantité appropriée d'aliments à livrer.
- Environ 24 heures plus tard, répétez le processus. Lancer la récolte par les rotifères restant dans le FCV (qui ne sont pas nécessaires pour le jour précédent) de la même manière que celle décrite ci-dessus (étapes 1.4.2 - 1.4.10). Les concentrer dans 2 litres d'eau propre et fraîche déchlorée (5 g / L de sel). Ceux-ci peuvent être conservés à 4 ° C comme une alimentation de secours, ou utilisées pour nourrir les étapes ultérieures de poissons, au-delà de ce qui est décrit dans ce protocole.
NOTE: Ce protocole permet jusqu'à 2 - 3 jours de maintenance réduite de culture (avec alimentation automatique normale), parce que les rotifères dans le CV peuvent tolérer omission des récoltes sans conséquences graves.
2. Polyculture
- Installer
- Recueillir embryons de poisson zèbre à partir d'un événement de frai en versant embryons engendrés par une passoire à thé, puis rincer délicatement avec FIS stérilesh d'eau (ou de toute autre source non contaminée de la solution conditionnée de manière appropriée, par exemple, le milieu de l'embryon, E3, etc.) à partir d'une bouteille dans des boîtes de Pétri de lavage.
- Incuber les embryons à 25 - 28 ° C dans des boîtes de Pétri, à une densité de 40 - 50 embryons par boîte pendant 5 jours.
- Commencez la phase de polyculture au jour 5 post-fécondation, ou lorsque plus de 90% des larves écloses sont activement la natation dans la colonne d'eau.
- Inoculation
- Ajouter 500 ml de culture de rotifères directement à partir du FCV à un 3.5 L pépinière réservoir; inclusion de l'eau de culture de rotifères fournit l'alimentation des algues qui maintient le contenu nutritionnel des rotifères pendant polyculture.
- Verser délicatement les larves d'une boîte de Pétri dans le réservoir de la pépinière. Veiller à ce qu'aucun larves restent dans le plat.
- Ajouter 500 ml d'eau propre de poisson, conditionné à partir d'un système de recirculation de l'eau ou d'une source dédiée à la cuve pour parvenir à un volume final de 1 L et une finale salinity de 5 g / L.
NOTE: Cette salinité est critique parce que la survie des larves de poisson zèbre sera impacté négativement si la salinité est> 7 g / L et la survie des rotifères seront négativement impactés si la salinité <2 g / L.
- Phase de polyculture
NOTE: La phase de polyculture devrait durer jusqu'à quatre jours après l'inoculation (un total de 5 jours, correspondant à 5-9 jours après la fécondation).- Observez le réservoir de polyculture au moins une fois par jour pendant cette période pour assurer que les rotifères et les poissons sont présents et en croissance. Veiller à ce que les rotifères sont visibles dans toute la colonne d'eau. Veiller à ce que les les fishs sont également visibles au sein de la colonne d'eau, nager parmi les rotifères.
- Commencez écoulement normal des eaux à travers le réservoir. Placer un écran ou déflecteur au-dessus de l'orifice de vidange afin d'assurer que les larves ne sont pas évacuée de la cuve.
NOTE: A la fin de cette phase, les poissons seront assez grand pour consommer de plus grandes proies telles que Artemiaarticles d'alimentation nauplii ou transformés dans la gamme de taille de 75 à 125 um.
NOTE: La dynamique des populations de rotifères dans un réservoir de polyculture représentant ont été mesurées par échantillonnage / rotifères compter du réservoir de la même manière que celle décrite dans les étapes 1.4.2 - 1.4.5. Ceci a été réalisé une fois par jour depuis le début de la phase de polyculture jusqu'à ce qu'elle soit terminée.
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Representative Results
Le système de culture de rotifères continu décrit ici est dynamique, et il est normal pour les numéros de rotifères de fluctuer dans une faible mesure au fil du temps si il ya des variations dans les taux d'alimentation et de récolte quotidienne. La population de rotifères dans l'une des cultures actives dans les installations d'aquaculture à l'Hôpital pour enfants de Boston, maintenue de la manière décrite ci-dessus, a été surveillée pendant 30 jours (figure 3). La densité de culture moyen pendant cette période était de 932 rotifères / ml, avec un maximum de 1,330 rotifères / ml et un minimum de 510 rotifères / ml. Cela représente la performance typique d'une culture de rotifères entretenu conformément à ce protocole.
La dynamique de la population de rotifères dans un réservoir de polyculture avec le poisson zèbre est représenté en figure 4. Un réservoir de poissons de 3,5 L a été inoculé avec 500 ml de culture de rotifères du FCV, 500 ml de stérilisée fish l'eau, et 40 de 5 jours à l'ancienne de type sauvage (souche Tübingen) de larves, afin de démontrer comment les rotifères et le poisson zèbre effectuer dans un réservoir de polyculture typique. La population de rotifères dans le réservoir de polyculture culminé le deuxième jour avec une densité de 747 rotifères / ml (Figure 4). La densité des rotifères dans le réservoir de polyculture diminué au cours de la période de polyculture de 5 jours à un minimum de 481 rotifères / ml au jour 5. Cependant, la densité de rotifères moyenne tout au long de la période était de 589,4 rotifères / ml, et la valeur minimale de 481 rotifères / ml est ~ 10 fois celle de la densité de rotifères à la fin de la période de la polyculture dans des travaux déjà publiés 12.
La croissance du poisson zèbre au cours de la période de cinq jours est illustrée à la figure 5. Le poisson a montré une croissance régulière chaque jour, à partir d'une longueur totale moyenne de 3.904 mm ± 0,063 SEM quand ils ont été ajoutés à la cuve de polyculture à une longueur totale moyenne de 5.423 ± 0,063 SEM surla dernière journée de la phase de polyculture. La survie était de 95% (38/40).
Paramètres de qualité de l'eau ont été mesurés quotidiennement dans le réservoir de polyculture représentant, et sont présentés dans le tableau 1. Les valeurs de ces paramètres sont similaires au travail déjà publié 12, et représentent des conditions propices à la croissance et la survie des rotifères et le poisson au cours de la période de 5 jours de la polyculture.
| jour | jour | Salinité | BRONZER | NO 2 | NO 3 | pH | Alcalinité | Dureté | Température |
| (Réel) | (après la fécondation) | g / L | mg / L | mg / L | mg / L | mg / L (CaCO 3) | mg / L (CaCO 3) | ° C </ td> | |
| Lundi | 5 | 5 | 2 | 0 | 0 | 8.4 | 120 | 425 | 23,2 |
| Mardi | 6 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 180 | 425 | 23,3 |
| Mercredi | 7 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.3 | 240 | 425 | 22,3 |
| Jeudi | 8 | 6 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 240 | 425 | 22,8 |
| Vendredi | 9 | 7 | 3 | 0 | 0 | 7.9 | 240 | 425 | 22,2 |
Tableau 1. Paramètres de la qualité de l'eau ina Représentant poisson zèbre Polyculture Tank.
Figure Setup 1. Rotifer Culture Légende:. Culture navire (CV), avance matière Culture navire (FCV), Air Supply (AS), Floss filtre à particules (FPF), algues RSS Mélange (AFM), Flux Reservoir (FR), mesure programmable minuterie (PMT). Les lignes continues représentent la livraison d'alimentation des algues. Les lignes pointillées représentent la livraison de l'air. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Remplissage d'une lame de comptage Sedgewick-Rafter. S'il vous plaît cliquer ici pour voir uneplus grande version de ce chiffre.
. Figure 3. rotifères Population Dynamics en culture sur une période de 30 jours Légende: Le nombre de rotifères comptés (femelles + oeufs) par ml est sur l'axe des x. Le nombre de jours de culture est sur l'axe y. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Dynamique de la population de rotifères pendant une polyculture de 5 jours Légende:. Le nombre de rotifères comptés (femelles + oeufs) par ml est sur l'axe des x. Le nombre de jours de polyculture est sur l'axe-y. S'il vous plaît cliquez ici pour view une version plus grande de cette figure.
. Figure 5. poisson zèbre croissance au cours d'une polyculture de 5 jours Légende: Les valeurs sont longueur totale moyenne en mm; barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Mise en œuvre réussie de la méthode de polyculture de rotifères pour alimenter début poisson zèbre larvaire nécessite des protocoles efficaces pour deux tâches: la mise en place et la maintenance d'un système de culture de rotifères continue de nourrir les poissons, et la culture de la première alimentation larves de poisson zèbre avec rotifères dans le même réservoir.
L'installation d'un système de production d'eau salée de rotifères continue pour les laboratoires de poisson zèbre premier décrites par Laurent et co-auteurs de 14 a été modifié et amélioré dans un certain nombre de façons de rendre à la fois plus robuste et d'application universelle. Le nouveau protocole comporte des améliorations à la fois dans l'équipement et la méthodologie.
Le système de stockage pour le mélange d'alimentation des algues emploie aujourd'hui pots utilisés dans les systèmes de production de poisson-chat de 15 éclosion. Le stockage de la charge d'alimentation dans ces pots à fond rond facilite un mélange intime de la charge d'algues afin qu'il ne pas stratifier ou agglutiner et conduire à obstruerGing des lignes de distribution, un problème qui souvent en proie au protocole original. De même, l'utilisation d'une pompe / dosage tout-en-un minuteur programmable réduit le nombre total de composants et simplifie la distribution dosée d'alimentation des rotifères. Il permet également le dosage d'aliments pour les rotifères sur une base horaire au cours de la période de 24 h, ce qui est préférable à moins nombreuses et plus les tétées car l'alimentation est assimilé plus efficacement.
Une méthode de comptage des rotifères qui permet de réglage fin de la livraison d'alimentation à la culture des rotifères a été inclus dans ce protocole. Nourrir les rotifères basés sur une, évaluation réelle de l'heure exacte de leur taille de la population assure stable, la production de haut niveau. Un navire avance matière secondaire Culture a également été ajoutée au protocole. Un système de culture continue peut produire un excès quotidienne de dizaines de millions de rotifères delà de ce qui est nécessaire, même pour une grande marche de la pépinière, en raison de variations de l'activité de la pépinière. Cette avance matière Culture navire est utilisé pour maintenir les rotifères pour l'inoculation quotidienne de polycultures et les rotifères restants peut être alimenté comme un supplément nutritionnel de haute qualité à plus tard des larves et des premiers stades juvéniles de poissons. La salinité réduite (10 g / L) dans le FCV également pré-acclimate les rotifères aux conditions dans les réservoirs de polyculture, afin qu'ils maintiennent activité de nage vigoureuse lors de son transfert.
Surtout, ces modifications à la rotifères protocole de culture conduisent à orienter les améliorations dans l'approche de la polyculture, en particulier en ce qui concerne l'apport de travail. La méthode précédente publiée par Best et co-auteurs impliqués non seulement une inoculation initiale de rotifères au jour 5, mais aussi des ajouts quotidiens de rotifères jusqu'à la phase de polyculture statique clos au jour 9 12. Les densités moyennes de rotifères pendant cette période a culminé à 333 rotifères / ml sur le jour de l'inoculation et a fini en dessous de 50 rotifères / ml à la fin de la phase de polyculture au jour 9 12. En revanche, Le protocole actuel maintient des densités beaucoup plus élevées tout au long, généralement à partir de ~ 665 rotifères / ml, et se terminant avec ~ 481 rotifères / ml au jour 9.
Il ya deux facteurs permettant à ces densités de rotifères beaucoup plus élevés. 1) La robustesse globale de la culture de rotifères utilisé pour l'inoculation est beaucoup plus grande. En outre, l'étape révisé à inoculer la polyculture avec des volumes égaux d'algues / rotifères à 10 g / L de la salinité et ~ 0 g / L d'eau de poissons de la salinité, les résultats dans une salinité intermédiaire de 5 g / L qui est maintenue tout au long de la polyculture. À partir d'un plus grand volume d'eau total (1L) est également plus propice à la croissance de rotifères et de survie dans les réservoirs de polyculture. Dans la méthode précédemment publié, faible densité départ de rotifères dans un plus petit volume a nécessité ajouts quotidiens de rotifères pour reconstituer les pertes par attrition (probablement en raison de la mauvaise qualité de l'eau) et de la consommation par le développement des larves de poissons. Les résultats de ces adaptations du protocole de Dramatment de réduire les entrées de main-d'œuvre (une alimentation plus de 4 jours, comparativement à 4 tétées en 4 jours avec la méthode précédente). La croissance des larves et les performances de survie au cours de la période initiale de polyculture de 5 jours est comparable à celui publié antérieurement 12.
La productivité des cultures de rotifères est nécessairement limité par l'entrée d'alimentation. Rotifères densités de 2,000 - 3,000 / ml peuvent être obtenus avec ces procédés en augmentant simplement la fourniture d'alimentation. Lorsque le rendement rotifères par unité de charge est connu, le taux d'alimentation peut être ajustée pour correspondre à la production de rotifères aux besoins projetés. Pendant les week-ends et les jours fériés, l'alimentation peut être réduite et les récoltes omises pour un jour ou deux sans nuire aux rotifères, bien que leur potentiel productif sera sous-optimale jusqu'à l'alimentation quotidienne normale et récolter les curriculum vitae de routine.
Quand il ya une nécessité imprévue pour plus de rotifères que d'habitude, une plus grande partie de la population peut être récolté sans nuire à l'culture, mais en fonction de la taille de la récolte de la culture peut exiger une journée ou plus pour récupérer sa densité habituelle. Si la demande de rotifères sera réduit pendant plus d'un jour ou deux, la production est surtout réduite en réduisant la distribution des aliments, plutôt que de diminuer la récolte. Un taux d'au moins 25% / jour de la récolte maintient un profil d'âge plus jeune des rotifères sorte que les rotifères sont plus vigoureux et fécond, l'amélioration de leur performance dans les réservoirs de polyculture.
Ce protocole est facilement adapté à des échelles plus petites pour les petites installations de poisson zèbre. Par exemple, à 15 L de la culture, qui peut être facilement mis en place dans un godet standard 5 gallons US (20 L) avec la main-nourrir deux fois par jour, peut facilement atteindre une densité de 1.000 rotifères / ml. Utilisation d'une pompe d'alimentation permet des densités de 2000-3000 / ml. Un seul seau récolté à 30% / jour peut donc fournir des 5-15 millions de rotifères / jour, assez pour commencer 10 - 30 polycultures. Deux godets peuvent être utilisés dans le même CV + FCV un protocole tel que décritBove. Un tampon algues contrôleur + pH ammoniac + pré-mélange d'alimentation est disponible (voir le tableau des réactifs spécifiques / Équipement) qui est pratique pour les applications à petite échelle. Il possède une viscosité suffisante pour que les cellules des algues se déposent ne rapidement et donc il ne nécessite pas de mélange en continu dans le réservoir d'alimentation.
Si la baisse de la productivité de la culture de rotifères, ou une accumulation inhabituelle de rotifères morts se trouve dans la culture, tous les paramètres de qualité de l'eau (température, salinité, pH, NH 3 concentration) doivent être vérifiés. Brachionus plicatilis exerce normalement ses oeufs jusqu'à leur éclosion, et de la présence de nombreux oeufs seules (qui habituellement ne éclosent) dans la culture est un signe de stress, le plus souvent en raison de l'ammoniac accumulé.
Si l'eau de culture de rotifères est d'un vert plus intense que d'habitude, alors soit le taux d'alimentation est trop élevée ou les rotifères sont pas consommer de la nourriture à leur taux habituel. Habituellement, cela est casoit utilisé par un facteur de stress, ou de la culture a été surexploité sans ajuster le taux d'alimentation en fonction de la population réduite. Dans les cultures denses, il est normal pour une coloration brune à accumuler dans l'eau en tant que pigments d'algues sont métabolisés par les rotifères.
L'utilisation de rotifères d'eau salée pendant la première phase de l'alimentation a été largement adopté à travers le milieu de la recherche du poisson zèbre depuis la méthode a été d'abord publié en 2010 12. Les modifications apportées à la méthode de polyculture élevage qui sont décrites dans ce protocole permettra à un plus grand nombre de laboratoires d'adopter cette approche, indépendamment de l'échelle. Ces progrès sont en temps opportun; l'évolution des technologies KO génique (par exemple., CRISPR, TALENs, etc.) pour le poisson-zèbre nécessitera protocoles d'élevage simplifiés et efficaces pour développer des milliers de nouvelles souches de poissons génétiquement modifiés pour l'utilisation dans divers domaines de la science.
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Disclosures
CE Henry est employé par Reed mariculture, Inc., une société qui fournit des rotifères, des concentrés d'algues et d'autres fournitures pour les marchés bricoleurs aquaculture et de la pêche.
Acknowledgments
Le soin et l'utilisation des poissons généré des résultats représentatifs décrits dans ce protocole a été effectuée en pleine conformité avec les lignes directrices énoncées par le Comité de protection des animaux dans les institutions et l'utilisation à l'Hôpital pour enfants de Boston, le protocole # 14-05-2673R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 L Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| RG Complete | Reed Mariculture | RG Complete 6 oz bottle | All in one microalgae based feed for small scale cultures |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
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- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). , CRC Press. (2010).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish, A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. (2007).
- Carvalho, P., Arau, L. Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance. Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).
- Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis). Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).
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- Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-146 (2012).
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