Introduction
5 -ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）は、発生遺伝学、毒物学、行動、水産養殖、再生生物学、多くのヒトの疾患1のモデル化を含むがこれらに限定されない科学分野の増加、で利用卓越した実験動物です。種は実験室で維持することは比較的容易であるが、彼 らの文化6に関連する管理上の課題がいくつかあります。これらの中で最も顕著なのは魚が第一ガス膀胱インフレ7以降のフィードを開始する場合は特に、幼虫の飼育です。成長の5日7特に重要である-通常の、制御された条件の下では、この発達イベントには、次の3で、受精後（DPF）〜5日後に発生します。フィード項目は、diges適切なサイズでなければなりません - この段階で中心的な技術的な難しさは十分に第1の給電幼虫の栄養要求を満たすためにあります培養タンクに過度の廃棄物を作成せずに、ほぼ連続的に魅力的、および使用可能なtible、。歴史的にこのルーチン水交換8,9とともに、タンクで魚に餌の多数の少量を提供することで、一般的に達成されました。これらの方法はある程度成功しているが、それらは、非効率的で高い労働投入を必要とし、唯一の変数と成長と生存10の制限されたレートを返します。
自然界では、ゼブラフィッシュの幼虫は、おそらく水柱11に豊富に小さな動物プランクトンの存在を餌に。このため、このようなゾウリムシ 、ワムシ、およびアルテミアなどのライブフィードを組み込むlarvicultureプロトコルは、通常、7最も効率的です。 2010年、最もよく、共著者は、外因性の摂食12の最初の5日間塩水ワムシと一緒に静的な、汽水水に幼虫のゼブラフィッシュを成長させることが可能であることを実証しました。このアプローチは、どのハーネスエスワムシ培養の自然な高生産性が低い労働投入12,13と幼虫の成長および生存の収率が非常に高い料金、水を汚染することなく、十分な、栄養価の高い獲物を提供します。近年では、世界中の研究室の数は増加し、このプロトコルのバリエーションを採用しており、その多くが今保育園のシステム14をサポートするために、連続的にワムシを培養しています。
過去数年にわたり、ワムシ/ゼブラフィッシュpolycultureとワムシ生産の両方のための方法は、洗練され、より標準化されたと容易に拡張可能になるように改善されました。この記事では、1のためのステップバイステップの手順）は、連続かつ堅牢なワムシの生産と2）外因性の給餌の最初の5日間魚の力強い成長をサポートするために使用ワムシ/ゼブラフィッシュpolycultureシステムの確立を提供します。
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Protocol
1.ワムシ文化
- 100 L培養容器を用いて培養システムの基本コンポーネント
- ワムシ培養のセットアップのためのすべてのコンポーネントを収集します。ワムシ培養セットアップはワムシを成長させるために培養容器（CV）で構成されています。送り出しのワムシ（送り出し培養容器、FCV）を維持するために、同様の容器。藻類の供給混合物（AFM）を格納するための丸底孵化瓶（貯水池、FRフィード）。 CV、FCVおよびFRを通気するための空気供給（AS）; CVとFCVに藻フィードの配信を制御するために、測光タイマー（PMT）と蠕動ポンプ。 CVの内側に座って、フロス粒子フィルタ（FPF）。
注 ：サプライ品およびコンポーネントの完全なリストは、 物質一覧に記載されています。
- ワムシ培養のセットアップのためのすべてのコンポーネントを収集します。ワムシ培養セットアップはワムシを成長させるために培養容器（CV）で構成されています。送り出しのワムシ（送り出し培養容器、FCV）を維持するために、同様の容器。藻類の供給混合物（AFM）を格納するための丸底孵化瓶（貯水池、FRフィード）。 CV、FCVおよびFRを通気するための空気供給（AS）; CVとFCVに藻フィードの配信を制御するために、測光タイマー（PMT）と蠕動ポンプ。 CVの内側に座って、フロス粒子フィルタ（FPF）。
- コンフィギュレーション
- 文化が簡単に収集続きに嵌合ドレインを経て収穫することができるように、スタンドまたはテーブルの上にCVとFCVを昇格ainer（ 図1）。各培養容器内の剛性チューブの長さにASを接続するための柔軟な空気供給チューブを使用してください。チューブは、CVやFCVの底に空気を提供するのに十分な長さであることを確認してください。
- AFMが含まれているFRの下まで延びて、剛性チューブの長さにASを接続するために小容量のエアラインを使用してください。空気の流れを調整するために、各エアラインにバルブを取り付けます。飼料供給チューブとのPMTにFRを接続し、上部付近に、CV / FCVの側面に開けた穴に、PMTからチューブを実行します。 図1。
- 起動
- 逆浸透水（RO）で使用可能な容量の90％に培養容器を埋めます。 ROが使用できない場合は、きれいな、脱塩素水道水を使用します。しかし、バイオセキュリティのリスク評価には、潜在的に病原性生物が源水に存在しないことを確実にするために実行する必要があります。注：このような分析を行うことができますいずれかの資格を水試験所によって。
- 15グラム/ Lの塩分濃度に達するように水槽塩と培養容器の水を用量。それは「ローリング沸騰」を維持するように容器内に空気の流れを設定し、それは完全に通気することによって溶解されるまで、ゆっくりと培養容器に一定量の塩を加えます。それは完全に酸素化であることを確実にするために> 1時間水に空気を混入続けます。
- 藻類の供給混合物を作ります。クリーンの3リットルに、新鮮な（0 ppm）で水を脱塩素アンモニア中和剤（ナトリウムhydroxymethylsulfonate）のNaHCO 3および100グラムの100グラムを追加します。この最後の試薬は、培養器材の消毒から水道水や漂白剤残留物から残留塩素を中和するという付加的な利点を提供します。これは、これらの化合物が完全に溶解されることを保証することが重要です。そして、藻類の濃縮物（バイオマス乾燥重量〜15％）の1 Lを追加します。 4℃でFRおよびストアへの供給混合物を追加します。
- 千万 - 5のスターター培養物を追加します。
- PMTの電源をオンにし、ワムシ培養容器内に藻フィードをポンピング開始。 〜藻類供給混合物の1.6ミリリットル、1日あたり、培養中に百万ワムシごとに配信されるように、PMTのタイマー機能を使用すると、藻類の供給混合物の送達速度を設定します。 24時間の期間にわたって定期的に少量ずつ授乳を配布。授乳より頻繁に、より良いです。
- 手動で設定された期間（ 例えば、1分）のためにPMTをオンにしてポンプの吐出流量を校正し、メスシリンダーやビーカーにこのインターバルの間にポンプ藻類を収集します。例えば、PMTの用量藻類5mlの1分であれば、線量率は次のようになります5 mlの藻類/分。
- 1.6ミリリットルによって、何百万人で、現在のワムシの数を乗じて、必要な毎日の供給速度を計算します。例えば、億ワムシの人口サイズのワムシ培養の1日あたりの供給の〜160ミリリットル（100×1.6 ml）を必要とするであろう。
- 24時間の期間を通して一定の間隔で合計一日の供給要件を投薬するPMTを設定します。例えば、の送達は、160 mlの総毎日の送り量は、部分に5 mlの4分間/分の投薬ポンプ速度とPMTのセットを使用して、24時間の期間にわたって一回3時間、毎日8回（5を送達することができml /分×4分= 20ミリリットル×8授乳= 160ミリリットル）。
- 収穫前に、72時間 - それは必要な人口を生成するまでの文化は一般的に48のために、成長できるようにします。 24時間で、最大始動後培養容器にフロス粒子フィルタを追加して、通常の保守を開始します。
- メンテナンス
注：文化は継続的に動作し、routinが必要です理想的には、次の順序で、毎日同じ時刻に行われるべきである電子整備。- クリーンで利用可能な容量の90％にFCVを記入し、10グラム/ Lの水族館塩を投与された、新鮮な水を脱塩素。水が十分に混合すること、及び塩の全てが完全に溶解していることを確認してください。それは「ローリングボイル」を維持するように容器内に空気の流れを設定します。屈折計で塩分を測定し、塩分濃度が10g / Lであることを確認してください。この目標を達成するために、それを超えない重要なことです。
- 文化の異なる部分から、3ミリリットルホールピペットやautopipettorを使用して、各 - その後、2の3つのサンプルを収集し、文化が十分に混合されていることを確認します。CVにおけるワムシのサンプル。これらのサンプルは、便利なサイズ（ 例えば、10 ml）をチューブまたはバイアルに結合します。
- それは、解剖顕微鏡下で可視化することができるように、ペトリ皿に合わせたサンプルを2ml - トランスファー1。文化の品質をチェックします（の振る舞いを泳ぎますワムシ、切り離された卵の存在、汚染原虫）。
- 50％Lugols試料にヨウ素溶液100μlを加えることによって、残りの混合試料中のワムシを固定します。秒以内にLugolsを添加した後、水泳を停止するにはワムシを観察します。さて、簡単にワムシを数えます。
注：エタノール、希釈漂白剤、または酢はLugolsの代わりに使用することができます。酢（2滴/ 10 ml）をあることの利点を有している非危険、およびワムシの契約をすることはできません漂白剤とヨウ素溶液などの記憶装置に強度を失うので、繊毛のコロナと「足」は、拡張のままではなく、動物がより自然に見えます。 - その後すぐにプラスチック製のピペットで〜2ミリリットルのサブサンプルを取り、（固定化されたワムシは急速に沈降する）、サンプルが十分に混合されていることを確認し、Sedgewick-ラフターカウントスライドに1ミリリットルを分配（20×50 1 mmの正方形）（ 図2 ）。解剖や化合物の顕微鏡を使用して、無傷のワムシをカウントし、トンこれらのワムシ（図2）に接続されている卵のotal数。 〜100ワムシをカウントするために、必要に応じてスライド領域の多くを数えます。 1ml当たりのワムシの数を計算して、スプレッドシートやログブックでこれを記録します。
- CVにおけるワムシの量の収穫は〜30％：、空気供給およびフロスフィルターを取り外し、ゆっくりとCVの下部にあるバルブを開け、水が53ミクロンメッシュスクリーンでプランクトンのコレクタに流入することを可能にします。バケツやドレインにフィルタリングした後、集電体の底から流れ出る水を収集します。ワムシの損傷を防ぐために、適度な流れに優しいを使用してください。ワムシは、画面上で乾燥させないでください。
- 一貫性の理由から、毎日ワムシの標準数のFCVを確立することが望ましいです。したがって、既知のCVのワムシ密度と収穫量に基づいて、一貫性の最終密度を達成するために、FCVの総音量を調整（ 例えば 、1500ワムシ/ mlで）。収穫ロティを追加FCVへFERSは：（ - 15グラム/ Lの10）静かにきれいな海水で満たされた洗浄ボトルを使用して、コレクション画面からワムシを転送します。 FCVの上に画面を反転し、食塩水の穏やかな流れでFCVにワムシを洗います。 FCVへの供給（一日あたり百万ワムシ当たり〜1.57ミリリットル）を提供するためのPMTを開始します。
- きれいな、柔らかいナイロンブラシやスクラブパッドでCVの内部全体をスクラブ。
- 水の量を置き換えるために5ガロンのバケツにきれいなRO水の測定量に塩の適切な量を添加することにより、15グラム/ Lの水の新しいミックスを作る収穫する失いました。バケツの水に塩を加え、完全に溶解するまで激しく攪拌した後、CVに追加します。
- シンクに高圧スプレーを使用して、それは破片がなくなるまでフロスフィルターを洗浄した後、CVにそれを返します。
- ワムシ/ mlの毎日の数に応じて、各投与イベントの持続時間を変更することにより、CVに送達藻類の供給量を調整します。配信される飼料の適切な量を決定するために、上記のステップ1.3.8で提供さの計算を使用してください。
- 約24時間後、プロセスを繰り返します。上記の（ - 1.4.10 1.4.2ステップ）と同様に（前日に不要であった）、FCVに残っているワムシを収穫することにより開始します。新鮮な、きれいな脱塩素水（5グラム/ Lの塩）の2リットルでそれらを濃縮します。これらは、バックアップ電源として4℃で保存するか、このプロトコルに記載されるものを超えて、魚の後の段階を供給するために使用することができます。
注：このプロトコルは、2まで許可 - CVにおけるワムシが深刻な結果なしで収穫の省略を許容することができるので、（通常の自動給紙に）減少培養維持の3日間。
2. Polyculture
- セットアップ
- ティーストレーナーを通して生成された胚を注ぎ、その後静かに滅菌FISですすぐことにより産卵イベントからゼブラフィッシュの胚を収集時間、水（または適切に調整され、溶液の他の非汚染源、 例えば、胚培地、E3など）ペトリ皿に洗浄瓶から。
- 5日間皿当たり50胚 - 40の密度でペトリ皿中で28℃ - 25で胚を培養します。
- 5日後に受精、または孵化した幼虫の90％以上が積極的に水柱の中に泳いでいるのpolycultureフェーズを開始します。
- 接種
- 3.5 L保育園タンクにFCVから直接ワムシ培養液500ミリリットルを追加します。ワムシ培養水を含めることはpolyculture中ワムシの栄養成分を維持藻類フィードを提供します。
- ゆっくり保育園タンクに1ペトリ皿から幼虫を注ぎます。何の幼虫が皿に残っていないことを確認してください。
- 1 Lの最終体積と最終秒に到達するためにタンクに再循環システムまたは専用の水源からのクリーンな、コンディショニング魚水500mlを加えます5 G / Lのalinity。
注：塩分は塩分<2グラム/ Lの場合> 7グラム/ Lとワムシの生存率はマイナスの影響を受けるの場合はゼブラフィッシュの幼虫の生存率がマイナスの影響を受けるため、この塩分濃度は非常に重要です。
- Polyculture段階
注：polyculture段階は（日5-9受精後に対応し、5日間の合計）までの4日後の接種に続くべきです。- ワムシや魚が存在し、成長していることを確認するために、この期間中に少なくとも1日1回あたりpolycultureタンクを確認します。ワムシは水柱全体に表示されていることを確認してください。 fishsはワムシの中で泳いで、水柱の中にも表示されていることを確認してください。
- タンクを介して通常の水の流れを開始します。スクリーンを配置したり、タンクからフラッシュされない幼虫を確保するための排水口の上にバッフル。
注：この段階の終わりに、魚は、 アルテミアのようなより大きな獲物のアイテムを消費するのに十分な大きさになります125ミクロン - 75のサイズ範囲のノープリウスまたは処理フィード項目。
注：代表polycultureタンク内のワムシ個体群動態はステップ1.4.2で説明したのと同じ方法で、タンクからワムシをカウント/サンプリングによって測定した - 1.4.5。それが完了するまでこれがpolycultureフェーズの開始から一日一回行われました。
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Representative Results
ここに記載の連続ワムシの培養システムは動的であり、そして毎日の給餌、収穫率のばらつきがある場合ワムシ数が経時小さい程度に変動することは正常です。ボストン小児病院での養殖施設での積極的な文化の一つでワムシの人口は、上記のように維持し、30日（ 図3）をモニターしました。この期間中の平均培養密度は1330ワムシ/ mlの最大値及び510ワムシ/ mlの最小値と、932ワムシ/ mLでした。これは、このプロトコルに従って維持ワムシの培養物の典型的な性能を示しています。
ゼブラフィッシュとpolycultureタンク内のワムシの人口動態は、 図4に示されている。3.5 Lの水槽は、FCVのワムシの培養物500mlを、滅菌Fの500mlを接種しましたISH水、および40 5日齢の野生型（テュービンゲン株）の幼虫は、ワムシとゼブラフィッシュは、典型的なpolycultureタンクに行う方法を示します。 polycultureタンク内のワムシの人口は747ワムシ/ mlの（ 図4）の密度を有する第2日目にピークに達しました。 polycultureタンク内のワムシの密度はしかし、全期間を通じて平均ワムシ密度は589.4ワムシ/ mlであり、481の最小値だった5日目に481ワムシ/ mlの最小値に5日間のpolycultureにわたって減少しましたワムシ/ mlの以前に発行されたワーク 12でpolyculture期間の終了時にワムシ密度の約10倍です。
5日間の期間中のゼブラフィッシュの成長を図5に示します。魚は、それらが5.423±0.063 SEMの平均全長にpolycultureタンクに追加された0.063±SEMの3.904ミリメートルの平均全長から、毎日堅調に推移しましたにpolyculture段階の最終日。生存率は95％（38/40）でした。
水質パラメータが代表polycultureタンクで毎日測定し、 表1に示す 。これらのパラメータの値は、以前に公開されたワーク 12と同様であり、ワムシおよび魚の両方の増殖および生存を助長している状態を表しますpolycultureの5日間の期間中。
| 日 | 日 | 塩分 | TAN | NO 2 | NO 3 | pH値 | アルカリ度 | 硬度 | 温度 |
| （実績） | （受精後） | G / L | mg / Lで | mg / Lで | mg / Lで | mg / Lで（のCaCO 3） | mg / Lで（のCaCO 3） | 摂氏°</ TD> | |
| 月曜日 | 5 | 5 | 2 | 0 | 0 | 8.4 | 120 | 425 | 23.2 |
| 火曜日 | 6 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 180 | 425 | 23.3 |
| 水曜日 | 7 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.3 | 240 | 425 | 22.3 |
| 木曜日 | 8 | 6 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 240 | 425 | 22.8 |
| 金曜日 | 9 | 7 | 3 | 0 | 0 | 7.9 | 240 | 425 | 22.2 |
表1 水質パラメータのIナ代表ゼブラフィッシュPolycultureタンク。
図1.ワムシ培養セットアップ凡例：培養容器（CV）、送り出し培養容器（FCV）、エア・サプライ（AS）、フロス粒子フィルタ（FPF）、藻類の供給混合物（AFM）は、貯水池（FR）、プログラマブルメーターフィードタイマ（PMT）。実線は藻フィードの配信を表します。破線は、空気の配信を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Sedgewick-ラフターカウントスライドの 図2 充填。 ご覧になるにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。
。図30日間にわたって培養3.ワムシ個体群動態凡例：1ml当たりカウントワムシ（メス+卵）の数が、x軸上にあります。文化の日数は、y軸上にある。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
5日間のPolyculture伝説の間に、図4ワムシ個体群動態 ：1ml当たりカウントワムシ（メス+卵）の数が、x軸上にあります。 polycultureの日数は、y軸上にある。viにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版をEW。
5日間のPolyculture中の図5.ゼブラフィッシュの成長凡例：値はmm単位の平均全長であり、。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
魚を養うために、連続ワムシ培養系の確立と維持、及び同タンク内のワムシと一緒に最初に送りゼブラフィッシュの幼虫を培養：早期幼虫のゼブラフィッシュを供給するためのワムシpolyculture方法の実装を成功させるには、二つのタスクのための有効なプロトコルが必要です。
最初のローレンスおよび共著者14で説明したゼブラフィッシュの研究室用の連続塩水ワムシ生産システムのセットアップが変更されたアプリケーション内では、それは両方のより堅牢でユニバーサルにするために、いくつかの方法で強化されました。新しいプロトコルは、機器と方法論の両方で改善が組み込まれています。
藻類の供給混合物のためのストレージシステムはナマズ製造システム15で使用されるハッチングジャーを用います。それは階層化または凝集し、目詰まりを生じないように、これらの丸底瓶で飼料の保存は藻類原料の完全な混合を促進します配送ラインのエージング、頻繁に元のプロトコルを悩ませ問題。同様に、オールインワンプログラマブルタイマ/計量ポンプの使用は、部品の総数を削減し、ワムシへの供給の計量配信を簡素化します。また、フィードがより効率的に同化されているので、より少ない、より大きな栄養に好適である24時間の期間にわたって時間単位でワムシへの供給の投与が可能になります。
ワムシ文化へのフィード配信の微調整を可能にワムシをカウントする方法は、このプロトコルに含まれています。その集団サイズの正確なリアルタイムの評価に基づいて、ワムシを供給する安定した高レベルの生産を保証します。二送り出し培養容器は、プロトコルに追加されました。連続培養システムは、数十保育園の活動の変動による大きくても保育園の操作に必要なものを超えたワムシ、数百万人の毎日の過剰を生成することができます。この送り出したCulture容器をpolycultures毎日接種のためのワムシを保持するために使用され、残りのワムシは後幼虫及び魚の早期の幼若段階に高品質の栄養補助食品として供給することができます。転送時に、彼らは活発な水泳活性を維持するように、FCVで減少塩分（10グラム/ L）を、また、polycultureタンク内の条件にワムシを事前acclimates。
重要なことは、ワムシの培養プロトコルへのこれらの変更は、特に労働投入に関しては、polycultureアプローチの改善を指示するために導きます。ベストと静的polyculture相は9日目12日に終了したまで5日目ワムシの最初の接種だけでなく、ワムシの毎日の追加だけでなく、関連する共著者によって発行された前の方法。この期間中にワムシ密度を平均333ワムシ/でピークに達しました接種当日ml及び9日目12にpolycultureフェーズの終了時に50ワムシ/ mlの下に終了しました。これとは対照的に、現在のプロトコルは、通常は〜665ワムシ/ mlで開始し、9日目〜481ワムシ/ mlの終了、全体ではるかに高い密度を維持します。
これらの非常に高いワムシ密度を可能にする2つの要因があります。 1）接種に使用ワムシ培養物の全体的な堅牢性がはるかに大きいです。さらに、10グラム/ Lの塩分と〜0グラム/ Lの塩分魚の水、polycultureを通して維持さ5グラム/ Lの中間塩分における結果で藻類/ワムシの等容量でpolycultureを接種する改訂ステップ。水の大きい総容量（1L）で開始することもpolycultureタンク内のワムシの成長と生存に、より助長しています。以前に発表された方法では、より少ない容量でより低い開始ワムシ密度は稚魚を開発することによって、消費（おそらく悪い水質に）摩滅により損失を補充するワムシの毎日の追加を必要としました。プロトコルdramatにこれらの調整の結果的には（従来の方法との4日間で4栄養に比べて4日間の1送り）を労働投入を減らします。最初の5日間のpolyculture期間にわたり幼虫の成長と生存のパフォーマンスは、以前公開された12に匹敵します。
ワムシ培養の生産性は必ずしもフィード入力によって制限されます。 2000のワムシ濃度 - 3000 / mlのは、単にフィード配信を増加させることによって、これらの方法を用いて達成することができます。飼料の単位ワムシ収率が知られている場合、供給速度は、投影されたニーズにワムシ生産と一致するように調整することができます。彼らの潜在生産力が通常の日常供給および収穫ルーチンが再開されるまで、最適以下になりますが、ワムシを損なうことなく、週末や休暇中に、給紙を削減することができ、収穫は一日か二日のために省略。
いつもよりワムシのため、予期しない必要がある場合には、人口の大部分は、CULを損なうことなく採取することができますチャーは、しかし、収穫の大きさに応じて、文化は、その通常の密度を回復するために、1日以上が必要な場合があります。ワムシの需要は一日か二日以上のために低減される場合は、生産が最高のフィードの配信を減らすのではなく、収穫を減少させることによって低減されます。ワムシがより活発と多産になるように、少なくとも25％/日の収穫率はpolycultureタンク内の彼らのパフォーマンスを向上させる、若いワムシの年齢プロファイルを維持します。
このプロトコルは、簡単に小さいゼブラフィッシュ施設のより小さなスケールに適合されています。例えば、便利に手送り1日2回で、標準的な5米ガロン（20リットル）バケツに設定することができる15のL文化は、容易に千ワムシ/ mlの密度を達成することができます。供給ポンプの使用は、2000〜3000 / mlの密度を可能にします。 30 polycultures - /日30％で回収し、単一のバケットは、したがって、10を起動するのに十分5から15000000ワムシ/日を提供することができます。説明したように2つのバケットは同じCV + FCVプロトコルで使用することができBOVE。藻類+アンモニアコントローラ+ pH緩衝剤プレミックスフィードは小規模なアプリケーションのために便利である（ 具体的な試薬/機器の表を参照）が利用可能です。これは、藻類細胞はすぐに沈殿しないので、それは、供給タンク内の連続的な混合を必要としないことを十分な粘度を有します。
ワムシの培養の生産性が低下し、または死ワムシの異常な蓄積は、培養物中に検出された場合、すべての水質パラメータ（温度、塩分濃度は、pHは、NH 3濃度）は、孵化するまでシオミズツボワムシは、通常、その卵を運ぶ。チェックし、しなければなりません文化の中で（通常は孵化しない）多く付着していない卵の存在は、ほとんどの場合、蓄積されたアンモニアに起因するストレスの兆候です。
ワムシの培養水が通常よりも強い緑色である場合、いずれかの供給速度が高すぎるか、ワムシは通常の速度で食品を消費していません。通常、これはCAです応力因子のいずれかで使用される、または培養物が減少人口に従って送り速度を調整することなくoverharvestedされています。高密度の文化では、藻類の顔料はワムシによって代謝されるように水に蓄積する褐色のは正常です。
この方法は、最初に2010年12に掲載されたので、第1の給電フェーズ中に海水ワムシの使用が広くゼブラフィッシュの研究コミュニティ全体で採用されている。このプロトコルで概説されているpolyculture飼育方法に加えられた変更は、さらに多くを可能にします実験室規模に関係なく、このアプローチを採用します。これらの進歩は、タイムリーです。遺伝子ノックアウト技術の開発（ 例えば 、CRISPR、TALENsなど）科学の様々な分野での使用のために遺伝的に改変された魚の新しい株の数千人を成長させることが合理的で効率的な飼育プロトコルが必要になりますゼブラフィッシュのため。
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Disclosures
ECヘンリーはリード養殖社、養殖や魚の愛好家の市場にワムシ、藻類の濃縮物、およびその他の消耗品を提供する企業で採用されています。
Acknowledgments
このプロトコールに記載の代表的な結果を得るために生成魚のケアと使用はボストン小児病院、プロトコル番号の14-05-2673Rで機関動物実験委員会によって定められたガイドラインに完全に従って行きました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 L Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| RG Complete | Reed Mariculture | RG Complete 6 oz bottle | All in one microalgae based feed for small scale cultures |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
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