Introduction
ביטול תאים ספציפיים מבלי לפגוע בתאים אחרים קשה מאוד, במיוחד ברקמה הוקמה, ויש צורך דחוף שיטת חיסול תא בתחום הנדסת רקמות. כיום בתחום של רפואה רגנרטיבית, תרביות רקמה באמצעות תאי גזע עובריים (ES), תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs), או תאי גזע מושרים (iPS) הם חומרים מבטיח 1 - 3.
למרות התחדשות רקמות זו נראית מבטיחה, זיהום עם תאים לא רצויים הוא דאגה עיקרית. יתר על כן, קיים חשש לשלומם של tumorigenicity לאחר ההשתלה 4,5. למרות מחקרים רבים התמקדו בנושאים אלה לחסל תאים ספציפיים, במיוחד ברפואה רגנרטיבית 6 - 8, אין שיטה מעשית פותחה.
photoimmunotherapy אינפרא אדום קרוב (NIR-PIT) הוא טיפול המבוסס על conjugat נוגדן-photoabsorberדואר (APC). נגמ"ש מורכב של נוגדנים חד שבטיים תא ספציפי (מב) וכן photoabsorber, IR700. IR700 היא נגזרת סיליקה-phthalocyanine הידרופילי לא לגרום phototoxicity בעצמה 9. IR700 הוא מצומדות קוולנטית הנוגדן באמצעות שאריות אמידות על שרשרת הצד של מולקולות ליזין. הנגמ"ש נקשר מולקולות מטרה על קרום התא ולאחר מכן גורם כמעט תא נימק מיידי לאחר חשיפה לאור NIR ב 690 ננומטר. במהלך החשיפה NIR-אור, נקרע קרום הסלולר המובילה לתא פטירה 9 - 14. NIR-PIT הוכיח כיעיל עם נוגדנים מרובים או שברי נוגדנים, כולל אנטי EGFR, אנטי HER2, אנטי PSMA, אנטי CD25, אנטי מזותלין, אנטי GPC3, ואנטי-CEA 15 - 21. לכן, ניר-PIT יכול לשמש נגד מגוון רחב של מולקולות מטרה. יתר על כן, ניר-PIT הוא טיפול מבוקר היטב המאפשר טיפול סלקטיבית של אזורים ספציפיים על ידי הגבלת-תאורת NIRt הקרנה 18,22.
כאן, אנו מציגים שיטה של חיסול תאים ספציפיים באמצעות NIR-PIT מתרבויות 3D מעורבת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ההערה: הפרוטוקול הבא מתאר את הצעדים הדרושים כדי לחסל תאים ספציפיים באמצעות NIR-PIT. בקרות ופרטים נוספים על כדאיות NIR-PIT ותא ניתן למצוא במקום אחר 18.
1. הצמיד של IR700 לנוגדנים חד-שבטיים (מב)
- הכן מב עניין ב 2-5 מ"ג / מ"ל ב 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.6) פתרון.
- מערבבים 6.8 nmol של מב עם 30.8 nmol של 10 מ"מ IR700 ב 0.1 M Na 2 HPO 4 פתרון (pH 8.6) בצינור microcentrifuge ו דגירה ב RT עבור שעה 1, מכוסה בנייר אלומיניום.
- לשטוף את העמודה PD-10 (ראו טבלה של ציוד חומרים /) עם 15 מ"ל PBS, פעמיים. טען המדגם משלב 1.2.
- לטהר את התערובת דרך עמודת PD-10 על ידי elution PBS על פי הוראות היצרן.
הערה: כאן, elution היה לאורך צבע הלהקה של IR700. עבור מדגם 300 μl, חלק elution PBS הוא בדרך כלל בין 2.5 מ"ל ל -4.4 מ"ל. - לקבוע אתריכוז חלבון עם מכתים Coomassie על ידי מדידת הספיגה ב 595 ננומטר עם ספקטרופוטומטר 9. קבע את הריכוז של IR700 עם הקליטה 689 ננומטר כדי לאשר את המספר של מולקולות fluorophore מצומדות לכל מולקולה מב 9.
הערה: חשוב לקבוע מספר נטיה אופטימלי של מולקולות IR700 ב 1 מב עם ספקטרופוטומטר. באופן כללי, כ -3 מולקולות IR700 במולקולת 1 מב הן אופטימליות עבור הן במבחנה בעבודת vivo. HPLC ושיטות SDS-PAGE ניתן להשתמש כדי לאשר את מב ו IR700 מאוגדים ובין אם לאו. - חנות ב 4 מעלות צלזיוס לאחר קביעת ריכוז החלבון.
2. הכנת תרבית תאים 3D מעורב (Mixed אליפטית)
- החל מים סטריליים (סביב 1 מיליליטר) לתוך קטע מאגר הצלחת לתלות צלחות טיפה.
- הכן יחסים שונים של סוגי תאים של עניין - תאים A431-לוק-GFP ותאי 3T3-RFP -עם כל דגימה המכילה 5,000 תאים בסך הכל, המרחפים 50 μl של התקשורת והתרבות.
הערה: כן 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, וכו 'יחסים של סוגי תאים של עניין תקשורת והתרבות תלוי תאים מהסוג. - דגירת התמהיל 5-7 ימים בצלחת הירידה 96 גם תלוי חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, פחמן דו חמצני 5%. שנה את התקשורת והתרבות כל 2 ימים. הערה: כדי להפוך את 3D אליפטית בדיוק, להתמודד עם הצלחת בעדינות, כמו טיפות המכילות תאים ליפול בקלות לפני להרכיב צורות 3D.
- שים את המורפולוגיה והגודל של spheroids באמצעות מיקרוסקופ brightfield הפוכה ב 10X - הגדלה 40X. הערה: למרות שזה תלוי סוגי תאים וגודל-Drop Hanging, להבטיח כי הקוטר של אליפטית הוא סביב 400-600 מיקרומטר לאחר 7 ימי דגירה של 96 גם תלוי צלחת טיפה.
3. במבחנה NIR-בור תרבית תאי 3D מעורבת
- שנה את התקשורת של חהnging צלחות ושחרר כדי המצומד 10 מיקרוגרם / מ"ל נוגדנים photoabsorber (APC) מדיה המכילה, דגירה במשך 6 שעות בתוך חממה humidified ב 37 ° C ופחמן דו חמצני 5%.
- לאחר 6 דגירת hr, לשטוף את אליפטית פעמים עם תקשורת והתרבות הטריה (פנול האדום חינם). בעדינות להעביר את אליפטית לצלחת עם רצפת זכוכית 50 מ"מ עם 100 μl פנול טריים התקשורת והתרבות אדום ללא באמצעות קצה פיפטה סטרילית 200 μl עם קצה לחתוך. מניחים אליפטית אחת בכל צלחת.
- שים לב אליפטית עם מיקרוסקופ brightfield הפוך להבחין בשינוי של מורפולוגיה. כדי לבחון את הכתבים האופטיים (למשל, ה- GFP ו RFP) להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם גדרות המסנן הבאות: GFP - 469 מסנן עירור ננומטר, ואת מסנן פליטה 525 ננומטר; RFP - 559 מסנן עירור ננומטר, ו 630 מסנן פליטה ננומטר.
- מניחים את אור דיודה (LED) מעל צלחת תחתית זכוכית עבור הקרנה.
הערה: ניתן להיחשף Spheroids לנירלהדליק או על מיקרוסקופ או בשכונה למינרית.- מדוד את צפיפות ההספק של אור NIR עם מד כוח אופטי 9. על פי מדידה זו, מקרינים אור NIR באמצעות דיודות פולטות אור (LEDs) אשר פולטים אור באורכי גל של 670 עד 710 ננומטר 2 J / cm 2.
הערה: הנורית יכול לחדור לעומק מרבי של כ 5 ס"מ. השפעות ציטוטוקסיות של NIR-PIT תלויה רק אנרגיה נתון ללא קשר צפיפות הספק ומשך החשיפה 23.
- מדוד את צפיפות ההספק של אור NIR עם מד כוח אופטי 9. על פי מדידה זו, מקרינים אור NIR באמצעות דיודות פולטות אור (LEDs) אשר פולטים אור באורכי גל של 670 עד 710 ננומטר 2 J / cm 2.
- לאחר ההקרנה, להעביר את אליפטית לתוך צלחת Drop Hanging חדש עם 50 μl של התקשורת בתרבות טרי דגירה במשך יום 1 ב חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, פחמן דו חמצני 5%.
- בעדינות להעביר את אליפטית לצלחת עם תחתית זכוכית עם 100 μl של התקשורת בתרבות טרי (פנול אדום חינם) באמצעות קצה פיפטה סטרילית 200 μl עם קצה לחתוך. שימו לב אליפטית עם יום פלואורסצנטי מיקרוסקופ 1 לאחר Fi באמצעות NIR-PITהגדרות LTER כמתוארות בשלב 3.3.
- זיהוי תאים מתים על ידי הוספת יודיד propidium לתקשורת בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל, או על ידי אובדן של GFP הקרינה cytoplasmic באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 ב) 14,18,22.
- חזור על שלבי 3.1-3.6 אם תאי יעד הם לא בוטלו לחלוטין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי אופטית לפקח על השפעת NIR-PIT, שורת תאים A431, אשר overexpresses EGFR, שונה גנטית גם להביע GFP ו בלוציפראז (A431-לוק-GFP). כתוצאה היעד אי NIR-PIT, הקו הסלולרי Balb / 3T3 שונה אופטית להביע RFP (3T3-RFP). הנגמ"ש, וקטיביקס-IR700 (פאן-IR700), היה מסונתז. Spheroids מעורבת, אשר הורכבו יחסים שונים של תאים (A431-לוק-GFP ו 3T3-RFP) היו מפוברקות על פי פרוטוקול זה (איור 1). חוזרות NIR-PIT בוצעה עם הדגירה של הפאן-IR700 (ראה משטר ב איור 2 א). חיסול תא המטרה מתרבה 3D מעורב זו הושג במעקב עם פעילויות קרינה בלוציפראז (איור 2 ב, ג). מצד השני, תאים שאינם היעד המשיכו לגדול.
איור 2. חיסול בתא המטרה בשעת spheroids תאים 3D (spheroids מעורבת של A431-לוק-GFP ו 3T3-RFP תאים). (א) NIR-בור (2 J / cm 2) משטר מוצג. (ב) חוזר NIR-PIT בוטל לחלוטין תאי יעד (A431-לוק-GFP) ללא פגיעה בתאים שאינם יעד (3T3-RFP), ב אליפטית 3D מעורבת. בר = 200 מיקרומטר. (C) כימות פעילות בלוציפראז (יחס RLU)חיסול מוחלט מוכח של תאי היעד (n = 10 spheroids בכל קבוצה). נתון זה יש הבדל בין 18. הנתונים באים לידי ביטוי כאמצעי ± SEM אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מדגימים שיטת חיסול תאים ספציפיים מתוך תרבית תאים 3D מעורבת ללא נזק לתאים היעד הלא באמצעות NIR-PIT. עד כה, לא קיימת שיטה מעשית של חיסול תאים פעם הרקמה מוקמת או לאחר השתלה. לכן, ניר-PIT הוא שיטה מבטיחה לעשות זאת. טכניקה זו יכולה גם להיות מנוצלת in vivo 18,22, מאז נגמ"שים להראות הפרמקוקינטיקה דומה כמו מב עצם. סוג תא היעד יכול להיות מותאם עם שוני APC. נוגדנים שונים או שברי נוגדנים, כולל אנטי EGFR, אנטי PSMA, אנטי מזותלין, ואנטי-CEA כבר שימשו נגמ"שים 15 - 21. בנוסף, שינוי באזור של קרינה NIR יכול למזער באזור המטופל. כאן, עם כימות של פעילות בלוציפראז קרינה על תאי יעד, חיסול מוחלט של תאים ספציפיים אושרה.
NIR-PIT הוא טיפול מבוסס אור, ובכך נקודה קריטית היא tהוא המרחק בין מקור NIR-אור ואת היעד, שכן אנרגיית האור ולכן ירידה התא נמק על פי חוק הפוך- מרובע (שלב 3.4). כדי להפוך את 3D אליפטית בדיוק, הצלחת צריכה להיות מטופלים וטופח בעדינות ככל האפשר. טיפות התאים המכילים בקלות נהרסים או ליפול על ידי זעזוע קצת לפני להרכיב צורות 3D.
יש NIR-PIT כמה יתרונות ייחודיים. ראשית, הניר-PIT נגמ"שים להפגין הפרמקוקינטיקה תוך ורידים דומות נוגדנים שאינן מצומדות הוריות, בשל המאפיינים הידרופילי של IR700, שמובילים מאוד ספציפי מחייבים למקד תאים וצבירת היעד הלא מינימאלית. לכן, גם לאחר ההשתלה של הרקמה, ניר-PIT יכול לטפל בתאים היעד באמצעות הזרקה תוך ורידית של APC ואחריו חשיפה של האזור של עניין לניר. שנית, אור NIR יכול לחדור עמוק הרבה יותר לרקמת מ UV או האור הנראה, אם כן, ניר-PIT יכול לטפל לא רק את פני השטח, אלא גם את entiמחדש עובי של הרקמה המושתלת כתוצאה מחשיפה NIR על פני השטח. לבסוף, ניר-PIT ניתן להשתמש שוב ושוב כדי לחסל תאים היעד ללא הגבלה. שיטה זו שימושית כאשר תאי היעד להביע עותקים מספיקים של מולקולות מטרה על פני תא 18.
עם זאת, יש כמה מגבלות על טכניקה זו. ראשית, את החדירות של APC מוגבלות שכן הוא מולקולה גדולה. כדי להתגבר על בעיה זו, חזר NIR-PIT שברי טיפול או נוגדן ניתן לנצל 18,19,22. מגבלה נוספת היא חדירת אור. למרות-אור NIR יכול לחדור כראוי במבחנה תרבות, תרגום לטיפול in vivo ידרוש גישות מותאמים כגון אנדוסקופיה העיכול, ברונכוסקופיה, או thoracoscopy ישיר עם fiberoptics להזיז את מקור האור קרוב לאזור היעד.
עיבודים נוספים של ניר-PIT יאפשר את השימוש בשיטה זו הן מקומיים specחיסול תאים ific בתחומים רבים, כגון microenvironments תפקוד מערכת החיסון או גידול 24 - 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר העירונית של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב, המכון הלאומי לסרטן, המרכז לחקר הסרטן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | |
| Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates | 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) | HDP1096-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | |
| LED: L690-66-60 | Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA) | L690-66-60 | |
| Vectibix (panitumumab) | Amgen (Thousand Oaks, CA, USA) | ||
| 35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm | Cellvis (Mountain View, CA, USA) | D35-10-0-N |
References
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Birchall, M. A., Seifalian, A. M. Tissue engineering's green shoots of disruptive innovation. Lancet. 6736 (14), 11-12 (2014).
- Ben-David, U., Benvenisty, N. The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nat. Rev. Cancer. 11 (4), 268-277 (2011).
- Hanna, J. H., Saha, K., Jaenisch, R. Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues. Cell. 143 (4), 508-525 (2010).
- Lee, M. -O., Moon, S. H., et al. Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (35), 3281-3290 (2013).
- Miura, K., Okada, Y., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).
- Tang, C., Lee, A. S., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nat. Biotechnol. 29 (9), 829-834 (2011).
- Mitsunaga, M., Ogawa, M., Kosaka, N., Rosenblum, L. T., Choyke, P. L. Cancer cell - selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nat. Med. 17 (12), 1685-1691 (2011).
- Mitsunaga, M., Nakajima, T., Sano, K., Kramer-Marek, G., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Immediate in vivo target-specific cancer cell death after near infrared photoimmunotherapy. BMC Cancer. 12 (1), 345 (2012).
- Nakajima, T., Sano, K., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Real-time monitoring of in vivo acute necrotic cancer cell death induced by near infrared photoimmunotherapy using fluorescence lifetime imaging. Cancer Res. 72 (18), 4622-4628 (2012).
- Sano, K., Mitsunaga, M., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Acute cytotoxic effects of photoimmunotherapy assessed by 18F-FDG PET. J. Nucl. Med. 54 (5), 770-775 (2013).
- Sato, K., Watanabe, R., et al. Photoimmunotherapy: Comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Mol. Oncol. 8 (3), 620-632 (2014).
- Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Lett. 365 (1), 112-121 (2015).
- Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer. Mol. Cancer Ther. 14 (8), 141-150 (2014).
- Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PloS one. 9 (11), 113276 (2014).
- Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience. Theranostics. 5 (7), 698-709 (2015).
- Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine. RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).
- Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies. J. Nucl. Med. 56 (1), 140-144 (2014).
- Nakajima, T., Sano, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Improving the efficacy of Photoimmunotherapy (PIT) using a cocktail of antibody conjugates in a multiple antigen tumor model. Theranostics. 3 (6), 357-365 (2013).
- Shirasu, N., Yamada, H. Potent and specific antitumor effect of CEA-targeted photoimmunotherapy. Int J Cancer. 135 (11), 1-14 (2014).
- Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6 (23), 19747-19758 (2015).
- Nakajima, T., Sato, K., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC cancer. 14 (1), 389 (2014).
- Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications. Nat. Rev. Drug Discov. 7 (2), 131-142 (2008).
- Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis. Nat. Rev. Rheumatol. 10 (2), 77-88 (2014).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
