Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

סריקה הילוכים בקנה מידה גדול מיקרוסקופית אלקטרונים (Nanotomy) של בריאה ונפצעו דג הזברה המוח

Published: May 25, 2016 doi: 10.3791/53635
Automatic Translation
1, 1, 1, *2, *1
1Cell Biology, UMC Groningen, 2Clinical Genetics, Erasmus MC Rotterdam
* These authors contributed equally

Abstract

במיקרוסקופ אלקטרונים 2D בקנה מידה גדול (EM), או nanotomy, הוא יישום רחב-רקמה במיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה של ננו. אחרים ואנחנו בעבר להחיל EM בקנה מידה הגדול כדי איי לבלב עור אנושיים, תרבות רקמות 1-7 זחלי דג זברה כולה. כאן אנו מתארים שיטה ישימה אוניוורסלי עבור EM סריקה בקנה מידת רקמות לגילוי משוחד של תכונות תת-תאיות ומולקולריות. Nanotomy יושמה לחקור את בריא מוח דג זברה ניווניות. השיטה שלנו מבוססת על פרוטוקולי הכנת מדגם סטנדרטיים EM: קיבוע עם glutaraldehyde ו אוסמיום, ואחריו הטבעה אפוקסי-שרף, Ultrathin חתך הרכבת סעיפי Ultrathin על רשתות אחד גומות, ואחריו פוסט מכתים עם uranyl ועופרת. תמונות פסיפס בקנה מידה גדולה 2D EM נרכשות באמצעות סריקה EM מחובר גנרטור סריקת שטח גדול חיצוני באמצעות EM שידור סריקה (STEM). תמונות EM בקנה מידה גדולה הן בדרך כלל ~ 5 - 50 פיקסלים G iגודל n, ו נראה במיטבו באמצעות קבצי HTML zoomable, אשר ניתן לפתוח בכל דפדפן אינטרנט, בדומה מפות HTML גיאוגרפיות באינטרנט. שיטה זו יכולה להיות מיושמת (אדם) רקמה, חתכים של חיות שלמות כמו גם בתרבית רקמת 1-5. כאן, מוח דג זברה נותח מודל אבלציה עצבי לא פולשנית. אנו לדמיין בתוך רקמה במערך יחידה, סלולרית, שינויי subcellular אשר ניתן לכמת בסוגי תאים שונים, כוללים נוירונים microglia, מקרופאגים של המוח. בנוסף, nanotomy הופך לפשוט את המתאם של EM עם מיקרוסקופ אור (קלם) 8 ​​באותו רקמות, כמו שטח פנים גדול צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעבר, יכול להיות כפופים להם ובהמשך EM שטח גדול, וכתוצאה מכך את האנטומיה ננו (nanotomy) של רקמות. בסך הכל, nanotomy מאפשר זיהוי משוחדת ב- רמת EM באופן לכימות-רחב רקמות.

Introduction

התפתחויות טכניות אחרונות שפרו את צדדיות, תחולת טבע כמותי של EM, שמובילה התעוררות של ניתוח ultrastructural. התקדמות כוללת 3D EM, EM 2D בקנה מידה גדול שיטות משופרות ריאגנטים עבור במיקרוסקופ אלקטרוני מיקרוסקופיה אור בקורלציה (קלם) כדי להשוות מצבים אחרים של ניתוח מיקרוסקופי ישר לרמת EM 8-10. 2D EM בקנה מידה גדולה מתאים במיוחד לכמת או לזהות (רומן) תכונות מחלת לפתולוגיה אדם, ללמוד במודלים של בעלי חיים עבור מודלי תרבות מחלה ורקמות. בשל השדה בדרך כלל קטן מבט קשה להתאים את השינויים בהגדלה גבוהה בקנה מידה רחב רקמות, כמו גם unbiasedly וכמותית לנתח תכונות ultrastructural.

לקבלת ניתוח פתולוגי של רקמה אנושית או הערכת פתולוגיה במודלים של בעלי חיים, haematoxylin ו eosin (H & E) בצבע קטעי פרפין פורמלין קבוע מוטבע (FFPE) tisסו היא התקן. חוץ מזה פשוט immunolabeling צביעת H & E מבוצע גם לזהות חריגויות פתולוגי. אם רקמות כזה יכול להיות מנותח ברמה EM, סוגי תאים מסוימים, ושינויים subcellular ניתן היה לזהות. האופי המוטה של ​​EM בקנה מידה הגדול מאפשר מציאת תכונות צפויות רומן של מחלה. חלקי פנים בקנה מידה גדולה באזורי EM עד מילימטרים רבועים ניתן דמיינו. אנחנו ואחרים בעבר להחיל nanotomy להלשין איי לבלב 4, תרבות 2 תאים, עכברוש מוח 3, עור ובריריות 7 וזחלי דג זברה שלמים 1,5 (www.nanotomy.org). דג הזברה מתאימה מאוד עבור in vivo הדמיה, ב במיוחד לדמיין סוגי תאים אשר קשה גישה ברקמות יונקות כולל תאי חיסון מוח 11. הנה הליך nanotomy מתואר בפירוט, להחיל סעיפי עטרה של ראשי דג זברה שעברו אבלציה עצבית ממותנת על ידי מרה של metronidazole ידי עצביnitroreductase הביע (www.nanotomy.org) 5,12-14. כל הנתונים הגולמיים מוצג כקבצי HTML zoomable, הדמיה מולקולרית לשינויים בהיקף רקמות. הצגת הנתונים הגולמיים מאפשרת ניתוחים משוחדים של מערכי נתונים מזוויות אחרות על ידי מומחים ברחבי העולם.

Protocol

כל הניסויים עם הזחלים דג הזברה אושרו על ידי ועדת ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת חרונינגן פי הנחיות לאומיות והאיחוד האירופי.

לדוגמא הכנה 1.

  1. קיבוע והטבעה
    1. קיבוע
      1. לטשטש הזחלים הדגים tricaine (0.003%) מתווסף (NaCl 5 מ"מ, 0.17 מ"מ KCl, 0.33 מ"מ CaCl 2, 0.33 מ"מ MgSO 4, 10 HEPES מ"מ, pH 7.6) E3 מים ולבדוק דג הזברה עבור עומק ההרדמה על ידי חדירה בעדינות עם קצה פיפטה 200 μl תחת מיקרוסקופ לנתיחה עד הצעת אי מזוהה יותר (איור 1 א).
      2. כאשר עיבוד דגימות עבור EM גומל לאחר שרכשה בנתונים הדמיה vivo באמצעות confocal או 2 הדמיה פוטון ב -1.8% agarose כמתואר, 5-15 הזחלים לתקן ב agarose באמצעות PFA 4% PBS המכיל טריטון-X-100 (0.05%).
      3. חותכי זחלים מן agarose ותהליכיםבקנה מידה גדול EM 5.
      4. תקן הזחלים paraformaldehyde טרי 4% ב PBS המכיל טריטון-X-100 (0.05%) עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר צינורות פלסטיק.
        הערה: תאים הגדלים בתרבית (במבחנה) ניתן לתקן ישירות glutaraldehyde, כפי שמתואר בשלב הבא (1.1.1.5).
      5. הסר פתרון ולהוסיף 100 μl 0.5% PFA, 2% glutaraldehyde (GA), ו -0.1 M נתרן cacodylate (pH 7.4). אחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס. דגימות שטיפה פעמיים cacodylate 0.1 M נתרן.
      6. חותכי ראשי זחל rostrally אל למוח האחורי כדי להקל על חדירה של אוסמיום. השתמש מזרקים / מלקחיים בסדר.
      7. Postfix הזחלים tetroxide אוסמיום 1% (OSO 4) /1.5% פרוציאני אשלגן (K 4 [Fe (CN) 6]) ב 0.1 M cacodylate נתרן על קרח במשך 2 שעות ולשטוף 3 x 5 דקות כפול מזוקקים H 2 O.
      8. מייבשים באתנול ב -20 incubations דקות בהגדלה ריכוזי אתנול (50%, 70%, 3 פעמים 100%).
    2. Embedding
      1. כן שרף אפוקסי על פי מתכונים סטנדרטיים המשמשים במעבדות EM.
        הערה: אנו משתמשים שרף אפוקסי כדלקמן: לערבב 19.8 גרם glycid אתר 100, 9.6 גרם 2-dodecenylsuccinic אנהידריד חומצה 11.4 גרם methylnadic אנהידריד באמצעות בוחש מגנטי. הוסף 0.5 גרם DMP-30 (כמה עצוב (dimethylaminomethyl) פנול) ומערבבים שוב.
      2. דגירה לילה הזחלים שרף אפוקסי 50% אתנול (v / v) תוך כדי סיבוב (RT).
      3. חלף אפוקסי-שרף מדולל עם שרף טהור. דגירה למשך 30 דקות, להוסיף בטרי שוב דגירה במשך 30 דקות אחרות. שוב לרענן את שרף ואז דגירה 3 שעות ב RT, ואחריו 15 דקות ב 58 ° C ועוד 1 hr ב RT בלחץ נמוך (200 mbar).
      4. אוריינט הראשי בתוך תבניות הטבעה שטוחה סיליקון זמינות מסחרי תחת מיקרוסקופ לנתיחה באמצעות מחט או קיסם עם הקדמי מול הצד של העובש או לפי צורך (איור 1 ב).
      5. לפלמר מיל אפוקסיב הלילה ב 58 מעלות צלזיוס. אם שרף אפוקסי הוא עדיין רך מדי לאפשר עוד יום לפלמר להקשיח ב -58 מעלות צלזיוס. קשיחות בדיקה על-ידי הפעלת לחץ באמצעות מלקחיים. אם זה בקלות משאיר חריץ לאפשר עוד יום לפלמר להקשיח ב -58 מעלות צלזיוס. כאשר הדגימה הוא התקשה מלא להמשיך זמירה ו חתך.
      6. חתוך משם שרף עודף סכיני גילוח באמצעות בדל (האיור 1B).
  2. חתך, מנוגדים, שמה
    1. חתך
      1. לחסום שרף אפוקסי סעיף באמצעות ultramicrotome.
      2. בעזרת סכין זכוכית או יהלום histoknife לחתוך חלקי semithin (500 ננומטר) עבור toluidine הכחול / fuchsin הבסיסי (איור 1D) מכתים כדי לזהות את המיקום הנכון.
      3. העברה חצי דקת סעיפים בשקופיות מיקרוסקופיות ידי להרים אותם עם pipet פסטר זכוכית שהקצה שלו נסגר על ידי המסה בלהבה. יבש על פלטה חשמלית until אין מים שנשאר. הכתם למשך 10 שניות עם toluidine כחול 1% במים על פלטה חשמלית ואחרי שטיפה במים, כתם במשך 10 שניות עם fuchsin בסיסי 0.05% ב tetraborate 1% נתרן. לבחון באמצעות מיקרוסקופ אור רגיל ב 10X כדי 40X.
      4. כאשר אתר תקין / אוריינטציה בתוך המוח הוא הגיע, להמשיך חתך את גוש שרף אפוקסי עם סכין יהלום לחתוך קטעים ultrathin (~ 70 ננומטר; איור 1E)
      5. השתמש מבנים אנטומיים לזיהוי בקלות בתוך ומסביב המוח, כולל בורות חוש ריח, עיניים, גבולות חומר אפורים-לבנים, כדי לזהות את האזור של עניין במהלך Ultrathin חתך ולהתאים את זווית החתך כאשר המדגם הוא מוטה.
      6. סעיף הר על משבצת האחת L2 x 1 רשתות נחושת (איור 1F), כדי לאפשר רכישה ללא שיבושים ברי רשת. השתמש Formvar רשתות מצופות לתמוך חלקים.
    2. נוֹגֵד
      1. סעיפי ultrathin כתם על רשתים למשך 2 דקות ב אצטט uranyl 2% מתנול ואחריו ריינולדס להוביל ציטראט עבור 2 דקות אחר 16.

2. Image Acquisition

  1. STEM בקנה מידה גדול
    הערה: אנו משתמשים EM סריקה עם גנרטור סריקה חיצוני מסוגל לרכוש שדות גדולים מרובים מבט ברזולוציה גבוהה 3,5,7,17 ​​באמצעות זיהוי גזע. בדרך כלל, תמונה אחת שנוצרה בדרך זו שקולה בתחומים לאור ~ 100 הילוכי אלקטרונים מיקרוסקופים (TEM) תמונות, צמצום משמעותי את כמות התפרים.
    1. הרכבה לדוגמא ב מיקרוסקופ
      1. מניח רשת עם סעיף ב בעל מדגם רשת המרובה ולהעביר ההחדרה של SEM.
    2. מערך של גלאי STEM
      1. שים את הרשת עם המדגם תחת הקורה ולעבור את זה כך שזה יהיה כ. 5 מ"מ מקוטב העדשה. לרכוש תמונה ב 20 kV באמצעותאל הגלאי-העדשה.
      2. דגש על קצה הרשת ולהתאים עובד המרחק ל -4.0 מ"מ.
      3. הזז את בעל מדגם לעמדה בטוחה להביא את גלאי STEM.
      4. מרכז את החור של גלאי STEM בתחום הדימוי על ידי סיבוב ברגי התאמות תוך הדמיה במהירות מרבית עם הגלאי ב-עדשה.
      5. בזהירות להחזיר את בעל המדגם אשר רק יתאים בין קוטב העדשה לבין הגלאי.
      6. לרכוש תמונה עם הגלאי-העדשה להיות בטוח יהיה על אזור הסעיף.
      7. החלף ל STEM זיהוי (בינוני רווח וכל הרביעים להגדיר על 'מינוס') ולרכוש תמונה ובחר את האזור לסריקה.
      8. תרי מתח אץ ל -21 ק ולחכות ייצוב של הקורה (תמונה היציבה שוב) ולאחר מכן ללכת 29 kV בצעדים של 2 קילו.
    3. רכישת תמונות
      1. טרום מקרינים את המדגם (כדי למנוע שינויים בהירים שנגרמו על ידי הקורה האלקטרוני) על ידי התקרבותמתוך כך שהאזור המלא לסריקה מתאימה בחלון התמונה.
      2. שינוי צמצם 120 מיקרומטר (כדי לשמור על הטווח הדינמי הראוי הרווחים הגלאי צריכים להיות מופחתים צעד אחד).
      3. דה-פוקוס ולכן התמונה מטושטשת.
      4. הפוך את האזור שנסרק כמו הדוק ככל האפשר באמצעות אפשרות הסריקה באזור המופחת.
      5. מהירות סריקה הגדר כך מסגרת נסרק ב כ. שניות 1 - 2.
        הערה: בהתאם לגודל ורקמות זה בדרך כלל לוקח ½ שעה (100 x FOV מיקרומטר 100) עד 3 שעות (1,000 x 500 מיקרומטר).
      6. זום פנימה לפחות 100X ולסרוק שטח קטן במשך 10 שניות.
        הערה: כאשר אזור זה אינו משנה בהיר לעומת, טרום ההקרנה וסביבתה מספיקה.
      7. להחזיר את הצמצם 30 מיקרומטר (גזע רווח בינוני)
      8. פוקוס המדגם.
      9. יישר צמצם באמצעות wobbler (בהגדלה ~ 40,000X).
      10. בעוד בפוקוס לבחור את האזור / תכונה הקלה, להגדיר מהירות סריקה כך פרטיםגלויים.
      11. בתוכנת מיקרוסקופ לכוונן את הבהירות והניגודיות באמצעות צפייה בהיסטוגרמה בזהירות כדי לשמור את כל הפיקסלים הטווח הדינמי. לעשות את אותו הדבר עבור האזור / תכונות האפלות.
      12. חזור אל האזור הבהיר ולבדוק שוב. להיות בצד הבטוח ולכן יש קצת מקום משני הצדדים של ההיסטוגרמה.
      13. זום החוצה כך שהאזור המלא לסריקה מתאימה לחלון ההדמיה, ולהתחיל את תכנית רכישת שטח הגדולה.
      14. השתמש באפשרות אשף להקים פסיפס ידי בחירת שטח מהמסך. השתמש פיקסל בגודל 2 - 5 ננומטר תלוי מה פרטים נחוצים. השתמש להתעכב זמן 3 מיקרו-שניות עבור STEM.
      15. בחר באפשרות "פוקוס אוטומטי על אריח קודם", השתמש הפוקוס אוטומטי תוכנת רכישה בקנה מידה הגדולה עם הגדרות חברה מחדל, תיבת הסימון "לאמת הגדרה לפני ביצוע" ולהגדיר היכן לשמור את הנתונים.
      16. לחץ "לייעל" כדי לבדוק את הגדרות מיקרוסקופ.
        הערה: עכשיו את הזמן הדרוש יהיה shשֶׁלוֹ. זה עשוי להיות עד 72 שעות עבור 1 x 0.5 מ"מ אזורים.
      17. בחלון "ברזולוצית אריח מקסימלית" סוג 20,000 כך אריחים בודדים, לא יהיו גדול מ 20k x 20k, במניעת תופעות קצה קהות. לחץ "הוצאה להורג".
      18. כשנשאל לבדיקת להתמקד בהירות / ניגודיות (C / B), לכבות גנרטור סריקה חיצוני ובזהירות להתאים את המיקוד ואת אסטיגמציה בתוכנה מיקרוסקופ. אל תשנה B / C.
        הערה: השלב ניתן להעביר והגדלה השתנה, אבל יש הגדלה יאופסו בגודל פיקסל הרצוי.
      19. הפעילו גנרטור סריקה חיצוני שוב ולחץ על "המשך".

.3 ניתוח נתונים

  1. פתח את תכנית צופה קובץ EM בקנה מידה גדולה לפתוח את הקובץ "מידע פסיפס". פעולה זו תפתח את כל טיף-קבצי רעפים. זה רצוי מבוצע על תחנת עבודה אחרת לא להכשיל רכישות חדשות.
  2. בחר באפשרות "auלתפור כל פסיפס (פרמטרי החפיפה במצב אונ וחצי, תופר סף 0.90, הפחתת רעש אוטומטית. בקריטריוני תפרים מקרה לא יכולה להתממש, זום פנימה למקם אריח ידני במצב ולחץ על 'להמשיך כפי שהוא ").
  3. ייצוא כקובץ HTML, או לחילופין כסינגל TIF.
    שים לב שעבור TIF לייצא downscaling ייתכן שיש צורך. כלול את גודל פיקסל הסופי בשם הקובץ המאפשר מדידות מאוחר יותר.
  4. בצע הסברים בקובץ TIF ידי פתיחתו ב תוכנית לעריכת תמונות. במקביל, פתח את קובץ html zoomable בדפדפן אינטרנט להסתכלות רזולוציה אופטימלית.

Representative Results

נתוני EM בקנה מידה גדולה של חלקי עטרה של ראש זחלי דג זברה בן 1 שבועות תערוכות רקמות רבות ותכונות הסלולר תמונה בקנה מידה גדולה אחד (www.nanotomy.org).

Nanotomy סעיפי שליטת מוח מגלה תכונות ultrastructural טיפוסיות של רקמה העצבית של המוח הקדמי המקורי כולל חוט חבילות חוש ריח, גרעינים עצביים ו-תאים תת עצביים כולל סינפסות (איור 2 א, www.nanotomy.org). סוגי תאים בראש כי ניתן להבחין כוללים chondrocytes עם vacuoles גדול בלסת התחתונה, המיאלין osmiophilic של תאי עצב ההרחה, תאי אנדותל של כלי שיט קטן, מבנים כוללים את meninx (עמיתו דג הזברה של קרומי המוח, את encasing שכבת קרומי במוח היונקים). מבני subcellular כוללים את glycocalyx של האפידרמיס, מורפולוגיות גרעיניות שונות מוקדים ב cel השונה סוגי האברונים l כולל מערכת גולג'י, reticulum endoplasmic (ER), מיטוכונדריה שלפוחית ​​סינפטית וצפיפות הפוסט סינפטי.

באופן בלתי צפוי את הגרעינים של תאים המצפים את החדר הם אלקטרונים צפופים מאוד בהשוואה לתאים אחרים התפזרו יותר רוחבי במוח. בנוסף, גרעינים חדרית אלה מראים מוקדים כהים שנעדרים בתאים אחרים במוח להיראות שונים בגודל ומבנה מן heterochromatin, המצוי בגרעין של microglia phagocytic (איור 2). תאים המצפים את החדר בפיתוח דג זברה כוללים ותאי גלייה רדיאלי בעיקר אבות עצביים, אשר עשוי לשקף מצב הכרומטין שינה מאשר תאים מובחנים יותר. כמו תאי גזע ברקמות הם בדרך כלל די נדירים, nanotomy לתאם תיוג רקמות עבור סמני תא גזע עם סולם רקמות EM ולכן יכולה לשמש כדי לזהות תכונות ultrastructural של תאי גזע.

ve_content "FO: keep-together.within-page =" 1 "> EM-מידה גדולה (www.nanotomy.org) של קטע עטרה בתוך זחל דג זברה שעבר אבלציה עצבית מגלה רקמות ספציפיות רבות, ותכונות תאיות ומולקולריות לא נמצאו אצל בעלי חיים מלאים. תכונות סלולריות כוללות microglia phagocytic ו vacuoles את גודל התאים, מייצג תאים מתים סביר (התרשים 2B, www.nanotomy.org). מחקרי EM קודמים זיהו המיקרוגליאה חוליות 18,19. תכונות אופייניות של microglia כוללות גרעינים מאורכים גושים, של הכרומטין בלתי סדיר ליד מעטפת הגרעין, מערכת גולג'י בולטת, polyribosomes חינם, reticulum endoplasmic הפרטני (ER) עם cisternae הצר וארוך, יחסית כהה / הציטופלסמה צפופה, תכלילים רבים, כגון phagosomes, טיפות שומנים ו lysosomes. כל אלה סימני ההיכר, המיוחס microglia ברקמות יונקים, נמצאו גם בתאים אלה במוח דג הזברה (תרשים 2B, www.nanotomy.org).

<p class = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 1
איור 1: Workflow של מיקרוסקופית אלקטרונים רקמות בקנה מידה גדול על המוח דג הזברה. (א) 7 זחל דג זברה בן יומו. (ב) ראשי זחל דג זברה מוטבעים זו לצד זו שרפה אפוקסי. (C) סכין זכוכית חצי -thin חתך ואת מכוון את הדגימה. (ד) סעיף מוכתם הכחול נציג semithin toluidine מראה שני Side-by-side מוטבע זחלי דג זברה. (E) Diamond סכין לחתוך ultrathin (70 ננומטר) סעיפים. (F) נערך תמונה (ד) סעיף מוח זחל דג זברה כולה על רשת אחת-חור כדי לציין מיקום. (G) מערכת מיקרוסקופית משמש בקנה מידה גדול EM 2D במחקר זה. (H) זרימה של עיבוד תמונה. נא ללחוץ כאןכדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
. איור 2: תוצאות Nanotomy:. מ מקרומולקולה לרקמות (א) Nanotomy של מוחם של 7 ימים לאחר שליטה הפריה (B) מטופלים (אבלציה העצבית; איור 1), המציגות תכונות ספציפיות העצבית ablated ניווניות של המוח (B) אלה כולל microglia phagocytic, תאים חשוכים שעבר מוות של תאים ומראה ספוגי של רקמה עצבית ((א) ו- (ב)). לוחות עליונים (המותאמים מ 5): תצוגה מוגדלת 10X של אזור מצוין לוחות ביניים. לוחות תיכון: תצוגה מוגדלת 10X של אזור מצוין לוחות נמוכים. (A, פאנל באמצע) נוף בהגדלה גבוהה של סינפסה מראה neuropil ב (א, הפאנל התחתון), שלפוחית ​​סינפטית (SVS) וצפיפות postsynaptic (PD). (B, פאנל באמצע) נוף בהגדלה גבוהה של מיקרוגליאה אמבואידית או אולי מקרופאג (פאנל באמצע, M), המציגות תכונות microglial אמבואידית טיפוסי (הפאנל התחתון) כולל מערכת גולג'י בולט (G), תכלילים כולל vacuoles ליזוזומלית (L). ברי סולם: 50 מיקרומטר (למעלה), 5 מיקרומטר (באמצע) ו -0.5 מיקרומטר (למטה). נתון זה יש הבדל בין 5. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו , או בקר באתר המקוון נתונים מלא (nanotomy.org).

Discussion

EM מאפשר ניתוח של קשר הסלולר עם הדמיה ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולות בהקשר ביולוגי. עם זאת, זה בדרך כלל מגביל את שדה הראייה. גדולה בקנה המידה 3D EM מתאימה במיוחד קישוריות עצבית מיפוי ידי יצירה ברזולוציה של ננו 3 שחזורים ממדיים, המחייבות עיבוד נתונים מורכבים 10. לעומת זאת, EM בקנה מידה גדול 2D דורש סעיף ורקמה אחת בלבד של הנתונים הדמיה, והערכה של נתונים ניתן על ידי מי שיש לו גישה אל דפדפן אינטרנט. אנו ואחרים השתמשו בעבר EM בקנה מידה הגדול כדי לנתח רקמות חיות שלמות. באשר ביותר תפרי הגישות, TEM ו- SEM מבוססים יש יתרונות משלהם. הנה, סריקת השידור EM (STEM) שמש המאפשר דור של שדה גדול של השקפה ברזולוציה גבוהה. בדרך כלל, תמונת STEM אחד שווה בתחומים לאור כ -100 תמונות TEM, צמצום משמעותי את כמות התפרים כאשר הדמית fiel הגדולds מבט ברזולוציה גבוהה. אם ברזולוציה גבוהה יותר יש צורך, TEM עשוי להיות יתרון. STEM יש יתרון על פני TEM כי דגימות הלא בניגוד ניתן להשתמש עם ניגודיות ultrastructural טוב 6.

בנוסף, השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מותאמת פשוט לשימוש עם זיהוי אלקטרוני גב מפוזר (BSD) על חלקים רכובים על פרוסות סיליקה, הרחבת השימוש במערכות מיקרוסקופ מרובות. קבצי HTML-zoomable רקמות EM הם מאוד שימושיים עבור כימות, שיתוף נתונים שעשויים לא נותחו לתוכן המלא שלה, שילוב LM ונתוני EM (קלם) 8, לצרכי הצגה במחקר מדעי, לנתח נתונים מטופלים, ושל חינוך. לחלופין, ב EM בקנה מידה גדולה בתוך SEM, אך לא TEM, ופלי סיליקה יכולים לשמש, אשר יש שני יתרונות עיקריים: BSD ניתן להשתמש, וזה יותר זמין בדרך כלל על מיקרוסקופי אלקטרוני סורק אבחון גזע. שנית, הרכבה של חלקים גדולים (> 1 מ"מ 2 תחומיםהריבית) היא פשוטה. הרכבה על רשתות יחידות מחוררות היא עבודה אינטנסיביות מאתגרת מבחינה טכנית. השוואה מפורטת בין TEM, SEM ו STEM מפורטת במקומות אחרים 6. חסרון של הדמית BSD הוא, לעומת הגזע, תמונות גדלו רעש. זה יכול להיות מתוגמל באופן חלקי על ידי הגדלת זמן להתעכב פיקסל, וכתוצאה מכך פעמים הרכישה עוד זמן רב.

למרות להכנת מדגם עיבוד EM סטנדרטי יחסית (קיבעון, הטבעה ו חתך) נדרש 5-7, זה מאתגר מבחינה טכנית כדי לחתוך חלקים ultrathin גדול נטול לחלוטין של חפצים. מדורים הם שבירים מאוד, בקלות לשבור, לקפל או נהרסים במהלך ההדמיה, אשר בדרך כלל לוקח שעות מרובות בכל מערך נתונים. עם זאת, בגלל השיתוף המקוון של הנתונים המשוחדים הגלם, זה צריך להיות אפשרי להשוות ביתר קלות נתונים שפורסמו, ולהשתמש במערך שפורסם התחום הפתוח כקבוצת ביקורת. נכון לעכשיו, כמה מכשירי EM מסוגל להrge בקנה מידה ניתוח נמצאים בשימוש, ולכן הנגישות טכניקה זו היא מוגבלת במידה מסוימת, אם כי מרכזי הדמיה ביותר בברכה שיתופי פעולה.

עבור חלקים גדולים הרקמה צריכה להיות קבועה כראוי ברחבי המדגם. זו הסיבה תערובת של מקבע מהר אבל מתונה PFA משמש בשילוב עם מקבע איטי אבל חזק GA. חיתוך להרים חלקים גדולים בלי לכלוכים קשה. עבודה עם פרוסות בשילוב עם BSD קל לעומת איסוף חלקים על רשתות חור אחד. מכתים פוסט רוק כבד יותר קריטי לעומת EM קלאסית. מאז הקטע השלם הוא צלם כל חפץ יהיה גלוי. משתמשים TEM בדרך כלל מתקשים לעבור SEM, בגלל השוני במבצע מיקרוסקופ.

כימות ושיתוף נתונים - כימות תכונות subcellular קשה בתמונות יחידות EM. האפשרות להתקרב ולהתרחק של בקנה מידה גדולתמונות בקלות מאפשרות זיהוי של תאים בעלי עניין, אשר יכול להיות מלווה מדידות ננו בתוך התאים. מערכי נתונים אלו מעידים כי סוגי תאים מסוימים ניתן לזהות במהירות לכמת בצורה משוחדת לחלקים גדולים של הרקמה אלה בהתבסס על תכונות לזיהוי בקני מידה שונים. לדוגמה microglia ניתן לזהות המבוססת על המורפולוגיה שלהם הציטופלסמה צפופה. בהמשך לכך, על התקרבות על תאים בודדים, תכונות subcellular ומולקולרית ננומטריים של תאים אלה ניתן למדוד בתוך אותו בסיס הנתונים, כפי שהראנו קודם לכן עבור רוחב ER בתוך בסיס הנתונים בתרבית רקמה EM בקנה מידה גדול 2. יתרון נוסף של nanotomy הוא כי האירוח של מערכי נתונים בקנה מידה גדולים באינטרנט יאפשר לאחרים לבדוק את הנתונים, אולי עבור תכונות אחרות, ולהסיק המסקנות שלהם על השערה חדשה.

קלם - בנוסף להקל EM כמותי, EM בקנה מידה גדול מקל לתאם microsco אורתיוג תמונות כדי EM ברמה 8. בדוגמא הנוכחית בנוכחות microglia phagocytic במודל אבלציה דג זברה מוצגת. שאלה מרכזית במדעי המוח היא מה פונקציות פרט התרומות הן של המיקרוגליה ממקורות אחרים פוטנציאל של phagocytic ותאי חיסון. מחקרי EM מוקדמים הראו תכונות subcellular ייחודיות של microglia במחלה 18. למרבה הצער, קשה לתייג microglia סלקטיבי ובמיוחד אם זה יעשה פתולוגי, כפי שהם מציגים חפיפה גדולה עם תאים חיסוניים אחרים ביטוי גנים, מורפולוגיה ותפקוד. לכן, לא ברור אם ומתי microglia ברמת ultrastructural נבדל תאים חיסוניים ממקורות אחרים כולל מונוציטים הנגזרים שחדר מקרופאגים. הבנה אם קיימים הבדלי ultrastructural בין תאים אלה יספקו נקודת התחלה עבור ניתוח של הבדלים תפקודיים. שילוב סמנים מהונדס או ביטוי סלקטיבי קלם מאפשר detשיקוף של תכונות ultrastructural סלקטיבית לאוכלוסיות ספציפיות.

אבחון & מצגת וחינוך - עצם העובדה שאנו רואים ננומטריים כדי microscale בתוך נתונים EM במערך יחיד הוא הקל מאוד לקהל הרחב. עם מגוון אפשרויות וכלים המוגברים EM גומל בקנה מידה גדול אנו צופים התעוררות של EM במחקר בסיסי רפואי. השיטה שלנו מיוצג כאן מוחל מודל פגיעה מוחית דג הזברה 5, אבל נעשה שימוש על רקמה אנושית 7, עכברוש המוח 3, במודל חולדה לסוכרת 4 וב תרבית תאים 2, והוא יכול לשמש גם בשילוב עם TEM גישה מבוססת 1 מראה את הרבגוניות של שיטה זו. מפעיל מיקרוסקופ כבר לא הקלטה שנבחר מאוד, ולכן תמונות מוטות, אבל כל תכונות ultrastructural הרבות נרשמות ופתוחות לניתוח ברחבי עולם.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

רוב העבודה שבוצע במרכז המיקרוסקופי והדמית UMCG (UMIC), אשר ממומן על ידי NWO 175-010-2009-023 ו ZonMW 91,111,006; STW "עמק מיקרוסקופי 12718" כדי BNGG. עבודה זו מומנה על ידי מענק ZonMW Veni, מענק אינטגרציה הקריירה מארי קירי (חיסכון למות נוירונים) ו המילגה אלצהיימר Nederland כדי TJvH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
low melting point agarose VWR 444152G
tricaine Sigma E10521
triton-X-100 Sigma X100
glutaraldehyde Polysciences 1909
sodium cacodylate Sigma C0250
osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19114
potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) Merck 4984
ethanol VWR 20821.365
uranyl acetate  Merck 8473
sodium tetraborate Merck 1063808
toluidene blue Merck 1273
basic fuchsin BDH 340324
lead citrate BDH discontinued
EPON
2-dodecenylsuccinicacid anhydride  Serva 20755
methylnadic anhydride Serva 29452
glycid ether 100 Serva 21045
DMP-30  Polysciences 553
standard flat embedding mold Electron Microscopy Sciences 70901
diamond knife Diatome Inc.
copper grids  Electron Microscopy Sciences
double sided carbon tape  Electron Microscopy Sciences
scanning EM Zeiss Supra55 Zeiss
ultramicrotome Leica EM UC7 Leica
atlas external scan generator  Fibics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faas, F. G., et al. Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps. J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).
  2. Kuipers, J., et al. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Res. 360, 61-70 (2015).
  3. Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Lindsey, L. F., Harris, K. M. Automated transmission-mode scanning electron microscopy (tSEM) for large volume analysis at nanoscale resolution. PLoS One. 8, e59573 (2013).
  4. Ravelli, R. B., et al. Destruction of tissue, cells and organelles in type 1 diabetic rats presented at macromolecular resolution. Sci Rep. 3, 1804 (2013).
  5. van Ham, T. J., et al. Intravital correlated microscopy reveals differential macrophage and microglial dynamics during resolution of neuroinflammation. Dis Model Mech. 7, 857-869 (2014).
  6. Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 15477, 202-207 (2015).
  7. Sokol, E., et al. Large-Scale Electron Microscopy Maps of Patient Skin and Mucosa Provide Insight into Pathogenesis of Blistering Diseases. J Invest Dermatol. 135, 1763-1770 (2015).
  8. de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up! Nat Methods. Nat Methods. 12, 503-513 (2015).
  9. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12, 51-54 (2015).
  10. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
  11. Oosterhof, N., Boddeke, E., van Ham, T. J. Immune cell dynamics in the CNS: Learning from the zebrafish. Glia. 63, 719-735 (2015).
  12. van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22, 830-836 (2012).
  13. Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304, 811-824 (2007).
  14. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).
  15. van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB J. 24, 4336-4342 (2010).
  16. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J Cell Biol. 17, 208-212 (1963).
  17. Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
  18. Stensaas, L. J., Reichert, W. H. Round and amoeboid microglial cells in the neonatal rabbit brain. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 119, 147-163 (1971).
  19. Mori, S., Leblond, C. P. Identification of microglia in light and electron microscopy. J Comp Neurol. 135, 57-80 (1969).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 111 מיקרוסקופית אלקטרונים בקנה מידה גדול סריקה EM nanotomy דג הזברה EM כמותי מיקרוסקופיה בקורלציה
סריקה הילוכים בקנה מידה גדול מיקרוסקופית אלקטרונים (Nanotomy) של בריאה ונפצעו דג הזברה המוח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuipers, J., Kalicharan, R. D.,… More

Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (111), e53635, doi:10.3791/53635 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter