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Developmental Biology

पालन ​​पहली खिलाने zebrafish के लिए पूर्ण और अद्यतन "Rotifer Polyculture विधि"

Published: January 17, 2016 doi: 10.3791/53629
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1, 4
1Aquatic Resources Program, Boston Children's Hospital, 2UQ Biological Resources, University of Queensland, 3Reed Mariculture, 4Aquatics Lab Services

Introduction

zebrafish (Danio rerio), वैज्ञानिक विषयों की एक बढ़ती हुई संख्या में उपयोग एक पूर्व प्रख्यात प्रयोगशाला जानवर है लेकिन सहित विकास आनुवंशिकी, विष विज्ञान, व्यवहार, मत्स्य पालन, पुनर्योजी जीव विज्ञान, और कई मानव विकारों 1 की मॉडलिंग के लिए ही सीमित नहीं - 5। प्रजातियों प्रयोगशाला में बनाए रखने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, उनकी संस्कृति 6 के साथ जुड़े प्रबंधन की चुनौतियों का एक नंबर रहे हैं। इनमें से सबसे प्रमुख मछली पहले गैस मूत्राशय मुद्रास्फीति 7 के लिए बाद में खिलाने के लिए शुरू हो, खासकर जब लार्वा पालन है। विकास के 5 दिनों के विशेष रूप से महत्वपूर्ण 7 जा रहा है - सामान्य, नियंत्रित परिस्थितियों में, इस विकास घटना के बाद 3 से 5 ~ में दिन बाद निषेचन (DPF), होता है। फ़ीड आइटम, diges उचित आकार का होना चाहिए - इस चरण के दौरान केंद्रीय तकनीकी कठिनाई पर्याप्त रूप से पहले खिला लार्वा की पोषण संबंधी मांगों को पूरा करने के लिए हैसंवर्धन के टैंक में अत्यधिक बर्बादी बनाने के बिना लगभग एक सतत आधार पर आकर्षक है, और उपलब्ध tible,। ऐतिहासिक दृष्टि से इस दिनचर्या पानी विनिमय 8,9 के साथ-साथ, टैंक में मछली के लिए चारा की कई छोटी मात्रा में देने से आम तौर पर हासिल किया गया है। इन तरीकों में कुछ हद तक सफल रहे हैं, वे, अक्षम हैं उच्च श्रम आदानों की आवश्यकता होती है, और केवल चर और विकास और अस्तित्व के 10 के सीमित दरों वापसी।

प्रकृति में, zebrafish लार्वा संभवतः पानी कॉलम 11 में प्रचुर मात्रा में छोटे प्राणीमन्दप्लवक वर्तमान पर खिलाओ। इस कारण से, इस तरह के Paramecium, रोटीफर्स, और Artemia के रूप में रहते फ़ीड शामिल है कि larviculture प्रोटोकॉल आम तौर पर 7 सबसे कुशल हैं। 2010 में, सबसे अच्छा और सह लेखक यह बहिर्जात खिला 12 के पहले 5 दिनों के लिए खारे पानी रोटीफर्स के साथ स्थिर, खारे पानी में लार्वा zebrafish विकसित करने के लिए संभव था कि प्रदर्शन किया। दोहन ​​जो यह दृष्टिकोण,तों rotifer संस्कृतियों के प्राकृतिक उच्च उत्पादकता कम श्रम इनपुट 12,13 साथ लार्वा विकास और अस्तित्व की पैदावार बहुत ऊंची दरों, पानी प्रदूषण के बिना पर्याप्त, बेहद पौष्टिक शिकार प्रदान करने के लिए। हाल के वर्षों में दुनिया भर में प्रयोगशालाओं की संख्या बढ़ रही इस प्रोटोकॉल के रूपांतरों को गोद लिया है, और कई अब नर्सरी प्रणालियों 14 का समर्थन करने के लिए एक सतत फैशन में रोटीफर्स संवर्धन कर रहे हैं।

पिछले कई वर्षों से, rotifer / zebrafish polyculture और rotifer उत्पादन के लिए दोनों तरीकों का परिष्कृत और अधिक मानकीकृत और आसानी से स्केलेबल बनने के लिए सुधार किया गया है। यह लेख एक के लिए कदम-दर-कदम निर्देश) सतत और मजबूत rotifer उत्पादन और 2) बहिर्जात खिलाने के पहले 5 दिनों के लिए मछली के मजबूत विकास का समर्थन करने के लिए इस्तेमाल rotifer / zebrafish polyculture प्रणाली की स्थापना प्रदान करता है।

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Protocol

1. Rotifer संस्कृति

  1. एक 100 एल संस्कृति पोत का उपयोग कर एक संस्कृति के लिए सिस्टम के बुनियादी घटकों
    1. Rotifer संस्कृति की स्थापना के लिए सभी घटकों को इकट्ठा होते हैं। rotifer संस्कृति सेटअप रोटीफर्स विकसित करने के लिए एक संस्कृति पोत (सीवी) के होते हैं; इसी तरह के एक पोत feedout रोटीफर्स (feedout संस्कृति पोत, एफ सी वी) को बनाए रखने के लिए; एक दौर तली अंडे सेने जार शैवाल फ़ीड मिश्रण (AFM) के भंडारण के लिए (जलाशय, एफआर फ़ीड); एक हवा की आपूर्ति (एएस) सीवी, एफ सी वी और एफआर aerate करने के लिए; CV और एफ सी वी में शैवाल फ़ीड के वितरण को नियंत्रित करने के लिए एक पैमाइश टाइमर (पीएमटी) के साथ एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप; और सीवी अंदर बैठता है कि एक सोता कण फिल्टर (FPF)।
      नोट: आपूर्ति और घटकों की एक पूरी सूची सामग्री सूची में प्रदान की जाती है।
  2. विन्यास
    1. संस्कृतियों को आसानी से एक संग्रह शेष भाग में फिटिंग एक नाली के माध्यम से काटा जा सकता है, ताकि एक स्टैंड या मेज पर CV और एफ सी वी तरक्कीainer (चित्रा 1)। प्रत्येक संस्कृति के बर्तन में कठोर टयूबिंग की लंबाई के रूप में कनेक्ट करने के लिए लचीला हवा की आपूर्ति ट्यूबिंग का प्रयोग करें। ट्यूबिंग सीवी या एफ सी वी के नीचे करने के लिए हवा देने के लिए काफी लंबे समय से है कि सुनिश्चित करें।
    2. AFM होता है कि एफआर की तह तक फैली हुई है कि कठोर टयूबिंग की लंबाई के रूप में जोड़ने के लिए एक छोटे क्षमता एयर लाइन का प्रयोग करें। हवा के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए प्रत्येक हवा लाइन में एक वाल्व स्थापित करें। चारा वितरण ट्यूबिंग साथ पीएमटी के लिए एफआर कनेक्ट करें, और शीर्ष के निकट, सीवी / एफ सी वी के पक्ष में drilled छेद में पीएमटी से ट्यूबिंग चलाते हैं। चित्रा 1।
  3. चालू होना
    1. रिवर्स ऑस्मोसिस पानी (आरओ) के साथ उपलब्ध मात्रा का 90% करने के लिए संस्कृति पोत भरें। आरओ उपलब्ध नहीं है, तो साफ है, dechlorinated नगर निगम के पानी का उपयोग करें; हालांकि, एक biosecurity जोखिम मूल्यांकन कोई संभावित रोगजनक जीवों स्रोत पानी में मौजूद हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए। नोट: इस तरह के एक विश्लेषण किया जा सकता हैकिसी भी योग्य जल परीक्षण प्रयोगशाला द्वारा।
    2. 15 ग्राम / एल की लवणता तक पहुंचने के लिए मछलीघर नमक के साथ संस्कृति पोत पानी खुराक। यह एक "रोलिंग फोड़ा" का कहना है कि इतनी बर्तन में हवा का प्रवाह निर्धारित करें, और यह पूरी तरह से वातन द्वारा भंग कर रहा है जब तक फिर धीरे धीरे संस्कृति पोत के लिए नमक की मापा राशि जोड़ें। यह पूरी तरह से ऑक्सीजन है कि यह सुनिश्चित करने के लिए> 1 घंटे के लिए पानी aerating जारी रखें।
    3. शैवाल फ़ीड मिश्रण बनाओ। स्वच्छ 3 एल, ताजा (0 पीपीएम) पानी 3 NaHCO की 100 ग्राम और अमोनिया neutralizer (सोडियम hydroxymethylsulfonate) की 100 ग्राम जोड़ने dechlorinated। यह पिछले अभिकर्मक संस्कृति उपकरणों की sanitizing से नल के पानी या ब्लीच अवशेषों से किसी भी अवशिष्ट क्लोरीन को निष्क्रिय करने के अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है। यह इन यौगिकों को पूरी तरह भंग कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। तब शैवाल ध्यान (बायोमास सूखी वजन ~ 15%) की 1 एल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर एफआर और स्टोर करने के लिए चारा मिश्रण जोड़ें।
    4. 5-10,000,000 की एक स्टार्टर संस्कृति जोड़ें
    5. पीएमटी पर मुड़ें और rotifer संस्कृति पोत में शैवाल फ़ीड पम्पिंग शुरू करते हैं। पीएमटी के टाइमर सुविधा का उपयोग करना, कि ~ शैवाल फ़ीड मिश्रण की 1.6 मिलीग्राम प्रति दिन, संस्कृति में दस लाख रोटीफर्स प्रति वितरित किया जाता है, ताकि शैवाल फ़ीड मिश्रण के प्रसव की दर निर्धारित किया है। एक 24 घंटा अवधि के पाठ्यक्रम पर नियमित अंतराल पर छोटे भागों में feedings वितरित; feedings अधिक लगातार, बेहतर है।
    6. मैन्युअल रूप से एक निर्धारित अवधि (जैसे, 1 मिनट) के लिए पीएमटी मोड़ से पंप के वितरण दर जांचना और यह एक स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर या बीकर में इस अंतराल के दौरान पंप कि शैवाल इकट्ठा। उदाहरण के लिए, पीएमटी खुराक शैवाल के 5 मिलीलीटर 1 मिनट में है, तो खुराक दर होगी5 मिलीलीटर शैवाल / मिनट।
    7. 1.6 मिलीलीटर से, लाखों में, वर्तमान रोटीफर्स की संख्या से गुणा करके आवश्यक दैनिक खिला दर की गणना। उदाहरण के लिए, 100 करोड़ रोटीफर्स की आबादी के आकार के साथ एक rotifer संस्कृति ~ दिन (100 x 1.6 एमएल) के प्रति चारा की 160 मिलीलीटर की आवश्यकता होगी।
    8. एक 24 घंटा अवधि के दौरान नियमित अंतराल पर कुल दैनिक चारा आवश्यकता खुराक के लिए पीएमटी सेट करें। उदाहरण के लिए, 160 मिलीलीटर की कुल दैनिक फ़ीड राशि का वितरण भागों में दिया जा सकता है एक बार 8 बार दैनिक 4 मिनट, 5 मिलीग्राम / मिनट की एक खुराक पंप दर के साथ एक पीएमटी सेट का उपयोग कर एक 24 घंटा अवधि में हर 3 घंटा (5 मिलीग्राम / मिनट एक्स 4 मिनट = 20 मिलीलीटर एक्स 8 feedings = 160 एमएल)।
    9. कटाई से पहले, 72 घंटा - यह आवश्यक जनसंख्या उत्पन्न करता है जब तक संस्कृति 48 के लिए आम तौर पर विकसित करने के लिए अनुमति दें। 24 घंटे में अप के बाद शुरू संस्कृति पोत को सोता कण फिल्टर जोड़ सकते हैं और सामान्य रखरखाव शुरू करते हैं।
  4. रखरखाव
    नोट: संस्कृति एक सतत आधार पर चल रही है और routin की आवश्यकता हैआदर्श रूप में निम्नलिखित क्रम में प्रत्येक दिन एक ही समय में किया जाना चाहिए कि ई रखरखाव।
    1. स्वच्छ साथ उपलब्ध मात्रा का 90% करने के लिए एफ सी वी भरें, 10 ग्राम / एल मछलीघर नमक के साथ dosed ताजा पानी, dechlorinated। पानी अच्छी तरह से मिला है, और नमक के सभी पूरी तरह से भंग कर रहा है कि सुनिश्चित करें। यह एक "रोलिंग फोड़ा" का कहना है कि इतनी बर्तन में हवा का प्रवाह निर्धारित करें। एक Refractometer साथ लवणता उपाय और लवणता 10 जी / एल है कि यह सुनिश्चित करने। ऐसा लगता है कि पार करने के लिए इस लक्ष्य को पूरा करने और नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    2. संस्कृति के विभिन्न भागों से, 3 मिलीग्राम एक हस्तांतरण पिपेट या autopipettor का उपयोग कर प्रत्येक - तो एक 2 के 3 नमूने एकत्र, संस्कृति अच्छी तरह से मिश्रित है कि यह सुनिश्चित करें: सीवी में रोटीफर्स नमूना। एक ट्यूब में इन नमूनों गठबंधन या सुविधाजनक आकार (उदाहरण के लिए, 10 एमएल) की शीशी।
    3. स्थानांतरण 1 - एक पेट्री डिश पर संयुक्त नमूना के 2 मिलीलीटर यह एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत देखे जा सकते हैं। संस्कृति की गुणवत्ता की जांच (के व्यवहार तैराकीरोटीफर्स, अलग अंडे की उपस्थिति, दूषित प्रोटोजोआ)।
    4. नमूने के लिए 50% Lugols आयोडीन समाधान के 100 μl जोड़कर शेष संयुक्त नमूने में रोटीफर्स स्थिर करना। सेकंड के भीतर Lugols के बाद इसके अलावा, तैराकी रोकने के लिए रोटीफर्स निरीक्षण करते हैं। अब, आसानी से रोटीफर्स गिनती।
      नोट: इथेनॉल, पतला ब्लीच, या सिरका Lugols के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है। सिरका (2 बूँदें / 10 एमएल) के होने का लाभ है गैर खतरनाक है, और रोटीफर्स अनुबंध नहीं बना सकते ब्लीच और आयोडीन समाधान के रूप में भंडारण में ताकत खोने, तो सिलिया के प्रभामंडल और "पैर" बढ़ाया रहते हैं और नहीं जानवरों और अधिक प्राकृतिक देखो।
    5. फिर जल्दी से एक प्लास्टिक pipet में एक ~ 2 मिलीलीटर subsample ले, (स्थिर रोटीफर्स तेजी से निपटा जाएगा) नमूना अच्छी तरह से मिला है कि यह सुनिश्चित करने के लिए और एक Sedgewick-मांझी की गिनती स्लाइड में 1 मिलीलीटर बांटना (20 x 50 1 मिमी) वर्ग (चित्रा 2 )। एक विदारक या यौगिक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, अक्षत रोटीफर्स और टी गिनतीइन रोटीफर्स से जुड़ी अंडे की otal संख्या (चित्रा 2)। ~ 100 रोटीफर्स गिनती करने के लिए आवश्यक के रूप में स्लाइड क्षेत्र के रूप में ज्यादा भरोसा रखो। मिलीलीटर प्रति रोटीफर्स की संख्या की गणना, और एक स्प्रेडशीट या लॉगबुक में इस रिकॉर्ड है।
    6. हार्वेस्ट ~ सीवी में रोटीफर्स की मात्रा का 30%: धीरे-धीरे सीवी के तल पर वाल्व खोलने, हवा की आपूर्ति और सोता फिल्टर निकालें और पानी एक 53 माइक्रोन जाल स्क्रीन के साथ एक प्लवक कलेक्टर में प्रवाह करने की अनुमति देते हैं। एक बाल्टी या नाली में छानने के बाद कलेक्टर के नीचे से बाहर बहने पानी ले लीजिए। रोटीफर्स हानिकारक से बचने के लिए उदार प्रवाह करने के लिए एक सज्जन का प्रयोग करें। रोटीफर्स स्क्रीन पर सुखाने के लिए अनुमति न दें।
    7. स्थिरता कारणों से, यह रोटीफर्स का एक मानक संख्या हर दिन के साथ एफ सी वी स्थापित करने की सलाह दी जाती है। इसलिए जाना जाता है, सीवी rotifer घनत्व और फसल मात्रा के आधार पर, एक सुसंगत अंतिम घनत्व हासिल करने के लिए एफ सी वी कुल मात्रा समायोजित (जैसे।, 1500 रोटीफर्स / एमएल)। काटा रोटी जोड़ेंएफ सी वी को फर्स: (- 15 ग्राम / एल 10) धीरे साफ नमक पानी से भरे एक धोने बोतल का उपयोग कर संग्रह स्क्रीन से रोटीफर्स हस्तांतरण। एफ सी वी पर स्क्रीन पलटना और नमक के पानी की एक सौम्य धारा के साथ एफ सी वी में रोटीफर्स धो लें। एफ सी वी करने के लिए (~ प्रति दिन दस लाख रोटीफर्स प्रति 1.57 एमएल) चारा देने के लिए पीएमटी की शुरुआत करें।
    8. एक साफ, मुलायम नायलॉन ब्रश या साफ़ पैड के साथ सीवी की पूरी अंदर रगडें।
    9. पानी की मात्रा फसल के लिए खो दिया है बदलने के लिए एक 5 गैलन बाल्टी में स्वच्छ आरओ के पानी की एक मापा राशि के लिए नमक का उचित मात्रा में जोड़ने से 15 ग्राम / एल पानी का एक नया मिश्रण बनाओ। बाल्टी में पानी के लिए नमक जोड़ें और यह पूरी तरह से भंग कर दिया गया है जब तक सख्ती से हलचल है, और फिर सीवी में जोड़ें।
    10. एक सिंक में एक उच्च दबाव स्प्रे का प्रयोग, यह मलबे से मुक्त है, जब तक सोता फिल्टर कुल्ला, और फिर CV के लिए यह वापसी।
    11. रोटीफर्स / एमएल के दैनिक गिनती के अनुसार, प्रत्येक खुराक घटना की अवधि को बदलकर सीवी लिए दिया शैवाल की फीड दरों को समायोजित करें।वितरित होने के लिए चारा की उचित मात्रा निर्धारित करने के लिए ऊपर, कदम 1.3.8 में प्रदान की गणना का प्रयोग करें।
    12. लगभग 24 घंटे बाद, इस प्रक्रिया को दोहराने। ऊपर वर्णित (- 1.4.10 1.4.2 कदम) के रूप में एक ही तरीके से (पिछले दिन के लिए जरूरत नहीं थे कि) एफ सी वी में शेष रोटीफर्स कटाई से शुरू करो। ताजा, साफ dechlorinated पानी (5 ग्राम / एल नमक) के 2 एल में उन्हें ध्यान लगाओ। ये एक बैकअप आपूर्ति के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है, या इस प्रोटोकॉल में वर्णित है परे, मछली के बाद के चरणों को खिलाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
      नोट: इस प्रोटोकॉल 2 अप करने के लिए परमिट - सीवी में रोटीफर्स गंभीर परिणामों के बिना फसल की चूक बर्दाश्त कर सकते हैं, क्योंकि (सामान्य स्वचालित खिला के साथ) कम हो संस्कृति रखरखाव के 3 दिन।

2. Polyculture

  1. सेट अप
    1. धीरे बाँझ वित्तीय संस्थाओं के साथ rinsing तो एक चाय-झरनी के माध्यम से पैदा की भ्रूण डालने के लिये और से एक स्पॉन घटना से zebrafish भ्रूण लीजिएज पानी (या उचित रूप से वातानुकूलित समाधान के किसी भी अन्य गैर दूषित स्रोत, जैसे, भ्रूण मध्यम, E3, आदि) पेट्री डिश में एक धोने की बोतल से।
    2. 5 दिनों के लिए पकवान प्रति 50 भ्रूण - 40 के घनत्व पर पेट्री डिश में 28 डिग्री सेल्सियस - 25 में भ्रूण सेते हैं।
    3. 5 दिन बाद निषेचन, या जब रची लार्वा के 90% से अधिक सक्रिय रूप से पानी कॉलम में ऊपर तैर रहे हैं पर polyculture चरण शुरू।
  2. टीका
    1. सीधे 3.5 एल नर्सरी की टंकी के लिए एफ सी वी से rotifer संस्कृति की 500 मिलीलीटर जोड़ें; rotifer संस्कृति पानी के शामिल किए जाने polyculture दौरान रोटीफर्स के पोषण सामग्री का कहना है कि काई चारा प्रदान करता है।
    2. धीरे नर्सरी टैंक में एक पेट्री डिश से लार्वा डालना। कोई लार्वा डिश में रहते हैं कि सुनिश्चित करें।
    3. 1 एल के अंतिम मात्रा और एक अंतिम रों तक पहुंचने के लिए टैंक के लिए एक recirculating प्रणाली या समर्पित पानी के स्रोत से स्वच्छ, वातानुकूलित मछली पानी की 500 मिलीलीटर जोड़ें5 ग्राम / एल की alinity।
      नोट: इस लवणता zebrafish लार्वा अस्तित्व नकारात्मक लवणता नकारात्मक असर पड़ा हो जाएगा> 7 जी / एल और rotifer अस्तित्व है, तो प्रभावित हो जाएगा, क्योंकि महत्वपूर्ण है लवणता <2 जी / एल यदि।
  3. Polyculture चरण
    नोट: polyculture चरण (दिनों 5-9 बाद निषेचन के लिए इसी 5 दिनों की कुल) के लिए 4 दिनों के बाद टीका के लिए पिछले चाहिए।
    1. रोटीफर्स और मछली वर्तमान और बढ़ रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए इस अवधि के दौरान कम से कम एक बार प्रति दिन polyculture टैंक का निरीक्षण करें। रोटीफर्स पानी कॉलम भर में दिखाई दे रहे हैं कि सुनिश्चित करें। Fishs रोटीफर्स के बीच में तैरना, पानी स्तंभ के भीतर भी दिखाई दे रहे हैं कि सुनिश्चित करें।
    2. टैंक के माध्यम से सामान्य जल प्रवाह शुरू। एक स्क्रीन की जगह या टैंक से बाहर प्लावित नहीं कर रहे हैं कि लार्वा सुनिश्चित करने के लिए नाली पोर्ट पर भ्रमित।
      नोट: इस चरण के अंत में, मछली ऐसे Artemia के रूप में बड़ा शिकार आइटम उपभोग करने के लिए इतना बड़ा होना होगा125 माइक्रोन - 75 के आकार की सीमा में nauplii या प्रसंस्कृत फ़ीड आइटम।
      नोट: एक प्रतिनिधि polyculture टैंक के भीतर rotifer जनसंख्या गतिशीलता कदम 1.4.2 में वर्णित के रूप में एक ही तरीके से टैंक से रोटीफर्स गिनती / नमूना द्वारा मापा गया - 1.4.5। यह पूरा हो गया था जब तक यह polyculture चरण की शुरुआत से प्रति दिन एक बार किया गया था।

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Representative Results

यहाँ वर्णित निरंतर rotifer संस्कृति प्रणाली गतिशील है, और दैनिक भोजन और फसल दरों में बदलाव कर रहे हैं, तो rotifer संख्या समय के साथ एक छोटे हद तक उतार चढ़ाव के लिए यह सामान्य बात है। बोस्टन बच्चों के अस्पताल में जलीय कृषि सुविधाओं में सक्रिय संस्कृतियों में से एक में रोटीफर्स की आबादी, ऊपर वर्णित तरीके से बनाए रखा, 30 दिनों (चित्रा 3) के लिए नजर रखी थी। इस अवधि के दौरान मतलब संस्कृति घनत्व 1,330 रोटीफर्स / एमएल की एक अधिकतम और 510 रोटीफर्स / मिलीलीटर की एक न्यूनतम के साथ 932 रोटीफर्स / एमएल था। यह इस प्रोटोकॉल के अनुसार बनाए रखा एक rotifer संस्कृति की विशिष्ट प्रदर्शन का प्रतिनिधित्व करता है।

zebrafish के साथ एक polyculture टैंक में rotifer आबादी की गतिशीलता 4 चित्र में दिखाया गया है। एक 3.5 एल मछली टैंक एफ सी वी से rotifer संस्कृति की 500 मिलीलीटर, निष्फल च के 500 मिलीलीटर के साथ inoculated किया गया थाish पानी, और 40 5 दिन पुराने जंगली प्रकार (Tubingen तनाव) लार्वा, रोटीफर्स और zebrafish एक ठेठ polyculture टैंक में कैसा प्रदर्शन प्रदर्शित करने के लिए। polyculture टैंक में rotifer जनसंख्या 747 रोटीफर्स / एमएल (चित्रा 4) के घनत्व के साथ दूसरे दिन पहुंच गया। polyculture टैंक में रोटीफर्स का घनत्व हालांकि दिन 5 पर 481 रोटीफर्स / मिलीलीटर की एक न्यूनतम करने के लिए 5 दिन polyculture अवधि में कमी आई है, पूरी अवधि के दौरान मतलब rotifer घनत्व 589.4 रोटीफर्स / एमएल, और 481 का न्यूनतम मूल्य था रोटीफर्स / एमएल ~ पहले प्रकाशित काम 12 में polyculture अवधि के अंत में rotifer घनत्व का 10 गुना है।

पांच दिन की अवधि के दौरान zebrafish विकास चित्रा 5 में दिखाया गया है। मछली 0.063 ± SEM के 3.904 मिमी की एक मतलब कुल लंबाई से, प्रत्येक दिन लगातार वृद्धि से पता चला है कि वे 5.423 ± 0.063 SEM का एक मतलब कुल लंबाई को polyculture टैंक के लिए जोड़ा गया था जब परpolyculture चरण के अंतिम दिन है। जीवन रक्षा 95% (38/40) था।

पानी की गुणवत्ता के मानकों प्रतिनिधि polyculture टैंक में दैनिक मापा गया, और तालिका 1 में दिखाया जाता है। इन मानकों के मूल्यों को पहले प्रकाशित काम 12 के समान हैं, और रोटीफर्स और मछली दोनों के विकास और अस्तित्व के लिए अनुकूल हैं कि शर्तों का प्रतिनिधित्व polyculture की 5 दिन की अवधि के दौरान।

दिन दिन खारापन टैन सं 2 सं 3 पीएच क्षारीयता कठोरता तापमान
(वास्तविक) (पोस्ट-फर्टिलाइजेशन) जी / एल मिलीग्राम / एल मिलीग्राम / एल मिलीग्राम / एल मिलीग्राम / एल (CaCO 3) मिलीग्राम / एल (CaCO 3) डिग्री सेल्सियस </ टीडी>
सोमवार 5 5 2 0 0 8.4 120 425 23.2
मंगलवार 6 5 3 0 0 8.4 180 425 23.3
बुधवार 7 5 3 0 0 8.3 240 425 22.3
गुरूवार 8 6 3 0 0 8.4 240 425 22.8
शुक्रवार 9 7 3 0 0 7.9 240 425 22.2

तालिका 1. पानी की गुणवत्ता के मानकों मैंना प्रतिनिधि Zebrafish Polyculture टैंक।

आकृति 1
चित्रा 1. Rotifer संस्कृति सेटअप लीजेंड:। संस्कृति पोत (सीवी), Feedout संस्कृति पोत (एफ सी वी), हवा की आपूर्ति (एएस), सोता कण फ़िल्टर (FPF), शैवाल फ़ीड मिश्रण (AFM), जलाशय (एफआर), प्रोग्रामयोग्य पैमाइश फ़ीड टाइमर (पीएमटी)। ठोस लाइनों शैवाल चारा वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। धराशायी लाइनों हवा वितरण प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा एक Sedgewick-मांझी गिनती स्लाइड की 2. भरने। एक को देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का बड़ा संस्करण।

चित्र तीन
। चित्रा एक 30 दिन की अवधि में संस्कृति में 3. Rotifer जनसंख्या गतिशीलता लीजेंड: मिलीलीटर प्रति गिना रोटीफर्स (महिलाओं + अंडे) की संख्या एक्स अक्ष पर है। संस्कृति में दिनों की संख्या Y अक्ष पर है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
। एक 5 दिन Polyculture लीजेंड दौरान चित्रा 4. Rotifer जनसंख्या गतिशीलता: मिलीलीटर प्रति गिना रोटीफर्स (महिलाओं + अंडे) की संख्या एक्स अक्ष पर है। polyculture में दिनों की संख्या Y अक्ष पर है। vi के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण ईडब्ल्यू।

चित्रा 5
। एक 5 दिन Polyculture दौरान चित्रा 5. Zebrafish ग्रोथ लीजेंड: मान मिमी में मतलब कुल लंबाई हैं; त्रुटि सलाखों मतलब (SEM) के मानक त्रुटि प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एक ही टैंक में रोटीफर्स के साथ zebrafish लार्वा पहले खिला मछली खिलाने के लिए एक सतत rotifer संस्कृति प्रणाली की स्थापना और रखरखाव, और संवर्धन: जल्दी लार्वा zebrafish के भोजन के लिए rotifer polyculture विधि के सफल क्रियान्वयन प्रभावी दो कार्यों के लिए प्रोटोकॉल की आवश्यकता है।

पहले लॉरेंस और सह लेखक 14 से वर्णित zebrafish प्रयोगशालाओं के लिए एक सतत खारे पानी rotifer उत्पादन प्रणाली के लिए सेटअप संशोधित और आवेदन में यह दोनों और अधिक मजबूत और सार्वभौमिक बनाने के तरीकों की एक संख्या में वृद्धि की गई है। नए प्रोटोकॉल उपकरण और कार्यप्रणाली में सुधार दोनों को शामिल किया गया।

शैवाल फ़ीड मिश्रण के लिए भंडारण की व्यवस्था अब कैटफ़िश उत्पादन प्रणालियों 15 में इस्तेमाल किया जार सेने कार्यरत हैं। यह विभक्त हो या पेड़ों का झुरमुट और रोकना करने के लिए नेतृत्व नहीं करता है, ताकि इन दौर तली जार में फीड की भंडारण शैवाल फ़ीड की पूरी तरह से मिश्रण की सुविधावितरण लाइनों के Ging, अक्सर मूल प्रोटोकॉल त्रस्त है, जो एक समस्या है। इसी तरह, एक में सब-एक प्रोग्राम टाइमर / पैमाइश पंप का उपयोग घटकों की कुल संख्या कम कर देता है, और रोटीफर्स के लिए चारा की मीटर के जरिए वितरण सरल करता है। यह भी चारा और अधिक कुशलता से ग्रहण कर लेता है, क्योंकि कम, बड़ा feedings के लिए बेहतर है, जो 24 घंटे की अवधि में एक घंटे के आधार पर रोटीफर्स के लिए चारा की खुराक परमिट।

Rotifer संस्कृति के लिए चारा वितरण के ठीक ट्यूनिंग है कि परमिट रोटीफर्स गणना के लिए एक विधि इस प्रोटोकॉल में शामिल किया गया है। उनकी जनसंख्या के आकार का एक सटीक, वास्तविक समय आकलन के आधार पर रोटीफर्स दूध पिलाने स्थिर, उच्च स्तर के उत्पादन सुनिश्चित करता है। एक माध्यमिक Feedout संस्कृति पोत भी प्रोटोकॉल के लिए जोड़ा गया है। एक सतत संस्कृति प्रणाली के कारण नर्सरी गतिविधि में बदलाव करने के लिए, यहां तक ​​कि एक बड़ी नर्सरी संचालन के लिए आवश्यक है परे दसियों रोटीफर्स के लाखों लोगों के लिए एक दैनिक अतिरिक्त उत्पादन हो सकता है। इस Feedout घनlture पोत polycultures के दैनिक टीका के लिए रोटीफर्स धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और शेष रोटीफर्स मछली के बाद के लार्वा और जल्दी किशोर चरणों के लिए एक उच्च गुणवत्ता वाले पोषक पूरक के रूप में खिलाया जा सकता है। स्थानांतरित कर जब वे जोरदार तैराकी गतिविधि को बनाए रखने इतना है कि एफ सी वी में कम लवणता (10 जी / एल) भी, polyculture टैंक में शर्तों के रोटीफर्स पूर्व acclimates।

महत्वपूर्ण बात है, rotifer संवर्धन प्रोटोकॉल नेतृत्व करने के लिए इन परिवर्तनों को विशेष रूप से श्रम इनपुट के संबंध में, polyculture दृष्टिकोण में सुधार करने के लिए प्रत्यक्ष। इस अवधि के 333 रोटीफर्स पर नुकीला के दौरान सर्वश्रेष्ठ है और इसमें शामिल सह लेखक न केवल एक दिन में 5 से रोटीफर्स की प्रारंभिक टीका, लेकिन यह भी स्थिर polyculture चरण दिन 9 12 को समाप्त हो गया जब तक रोटीफर्स के दैनिक परिवर्धन द्वारा प्रकाशित पिछले विधि। rotifer घनत्व मतलब / टीकाकरण के दिन मिलीग्राम और दिन 9 12 पर polyculture चरण की समाप्ति पर 50 से नीचे रोटीफर्स / एमएल समाप्त हो गया। इसके विपरीत, वर्तमान प्रोटोकॉल आमतौर पर ~ 665 रोटीफर्स / मिलीलीटर से शुरू, और दिन 9 पर 481 ~ साथ रोटीफर्स / एमएल समाप्त होने के दौरान बहुत अधिक घनत्व को बनाए रखता है।

इन बहुत अधिक rotifer घनत्व को सक्रिय करने के दो कारण हैं। 1) टीका के लिए इस्तेमाल किया rotifer संस्कृति के समग्र मजबूती में कहीं अधिक है। इसके अलावा, बराबर 10 ग्राम / एल लवणता में शैवाल / रोटीफर्स की मात्रा और ~ 0 जी / एल लवणता मछली पानी, 5 ग्राम / polyculture भर में बनाए रखा है कि एल के एक मध्यवर्ती लवणता में परिणाम के साथ polyculture inoculating के संशोधित कदम है। पानी का अधिक से अधिक कुल मात्रा के साथ शुरू (1L) भी polyculture टैंक में rotifer विकास और अस्तित्व के लिए अधिक अनुकूल है। पहले प्रकाशित विधि में, एक छोटी मात्रा में कम शुरुआती rotifer घनत्व मछली के लार्वा के विकास के द्वारा और खपत (संभवतः की वजह से गरीब पानी की गुणवत्ता के लिए) उदासीनता से घाटे की भरपाई करने के रोटीफर्स के दैनिक जोड़ जरूरी हो। प्रोटोकॉल dramat करने के लिए इन समायोजन के परिणामically (पिछले विधि के साथ 4 दिनों में 4 feedings की तुलना में 4 दिनों में एक खिला) श्रम आदानों कम। प्रारंभिक 5 दिन polyculture अवधि में लार्वा विकास और अस्तित्व के प्रदर्शन पहले से 12 प्रकाशित करने के लिए तुलनीय है।

rotifer संस्कृतियों की उत्पादकता जरूरी फ़ीड इनपुट द्वारा सीमित है। 2,000 के Rotifer घनत्व - 3000 / एमएल बस चारा वितरण में वृद्धि से इन तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है। चारा की प्रति यूनिट rotifer उपज जाना जाता है, चारा दर का अनुमान आवश्यकताओं के rotifer उत्पादन मैच के लिए समायोजित किया जा सकता है। सप्ताहांत और छुट्टियों के दौरान, खिला कम किया जा सकता है और उनके उत्पादक क्षमता के सामान्य दैनिक भोजन तक उपअनुकूलित हो सकता है और दिनचर्या को फिर फसल होगी, हालांकि रोटीफर्स नुकसान पहुँचाने के बिना एक या दो दिन के लिए छोड़े गए फसल।

सामान्य से अधिक रोटीफर्स के लिए एक अप्रत्याशित जरूरत नहीं है, जब आबादी का एक बड़ा हिस्सा संस्कृति को नुकसान पहुँचाने के बिना काटा जा सकता हैसंरचना है, लेकिन फसल के आकार पर निर्भर करता है संस्कृति अपने सामान्य घनत्व ठीक करने के लिए एक दिन या अधिक आवश्यकता हो सकती है। Rotifer मांग एक या दो दिन से अधिक के लिए कम हो जाएगा, तो उत्पादन सबसे अच्छा चारा वितरण को कम करने के बजाय, फसल कम से कम हो जाता है। कम से कम 25% / दिन की एक फसल दर polyculture टैंक में उनके प्रदर्शन में सुधार, रोटीफर्स अधिक सशक्त और उपजाऊ कर रहे हैं ताकि एक छोटी rotifer उम्र प्रोफ़ाइल रखता है।

इस प्रोटोकॉल आसानी से छोटे zebrafish सुविधाओं के लिए छोटे पैमाने के लिए अनुकूल है। उदाहरण के लिए, आसानी से प्रति दिन दो बार हाथ से खिलाने के साथ एक मानक 5 अमेरिकी गैलन (20 एल) बाल्टी में स्थापित किया जा सकता है, जो एक 15 एल संस्कृति, आसानी से 1,000 रोटीफर्स / एमएल के एक घनत्व हासिल कर सकते हैं। एक फ़ीड पंप का उपयोग 2,000-3,000 / एमएल के घनत्व में सक्षम बनाता है। 30 polycultures - एक ही बाल्टी इसलिए 10 शुरू करने के लिए पर्याप्त 5-15 मिलियन रोटीफर्स / दिन, प्रदान कर सकते हैं / दिन 30% पर काटा। वर्णित के रूप में दो बाल्टी ही सीवी + एफ सी वी प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता हैBove। एक शैवाल + अमोनिया नियंत्रक + पीएच बफर पूर्व मिश्रण फ़ीड (विशिष्ट अभिकर्मकों / उपकरण की तालिका देखें) छोटे पैमाने पर अनुप्रयोगों के लिए सुविधाजनक है कि उपलब्ध है। यह शैवाल कोशिकाओं को जल्दी बाहर समझौता नहीं है और इसलिए यह चारा जलाशय में सतत मिश्रण की आवश्यकता नहीं है कि पर्याप्त चिपचिपापन है।

Rotifer संस्कृति उत्पादकता में गिरावट आती है, या मृत रोटीफर्स का एक असामान्य संचय संस्कृति में पाया जाता है, तो सभी पानी की गुणवत्ता के मानकों (तापमान, लवणता, पीएच, राष्ट्रीय राजमार्ग 3 एकाग्रता) वे पक्षियों के बच्चे जब तक Brachionus plicatilis सामान्य रूप से अपने अंडे किया जाता है। जाँच की जाना चाहिए, और संस्कृति में (आमतौर पर पक्षियों के बच्चे नहीं है) कई स्वाधीन अंडे की उपस्थिति संचित अमोनिया के कारण सबसे अधिक बार तनाव की निशानी है।

Rotifer संस्कृति पानी सामान्य से अधिक तीव्र हरी है, तो या तो चारा दर बहुत अधिक है या रोटीफर्स उनके सामान्य दर पर भोजन सेवन नहीं कर रहे हैं। आम तौर पर इस CA हैएक तनाव कारक, या संस्कृति या तो द्वारा इस्तेमाल के लिए कम कर जनसंख्या के अनुसार चारा दर समायोजन के बिना overharvested कर दिया गया है। घने संस्कृतियों में यह काई पिगमेंट रोटीफर्स द्वारा metabolized हैं के रूप में एक भूरे रंग के पानी में जमा करने के लिए सामान्य है।

पहले खिला चरण के दौरान खारे पानी रोटीफर्स का उपयोग व्यापक रूप से विधि पहले 2010 12 में प्रकाशित किया गया था के बाद से zebrafish अनुसंधान समुदाय भर में अपनाया गया है। इस प्रोटोकॉल में रेखांकित कर रहे हैं कि polyculture पालन विधि में किए गए संशोधनों की एक भी अधिक से अधिक संख्या की अनुमति होगी प्रयोगशालाओं की परवाह किए बिना बड़े पैमाने की, इस दृष्टिकोण अपनाने के लिए। इन अग्रिमों समय पर कर रहे हैं; जीन पीटा प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में विकास (जैसे।, CRISPR, TALENS, आदि) विज्ञान के विभिन्न क्षेत्रों में उपयोग के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित मछली के नए प्रकारों के हजारों विकसित करने के लिए सुव्यवस्थित और कुशल पालन प्रोटोकॉल की आवश्यकता होगी zebrafish के लिए।

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Disclosures

चुनाव आयोग हेनरी रीड Mariculture, इंक, मत्स्य पालन और मछली hobbyist के बाजारों में रोटीफर्स, शैवाल केंद्रित है, और अन्य सामग्री प्रदान करता है कि एक कंपनी द्वारा नियोजित है।

Acknowledgments

देखभाल और इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रतिनिधि परिणामों के लिए उत्पन्न मछली का उपयोग बोस्टन बच्चों के अस्पताल, प्रोटोकॉल # 14-05-2673R संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों के साथ पूर्ण अनुसार प्रदर्शन किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rotifer Culture Infrastructure
100 L Culture Vessel Aquaneering Custom Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve
5 Gallon Culture Bucket Kit Reed Mariculture CCS Starter Kit Small volume culture vessel for small facilities
Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” Pentair Aquatic Ecosystems 16025 Rigid clear tubing for air delivery
Mesh tube Pentair Aquatic Ecosystems RT444X Mesh tube support for floss filter
Rotifer Floss Reed Mariculture Rotifer floss 12” x 42” Particulate waste trap
Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD Grainger 38M003  Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) Coral Vue SKU: IC-LQD-DSR Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Silicone Tubing  Cole Parmer Tubing for algae delivery to rotifer vessel
Rigid Clear Tubing " O.D.,36” Pentair Aquatic Ecosystems 16025 Rigid clear tubing for air delivery to algae paste
Rigid Clear Tubing O.D., 36” Pentair Aquatic Ecosystems 16025 Rigid clear tubing for algae delivery
Rotifers
Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L Reed Mariculture Type L 5 million Rotifer stock culture for system startup
Rotifer Feed
Sodium hydroxymethylsulfonate Reed Mariculture ClorAm-X® 1lb tub Ammonia reducer for algae feed mix
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S25533B pH buffer for algae feed mix
Microalgae concentrate Reed Mariculture Rotigrow Plus® 1 liter bag Nutritionally optimized rotifer feed
RG Complete Reed Mariculture RG Complete 6 oz bottle All in one microalgae based feed for small scale cultures
Water Preparation
 Reef Crystals Reef Salt That Fish Place 198210 Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). 
Refractometer Pentair Aquatic Ecosystems SR6 measuring salinity
Rotifer Culture Equipment
Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns Pentair Aquatic Ecosystems BBPC20 Mesh screen for collecting rotifers
Scrub Pads Pentair Aquatic Ecosystems SCR-58 Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels
Scrub Brush
Bucket Grainger Supply  43Y530 Graduated bucket for mixing culture water
Hatching Jar Pentair Aquatic Ecosystems J30 Storage of algae feed mix
Lugol’s Solution, Dilute Fisher Scientific S99481 Agent used to immobilize live rotifers for counting
Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid  Pentair Aquatic Eco-Systems M415 Counting rotifers
Miscelleneous
Tea Strainer Kitchenworks 971972 Used for collecting zebrafish embryos after spawning

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References

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विकास जीव विज्ञान पहला मुद्दा 107 zebrafish rotifer polyculture खिला larviculture
पालन ​​पहली खिलाने zebrafish के लिए पूर्ण और अद्यतन &quot;Rotifer Polyculture विधि&quot;
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Lawrence, C., Best, J., Cockington,… More

Lawrence, C., Best, J., Cockington, J., Henry, E. C., Hurley, S., James, A., Lapointe, C., Maloney, K., Sanders, E. The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish. J. Vis. Exp. (107), e53629, doi:10.3791/53629 (2016).

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