Selektiv Cell Elimination fra Mixed 3D Kultur Ved hjelp av en nær-infrarødt Photoimmunotherapy Technique

Introduction

Eliminere spesifikke celler uten å skade andre celler er ekstremt vanskelig, spesielt i etablert vev, og det er et stort behov for en celle eliminasjonsmetoden i tissue engineering feltet. Dag innen regenerativ medisin, vevkulturer ved hjelp av embryonale stamceller (ES), pluripotente stamceller (pscs), eller indusert pluripotent stamcelle (IPS) er lovende materialer ^{1 - 3.}

Selv om dette vev gjenfødelse er lovende, er forurensning med uønskede celler et stort problem. Videre er det et sikkerhetshensyn av tumorgenisitet etter transplantasjon ^4,5. Selv om mange studier har fokusert på disse spørsmålene for å eliminere spesifikke celler, spesielt i regenerativ medisin ^6-8, har ingen praktisk metode blitt utviklet.

Nær infrarød photoimmunotherapy (NIR-PIT) er en behandling basert på et antistoff-photoabsorber konjugerte (APC). En APC består av en celle-spesifikt monoklonalt antistoff (mAb) og en photoabsorber, IR700. IR700 er en hydrofil silika-phthalocyanine derivat og ikke forårsaker fototoksisitet av seg selv ^9. IR700 er kovalent konjugert til antistoffet via amid-rester på sidekjeden av lysin molekyler. APC binder målmolekylene på cellemembranen og induserer deretter nesten øyeblikkelig cellenekrose etter eksponering for NIR-lys ved 690 nm. Under eksponering for NIR-lys, cellemembranen brister som fører til celledød ^9-14. NIR-PIT har vist seg å være effektiv med flere antistoffer eller antistoff-fragmenter, inkludert anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mesothelin, anti-GPC3, og anti-CEA ^{15 - 21.} Derfor kan NIR-PIT anvendes mot et bredt spekter av mål-molekyler. Videre er NIR-PIT en godt kontrollert behandling som gjør at selektiv behandling av spesifikke områder ved å begrense NIR-light bestråling ^18,22.

Her presenterer vi en metode for bestemt celle eliminering ved hjelp av NIR-PIT fra blandede 3D kulturer.

Protocol

Merk: Følgende protokollen beskriver de nødvendige skritt for å eliminere bestemte celler ved hjelp av NIR-PIT. Kontroller og andre detaljer om NIR-PIT og celleviabilitet kan finnes andre steder ^18.

1. Bøyning av IR700 til monoklonale antistoffer (mAb)

1. Forbered mAb av interesse ved 2-5 mg / ml i 0,1 M Na HPO _{2 4} (pH 8,6) oppløsning.
2. Bland 6,8 nmol av mAb med 30,8 nmol av 10 mM IR700 i 0,1 M Na HPO _{2 4-løsning} (pH 8,6) i et mikrosentrifugerør og inkuber ved romtemperatur i 1 time, dekket med aluminiumsfolie.
3. Vask PD-10 kolonne (se tabell av materiell / utstyr) med 15 ml PBS, to ganger. Last prøven fra trinn 1.2.
4. Rens blandingen via PD-10 kolonne ved PBS eluering i henhold til produsentens instruksjoner.
   Merk: Her eluering var sammen bandet fargen IR700. For en 300 mL prøve, er PBS eluering brøkdel vanligvis mellom 2,5 ml til 4,4 ml.
5. BestemProteinkonsentrasjonen med Coomassie-farging ved måling av absorpsjon ved 595 nm med et spektrofotometer ^9. Bestemme konsentrasjonen av IR700 med absorpsjon ved 689 nm for å bekrefte antall fluoroformolekyler konjugert til hver mAb molekyl ^9.
   Merk: Det er viktig å finne en optimal konjugering antall IR700 molekyler i en mAb med et spektrofotometer. Vanligvis rundt 3 IR700 molekyler i en mAb-molekylet er optimal for både in vitro og in vivo arbeide. HPLC og SDS-PAGE-fremgangsmåter kan anvendes for å bekrefte om mAb og IR700 er bundet eller ikke.
6. Oppbevar ved 4 ° C etter å bestemme proteinkonsentrasjonen.

2. Utarbeidelse av Mixed 3D Cell Culture (Blandet spheroid)

1. Anvende sterilt vann (ca. 1 ml) inn i platen reservoarseksjonen hengende dråpe platene.
2. Forbered forskjellige forhold i de celletyper severdigheter - A431-luc-GFP celler og 3T3-RFP celler -med hver prøve inneholdende 5.000 celler totalt, suspendert i 50 ul kulturmedium.
   NB: Bland 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, etc. forhold mellom celletyper av interesse i kulturmedium, avhengig av celletype.
3. Inkuber blandingen i 5-7 dager i 96 brønners plate hengende dråpe i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% karbondioksyd. Endre kulturen media hver 2 dager. Merk: For å få 3D spheroid presist, håndtere platen forsiktig, som dråper som inneholder celler faller av lett før forming 3D-figurer.
4. Observere morfologi og størrelse av kulene ved hjelp av et invertert mikroskop lysfelt ved 10X - 40X forstørrelse. Merk: Selv om den er avhengig av celletyper og størrelsen av hengende dråpe, at diameteren av den sfæroide er omkring 400-600 um etter 7 dagers inkubering i 96-brønners hengende dråpe plate.

3. In Vitro NIR-PIT for Blandet 3D Cell Culture

1. Endre media av HAnging slipp platene til 10 ug / ml antistoff-photoabsorber konjugat (APC) inneholdende media, og inkuberes i 6 timer i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% karbondioksyd.
2. Etter seks timers inkubasjon vaske spheroid to ganger med fersk kultur media (fenol rød gratis). overføre forsiktig spheroid til en glass-bunn 50 mm tallerken med 100 mL frisk fenol rød fri kultur media med en steril 200 mL pipette med spissen avskåret. Plasser en celleklump i hver tallerken.
3. Observer spheroid med en omvendt lysfelt mikroskop for å registrere endringen av morfologi. Å observere de optiske journalister (f.eks GFP og RFP) bruker fluorescens mikroskop med følgende filterinnstillingene: GFP - 469 nm eksitasjon filter, og 525 nm utslipp filter; RFP - 559 nm eksitasjon filter, og 630 nm utslipp filter.
4. Plasser light-emitting diode (LED) over glassbunn parabolen for bestråling.
   Note: Spheroids kan bli utsatt for NIRlys enten på mikroskop eller i den laminære hetten.
   1. Mål effekttetthet av NIR-lys med en optisk strømmåleren ^9. Ifølge denne målingen, strålebehandling NIR-lys via lysdioder (LED) som avgir lys på bølgelengder av 670-710 nm på to J / cm ^2.
      Merk: LED-lys kan trenge maksimal dybde på ca 5 inches. Cytotoksiske effektene av NIR-PIT er avhengig bare på gitt energi uavhengig av strømtetthet og varighet av eksponering ^23.
5. Etter bestråling overføre sfæroide inn i en ny hengende dråpe plate med 50 ul friskt kulturmedier og inkuberes i en dag i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% karbondioksyd.
6. overføre forsiktig spheroid til en glass-bunn parabolen med 100 mL av fersk kultur media (fenol rød gratis) ved hjelp av en steril 200 mL pipette med spissen avskåret. Observere spheroid med en fluorescens mikroskop en dag etter at NIR-PIT bruker filter innstillinger som er beskrevet i trinn 3,3.
   1. Detektere døde celler ved å tilsette propidium jodid til mediet til en sluttkonsentrasjon på 2 ug / ml, eller ved tap av cytoplasmisk GFP-fluorescens ved hjelp av et fluorescens mikroskop (figur 2B) ^14,18,22.
7. Gjenta trinn 3,1-3,6 hvis målcellene ikke blir fullstendig eliminert.

Representative Results

Optisk å overvåke virkningen av NIR-PIT, A431-cellelinjen, som overuttrykker EGFR, var genetisk modifisert til å uttrykke også GFP og luciferase (A431-luc-GFP). Som et ikke-target av NIR-PIT, ble Balb / 3T3-cellelinje optisk modifisert for å uttrykke RFP (3T3-RFP). APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), ble syntetisert. Blandede sfæroider, som var sammensatt av forskjellige forhold mellom celler (A431-luc-GFP og 3T3-RFP) ble fremstilt i henhold til denne protokollen (figur 1). Gjentatte NIR-PIT ble utført med inkubasjon av pan-IR700 (se regime i figur 2A). Målcellen eliminasjon fra dette blandet 3D kultur ble oppnådd og overvåket med fluorescens og luciferase aktiviteter (figur 2B, C). På den annen side, ikke-målceller fortsatte å vokse.

16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2. Target celle eliminering i 3D-celleklumper (blandet kuler av A431-luc-GFP og 3T3-RFP celler). (A) NIR-PIT (2 J / cm ²⁾ diett vises. (B) Gjentatt NIR-PIT fullstendig eliminert målceller (A431-luc-GFP) med ingen skade på ikke-målceller (3T3-RFP), i et blandet 3D spheroid. Bar = 200 mikrometer. (C) Kvantifisering av luciferase aktiviteter (RLU ratio)viste fullstendig eliminering av mål-celler (n = 10 kulene i hver gruppe). Dette tallet har blitt forandret fra ^18. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Vi viser en metode for spesifikk celle eliminering fra en blandet 3D-cellekultur uten skade på ikke-målceller ved hjelp av NIR-PIT. Så langt er det ingen praktisk metode for eliminering celle når vev er etablert, eller etter transplantasjon. Således er NIR-PIT en lovende metode for å oppnå dette. Denne teknikken kan også bli anvendt in vivo ^18,22, ettersom APCer viser lignende farmakokinetikk som mAb seg selv. Målcellen typen kan tilpasses med forskjellige APC. Forskjellige antistoffer eller antistoff-fragmenter, inkludert anti-EGFR, anti-PSMA, anti-mesothelin, og anti-CEA ble allerede anvendt som APCer ^{15 - 21.} I tillegg er endring av regionen av NIR-bestråling kan minimere region behandles. Her, med kvantifisering av luciferase-aktivitet og fluorescens på målceller, ble fullstendig eliminering av spesifikke celler bekreftet.

NIR-PIT er en lett basert terapi, og dermed et kritisk punkt er than avstand mellom den NIR-lyskilden og målet, ettersom lysenergi og derfor cellenekrose nedgang i henhold til et invers-kvadratisk (trinn 3.4). For å gjøre 3D spheroid presist, tallerkenen bør behandles og inkuberes så skånsomt som mulig. Dråpene som inneholder celler lett blir ødelagt eller faller av ved litt sjokk før forming 3D-figurer.

NIR-PIT har flere unike fordeler. Først NIR-PIT APCer demonstrere liknende intravenøse farmakokinetikken til sperre ikke-konjugerte antistoffer, på grunn av de hydrofile egenskapene til IR700, som fører til meget spesifikk binding til målceller og minimale ikke-target-akkumulering. Dermed, selv etter transplantasjon av vev, kan NIR-PIT behandle målceller via intravenøs injeksjon av APC, etterfulgt av eksponering av regionen av interesse for NIR. For det andre kan NIR-lys trenge mye dypere inn i vevet enn UV eller synlig lys, derfor NIR-PIT kunne behandle ikke bare overflaten, men også entire tykkelsen av det transplanterte vev ved å utsettes for NIR ved overflaten. Endelig kan NIR-PIT gjentatte ganger brukes til å eliminere målceller uten begrensning. Denne metoden er nyttig når målet celler uttrykker tilstrekkelige kopier av målet molekyler på celleoverflaten ^18.

Det er imidlertid noen begrensninger i denne teknikken. For det første er permeabiliteten av APC begrenset, siden det er et stort molekyl. For å løse dette problemet, gjentatt NIR-pit behandling eller antistoff-fragmenter kan utnyttes ^18,19,22. En annen begrensning er lys penetrasjon. Selv om den NIR-lyset kan trenge inn på riktig måte in vitro-kultur, oversettelse til in vivo behandling ville kreve tilpasset tilnærminger som fordøyelsesendoskopi, bronkoskopi, eller direkte thoracoscopy med fiberoptikk for å bevege lyskilden nærmere målområdet.

Ytterligere tilpasninger av NIR-PIT vil tillate bruk av denne metoden i både lokale og specific celle eliminering på mange felt, for eksempel immunmodulering eller tumor microenvironments ^{24 - 26.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye	LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)	929-70011
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)	S9763
Sephadex G25 column (PD-10)	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay	Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)	PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates	3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)	HDP1096-8
Optical power meter	Thorlabs (Newton, NJ, USA)	PM100
LED: L690-66-60	Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)	L690-66-60
Vectibix (panitumumab)	Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm	Cellvis (Mountain View, CA, USA)	D35-10-0-N