Introduction
Eliminando cellule specifiche senza danneggiare altre cellule è estremamente difficile, soprattutto nel tessuto stabilita, e vi è una necessità urgente di un metodo di eliminazione di cella nel campo dell'ingegneria dei tessuti. Al giorno d'oggi nel campo della medicina rigenerativa, colture di tessuti utilizzando cellule staminali embrionali (ES), le cellule staminali pluripotenti (PSC), o cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) sono materiali promettenti 1-3.
Anche se questa rigenerazione dei tessuti è promettente, la contaminazione con cellule indesiderate è una preoccupazione importante. Inoltre, vi è un problema di sicurezza di tumorigenicità dopo trapianto 4,5. Anche se molti studi si sono concentrati su questi temi per eliminare cellule specifiche, in particolare nel campo della medicina rigenerativa 6-8, nessun metodo pratico è stato sviluppato.
Vicino photoimmunotherapy infrarosso (NIR-PIT) è un trattamento a base di un anticorpo conjugat-photoabsorbere (APC). Un APC è costituito da un anticorpo specifico per cellule monoclonali (mAb) e un photoabsorber, IR700. IR700 è un derivato del idrofila di silice-ftalocianina e non induce di per sé fototossicità 9. IR700 è covalentemente coniugato all'anticorpo tramite residui ammidici sulla catena laterale di molecole di lisina. L'APC si lega molecole bersaglio sulla membrana cellulare e quindi induce necrosi cellulare quasi immediatamente dopo l'esposizione alla luce NIR a 690 nm. Durante l'esposizione a NIR luce, la rottura della membrana cellulare che portano alla morte batteria 9 - 14 anni. NIR-PIT ha dimostrato di essere efficace con più anticorpi o frammenti di anticorpi, tra cui anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mesotelina, anti-GPC3, e anti-CEA 15 - 21. Pertanto, NIR-PIT può essere utilizzato contro un'ampia varietà di molecole bersaglio. Inoltre, NIR-PIT è un trattamento ben controllato, che consente il trattamento selettivo di specifiche regioni, limitando la NIR-light irradiazione 18,22.
Qui, vi presentiamo un metodo di eliminazione cella specifica utilizzando NIR-PIT da culture 3D miste.
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Protocol
Nota: Il protocollo seguente descrive i passi necessari per eliminare le cellule specifici utilizzando NIR-PIT. Controlli e altri dettagli sulla NIR-PIT e vitalità cellulare può essere trovato altrove 18.
1. Coniugazione del IR700 di anticorpi monoclonali (mAb)
- Preparare mAb di interesse a 2-5 mg / ml in (8.6 pH) soluzione 0,1 M Na 2 HPO 4.
- Mescolare 6.8 nmol di mAb con 30,8 nmol di 10 mm IR700 in 0,1 M Na 2 HPO 4 soluzione (pH 8.6) in una provetta e incubare a temperatura ambiente per 1 ora, coperto con un foglio di alluminio.
- Lavare la colonna PD-10 (vedi tabella dei materiali / attrezzature) con 15 ml di PBS, due volte. Caricare il campione dal punto 1.2.
- Purificare la miscela tramite la colonna PD-10 da PBS eluizione secondo le istruzioni del produttore.
Nota: Qui, l'eluizione era lungo la banda di colore di IR700. Per un campione di 300 ml, frazione di eluizione PBS è in genere tra 2,5 ml a 4,4 ml. - Determina ilconcentrazione di proteine con Coomassie colorazione misurando l'assorbimento a 595 nm con uno spettrofotometro 9. Determinare la concentrazione di IR700 con assorbimento a 689 nm per confermare il numero di molecole di fluoroforo coniugati ad ogni molecola mAb 9.
Nota: È importante determinare un numero coniugazione ottimale di molecole IR700 in 1 mAb con uno spettrofotometro. Generalmente, circa 3 molecole IR700 in 1 mAb molecola è ottimale sia in vitro che in vivo lavoro. metodi HPLC e SDS-pagina può essere utilizzata per confermare se il mAb e IR700 sono vincolati o meno. - Conservare a 4 ° C dopo la determinazione della concentrazione proteica.
2. Preparazione di misto coltura cellulare 3D (misto Spheroid)
- Applicare acqua sterile (circa 1 ml) nella sezione serbatoio piatto di appendere targhe goccia.
- Preparare i vari rapporti dei tipi di cellule d'interesse - cellule A431-luc-GFP e cellule 3T3-RFP -con ogni campione contenente 5.000 cellule totali, sospese in 50 ml di terreni di coltura.
Nota: Preparare 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, ecc rapporti di cellule tipi di interesse in terreni di coltura a seconda del tipo cellulare. - Incubare la miscela per 5-7 giorni nel 96 ben appeso piastra goccia in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di anidride carbonica. Modificare i terreni di coltura ogni 2 giorni. Nota: Per rendere il 3D sferoide precisamente, gestire delicatamente la piastra, come gocce che contengono le cellule si staccano facilmente prima di formare forme 3D.
- Osservare la morfologia e le dimensioni degli sferoidi utilizzando un microscopio campo chiaro invertito a 10X - 40X ingrandimento. Nota: Anche se dipende tipi di cellule e la dimensione di appendere-drop, garantire che il diametro dello sferoide è di circa 400-600 micron dopo 7 giorni di incubazione a 96 ben appesi piastra goccia.
3. In Vitro NIR-PIT per Mixed colture cellulari 3D
- Modificare i media del ettaringing piastre goccia a 10 ug / ml anticorpo coniugato photoabsorber (APC) supporti contenenti, ed incubare per 6 ore in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di anidride carbonica.
- Dopo 6 ore di incubazione, lavare la sferoide due volte con terreni di coltura fresco (rosso fenolo libero). trasferire delicatamente il sferoide ad un piatto fondo di vetro da 50 mm con 100 ml di fenolo fresco rosso terreni di coltura gratuitamente utilizzando una sterile 200 ml punta della pipetta con la punta tagliata. Mettere una sferoide in ogni piatto.
- Osservare il sferoide con un microscopio invertito campo chiaro per rilevare la variazione della morfologia. Per osservare i giornalisti ottici (ad esempio, GFP e RFP) usa microscopio a fluorescenza con le seguenti impostazioni di filtro: GFP - filtro di eccitazione 469 nm e 525 nm filtro per le emissioni; RFP - 559 nm filtro di eccitazione e 630 nm filtro per le emissioni.
- Posizionare il diodo ad emissione luminosa (LED) sopra il piatto di vetro con il fondo per l'irradiazione.
Nota: Spheroids possono essere esposti a NIRluce sia sul microscopio o nella cappa laminare.- Misurare la densità di potenza del NIR-luce con un tester di potere ottico 9. In base a questa misurazione, irradiare NIR-luce tramite diodi emettitori di luce (LED) che emettono luce a lunghezze d'onda di 670-710 nm a 2 J / cm 2.
Nota: la luce del LED può penetrare la profondità massima di circa 5 pollici. Effetti citotossici di NIR-PIT dipende solo dato energia a prescindere dalla densità di potenza e la durata dell'esposizione 23.
- Misurare la densità di potenza del NIR-luce con un tester di potere ottico 9. In base a questa misurazione, irradiare NIR-luce tramite diodi emettitori di luce (LED) che emettono luce a lunghezze d'onda di 670-710 nm a 2 J / cm 2.
- Dopo l'irraggiamento, trasferire il sferoide in una nuova piastra goccia pendente con 50 ml di terreni di coltura fresco e incubare per 1 giorno in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di anidride carbonica.
- trasferire delicatamente il sferoide ad un piatto fondo di vetro con 100 ml di terreni di coltura fresco (rosso fenolo libero) utilizzando una sterile 200 ml punta della pipetta con la punta tagliata. Osservare il sferoide con un microscopio a fluorescenza 1 giorno dopo NIR-PIT utilizzando fiimpostazioni ltro descritto al punto 3.3.
- Rilevare cellule morte aggiungendo propidio ioduro ai media ad una concentrazione finale di 2 mg / ml, o perdita di citoplasmatica GFP-fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza (Figura 2B) 14,18,22.
- Ripetere i passaggi 3,1-3,6 se le cellule bersaglio non sono completamente eliminati.
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Representative Results
Per monitorare otticamente l'effetto di NIR-PIT, la linea cellulare A431, che overexpresses EGFR, è stato geneticamente modificato per esprimere anche GFP e luciferasi (A431-luc-GFP). Come un non-bersaglio di NIR-PIT, la linea di cellule Balb / 3T3 è stato otticamente modificato per esprimere RFP (3T3-RFP). L'APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), è stato sintetizzato. Sferoidi misti, che sono stati composti da vari rapporti di cellule (A431-luc-GFP e 3T3-RFP) sono stati realizzati in base a questo protocollo (Figura 1). Ripetute NIR-PIT è stata effettuata con l'incubazione di pan-IR700 (vedi schema in figura 2A). Eliminazione delle cellule bersaglio da questa cultura 3D mista è stata ottenuta e controllata mediante fluorescenza e luciferasi attività (Figura 2B, C). D'altro canto, le cellule non bersaglio continuato a crescere.
Figura 2. eliminazione di destinazione delle cellule in sferoidi di cellule 3D (sferoidi misti di cellule A431-luc-GFP e 3T3-RFP). (A) NIR-PIT (2 J / cm 2) regime è mostrato. (B) ripetuta NIR-PIT completamente eliminato cellule bersaglio (A431-luc-GFP) con nessun danno alle cellule non bersaglio (3T3-RFP), in uno sferoide 3D mista. Bar = 200 micron. (C) Quantificazione delle attività luciferasi (rapporto RLU)dimostrato completa eliminazione delle cellule bersaglio (n = 10 sferoidi in ciascun gruppo). Questa cifra è stata modificata da 18. I dati sono espressi come media ± sem prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo dimostrato un metodo di eliminazione delle cellule specifiche da una coltura cellulare 3D mista senza danneggiare le cellule non bersaglio utilizzando NIR-PIT. Finora, non esiste un metodo pratico di eliminazione delle cellule volta che il tessuto è stabilita o dopo il trapianto. Così, NIR-PIT è un metodo promettente per raggiungere questo obiettivo. Questa tecnica può anche essere utilizzato in vivo 18,22, poiché APC mostrano una farmacocinetica simile a mAb stessa. Il tipo di cellula bersaglio può essere adattato con vari APC. Vari anticorpi o frammenti di anticorpi, tra cui anti-EGFR, anti-PSMA, anti-mesothelin, e anti-CEA sono stati già utilizzati come APC 15-21. Inoltre, cambiando la regione NIR-irradiazione può minimizzare la regione trattata. Qui, con quantificazione dell'attività luciferasi e fluorescenza su cellule bersaglio, è stata confermata la completa eliminazione cellule specifiche.
NIR-PIT è una terapia a base di luce, così un punto critico è tche la distanza tra la sorgente luminosa e NIR-bersaglio, poiché l'energia luminosa e quindi diminuzione necrosi cellulare secondo una legge dell'inverso del quadrato (passo 3.4). Per rendere il 3D sferoide appunto, la piastra deve essere trattata e incubato il più delicatamente possibile. Le celle che contengono gocce sono facilmente distrutti o cadere da una piccola scossa prima di formare forme 3D.
NIR-PIT ha diversi vantaggi unici. In primo luogo, NIR-PIT APC dimostrare simili farmacocinetica per via endovenosa ad anticorpi non coniugati dei genitori, a causa delle caratteristiche idrofile di IR700, che portano a altamente specifico vincolante per colpire le cellule e l'accumulo non bersaglio minima. Così, anche dopo il trapianto del tessuto, NIR-PIT può trattare cellule bersaglio mediante iniezione endovenosa del APC seguiti da esposizione della regione di interesse per NIR. In secondo luogo, NIR-luce può penetrare molto più in profondità nel tessuto della luce visibile o UV, quindi, NIR-PIT poteva trattare non solo la superficie, ma anche la Entire spessore del tessuto trapiantato mediante esposizione a NIR in superficie. Infine, NIR-PIT può essere ripetutamente utilizzato per eliminare le cellule bersaglio senza limitazioni. Questo metodo è utile quando le cellule bersaglio esprimono copie sufficiente di molecole bersaglio sulla superficie cellulare 18.
Tuttavia, ci sono alcune limitazioni a questa tecnica. In primo luogo, la permeabilità della APC è limitato poiché è una grande molecola. Per superare questo problema, ripetuti di trattamento o di anticorpi NIR-PIT frammenti possono essere sfruttati 18,19,22. Un'altra limitazione è la penetrazione della luce. Anche se il NIR-luce può penetrare correttamente coltura in vitro, la traduzione di un trattamento in vivo richiederebbe approcci adeguati, come l'endoscopia digestiva, broncoscopia, o toracoscopia diretto con fiberoptics per spostare la sorgente di luce più vicino alla regione di destinazione.
Ulteriori adattamenti di NIR-PIT consentiranno l'uso di questo metodo in locale e speceliminazione delle cellule ific in molti campi, come l'immunomodulazione o tumore microambienti 24 - 26.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma Intramural Research del National Institutes of Health, National Cancer Institute, Centro per la Ricerca sul Cancro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | |
| Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates | 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) | HDP1096-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | |
| LED: L690-66-60 | Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA) | L690-66-60 | |
| Vectibix (panitumumab) | Amgen (Thousand Oaks, CA, USA) | ||
| 35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm | Cellvis (Mountain View, CA, USA) | D35-10-0-N |
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