从混合三维培养使用近红外Photoimmunotherapy技术选择性细胞消除

Introduction

消除特定细胞而不损害其他细胞是非常困难的，特别是在建立组织，并且存在用于在组织工程领域中的细胞消除方法的迫切需要。现今在再生医学领域中，使用胚胎干细胞（ES），多能干细胞（的PSCs），或诱导的多能干细胞（IPS）的组织培养物是有前途的材料^{1 - 3。}

虽然这个组织再生是有前途的，具有不需要的细胞污染是一个大问题。此外，有移植^4,5-之后致瘤性的安全问题。虽然许多研究都集中在这些问题上，以消除特定细胞，尤其是在再生医学^{6 - 8，}没有实际的方法已被开发出来。

近红外photoimmunotherapy（NIR-PIT）是一种基于抗体 - 光吸收剂conjugat的处理E（APC）。一个APC由细胞特异性单克隆抗体（mAb）和光吸收剂，IR700的。 IR700是亲水性二氧化硅的酞菁衍生物和本身并不⁹诱发光毒性。 IR700是通过赖氨酸分子的侧链酰胺残基共价结合到抗体上。 APC的结合细胞膜上的靶分子，然后诱导暴露于NIR光在690纳米的近后立即细胞坏死。在暴露于近红外光，细胞膜破裂，导致细胞死亡^{9 - 14。} NIR-PIT已被证明是具有多个抗体或抗体片段，其中包括抗EGFR，抗HER2，抗PSMA，抗CD25，抗间皮素，抗GPC3，和抗CEA ¹⁵有效^{- 21。}因此，近红外PIT可对多种靶分子使用。此外，近红外PIT是良好控制的治疗，通过限制近红外二极管灯允许特定区域的选择性治疗ŧ照射^18,22。

这里，我们目前采用NIR-PIT从混合3D文化特异性细胞清除的方法。

Protocol

注意：以下协议描述必要的步骤来消除使用NIR-PIT特定细胞。控制和有关NIR-PIT和细胞活力等细节可以在其他地方¹⁸中找到。

1.共轭IR700，以单克隆抗体（MAB）

1. 在2-5毫克/毫升的0.1M _的 Na ₂ HPO _4（pH为8.6）的溶液制备的兴趣的mAb。
2. 混合mAb的6.8纳摩尔用10mM IR700 30.8纳摩尔在0.1M _的 Na ₂ HPO ₄在微量离心管中液（pH 8.6），并在室温孵育1小时，用铝箔覆盖。
3. 用15ml的PBS洗涤PD-10柱（参见材料/设备的数据表），两次。从步骤1.2装载样品。
4. 根据制造商的说明通过PBS洗脱纯化经由PD-10柱的混合物。
   注：在这里，洗脱沿IR700的带颜色。对于300微升样品，PBS洗脱分数毫升〜4.4毫升通常为2.5之间。
5. 确定蛋白质浓度用考马斯染色，通过测量在595nm处的吸收用分光光度计^9。确定IR700与吸收的浓度在689纳米到确认缀合每种mAb分子⁹荧光团分子的数目。
   注意：确定在1单抗IR700分子的最佳偶联次数用分光光度计是很重要的。通常，在1单抗分子约3 IR700分子是最适用于在体外和体内的工作。 HPLC和SDS-PAGE方法可以用于确认单抗和IR700是否可能会或没有。
6. 测定蛋白质浓度后储存于4℃。

2.准备混合3D细胞培养（混合球体）

1. 应用无菌水（约1ml）中成悬滴板的板储部分。
2. 制备的细胞类型的利益的各种比例 - A431-LUC-GFP细胞和3T3-RFP细胞 -用含有5,000个细胞总数，悬浮于50μl培养基的每一个样品。
   注意：根据细胞类型的培养基中的细胞类型的兴趣的比率100 等 ：准备1：100，10：100; 25：100，50。
3. 在37℃和5％二氧化碳孵育在96孔悬滴板5-7天的混合物在加湿培养箱中。改变培养基，每2天。注：为了使3D球体准确，轻拿轻放盘，如含有细胞滴形成3D形状之前，容易脱落。
4. 40X放大率 - 使用倒置亮视野显微镜在10倍观察球体的形态和尺寸。注意：尽管这取决于细胞类型和悬滴的大小，确保该球体的直径后，在96孵育7天后的孔悬滴板周围400-600微米。

3. 在体外 NIR-PIT混合3D细胞培养

1. 更改HA媒体nging滴板，以10微克/毫升抗体 - 光吸收剂结合物（APC）含有介质，并且在37℃和5％二氧化碳的潮湿培养箱孵育6小时。
2. 后6小时温育后，用新鲜的培养基（无酚红）洗球体的两倍。轻轻球体用100微升新鲜无酚红培养基用无菌200微升枪头，转移到玻璃底50毫米菜尖切断。放在每道菜1球体。
3. 观察球体用倒置明显微镜检测形态的变化。观察光学记者（如 GFP和RFP）使用具有以下过滤器设置荧光显微镜：GFP - 469 nm激发过滤器和525 nm发射滤波器; RFP - 559 nm的激发滤光片和630nm的发射滤光器。
4. 放置照射玻璃底培养皿上方的发光二极管（LED）。
   注：球体​​可以接触到近红外光无论是在显微镜或在层流罩。
   1. 测量近红外光的功率密度与光功率计^9。根据该测定，通过发光二极管（LED），其在在2J / cm ²的670至710纳米的波长的发射光照射近红外光。
      注：LED灯可以穿透大约5英寸最大深度。不管功率密度和曝光²³的持续时间的近红外PIT的细胞毒性作用是只依赖于给定的能量。
5. 照射后，转移球体到一个新的悬滴板用50μl新鲜培养基，并在37℃和5％二氧化碳的潮湿培养箱孵育1天。
6. 轻轻球体用100微升使用带切断尖端无菌200微升枪头，新鲜培养基（无酚红）的转移到玻璃底菜。观察与NIR-PIT使用网络连接后，荧光显微镜1天球体在步骤3.3说明过滤器设置。
   1. 通过，或通过使用荧光显微镜（ 图^{2B）14,18,22}细胞质的GFP荧光的损失以2微克/毫升的最终浓度加入碘化丙啶至媒体检测死细胞。
7. 如果靶细胞没有完全消除重复步骤3.1-3.6。

Representative Results

以光学监控NIR-PIT中，A431细胞系，其过表达EGFR的效果，被遗传修饰以也表达GFP和荧光素酶（A431-LUC-GFP）。作为近红外PIT的一个非目标，所述的Balb / 3T3细胞系的光学修饰以表达RFP（3T3-RFP）。 APC的，帕尼单抗-IR700（泛IR700），合成。混合球状体，其中分别组成细胞（A431-LUC-GFP和3T3-RFP）的各种比例的是按照此协议（ 图1）制成。反复NIR-PIT与泛IR700（参见图2A方案）的孵化执行。从这种混合三维培养靶细胞消除达到与荧光和荧光素酶的活动（ 图2B，C）进行监测。另一方面，非靶细胞持续增长。

16修改。 请点击此处查看本图的放大版本。

在三维细胞球体图2.靶细胞消除（A431-LUC-GFP和3T3-RFP细胞混合球体）。（A）的近红外-PIT（2J / cm ^2）的方案中示出。 （B）的重复NIR-PIT完全消除，没有损害非靶细胞（3T3-RFP）靶细胞（A431-LUC-GFP）中的混合三维球体。栏= 200微米。荧光素酶的活动（C）定量（RLU比）靶细胞（每组10球体）的证明完全消除。这个数字已经从¹⁸修改。数据表示为平均值±SEM 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

我们证明特定细胞消除从混合三维细胞培养物的方法，而不使用近红外-PIT损害对非靶细胞。到目前为止，存在一旦组织被建立或细胞消除无实际方法移植后。因此，NIR-PIT是实现这个很有前途的方法。这种技术也可在体内 ^18,22利用，因为的APCs显示出类似的药代动力学为单克隆抗体本身。靶细胞类型可适于与各种的APC。各种抗体或抗体片段，其中包括抗EGFR，抗PSMA，抗间皮素和抗CEA已经用作的APC ^{15 - 21。}此外，改变NIR照射的区域可以最小化处理的区域。这里，以萤光素酶活性的定量和荧光对靶细胞，特定的细胞完全消除了确认。

NIR-PIT是一种基于光治疗，因而临界点为t他的近红外光源和目标之间的距离，由于光能量并根据一平方反比定律（步骤3.4），因此细胞坏死减少。使三维球体确切地说，板应处理并轻轻孵育越好。含滴细胞很容易被破坏，或形成3D形状面前有点惊世骇俗脱落。

NIR-PIT有一些独特的优势。首先，NIR-PIT的APCs展示出相似静脉内药代动力学给父母的非共轭的抗体，由于IR700的亲水性，导致高度特异性结合到靶细胞和最小非目标累积。因此，即使在组织移植后，NIR-PIT可通过在APC随后感兴趣近红外区域的曝光的静脉注射治疗的靶细胞。第二，近红外光可以穿透更深入组织比紫外线或可见光，因此，近红外PIT可以治疗不仅表面而且ENTI再通过暴露于NIR表面处的移植组织的厚度。最后，近红外PIT可反复使用，以消除靶细胞而没有限制。当靶细胞在细胞表面表达¹⁸靶分子足够的副本，此方法非常有用。

不过，也有这种技术有一些限制。首先，在APC的渗透性被限制，因为它是一个大的分子。为了克服这个问题，反复NIR-PIT治疗或抗体片段可以利用^18,19,22。另一个限制是光线穿透。虽然近红外光可正确地穿透体外培养，翻译到体内治疗需要适于的方法，如消化内镜，支气管镜，或直接胸腔镜与光导纤维移动光源更靠近目标区域。

NIR-PIT的进一步修改将允许在本地和规范使用这种方法的IFIC细胞消灭在许多领域，如免疫调节或肿瘤微环境中^{24 - 26。}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye	LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)	929-70011
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)	S9763
Sephadex G25 column (PD-10)	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay	Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)	PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates	3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)	HDP1096-8
Optical power meter	Thorlabs (Newton, NJ, USA)	PM100
LED: L690-66-60	Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)	L690-66-60
Vectibix (panitumumab)	Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm	Cellvis (Mountain View, CA, USA)	D35-10-0-N