Summary
このプロトコルは、細胞シグナル伝達研究やバイオマーカー検出の潜在的なアプリケーションと大規模の製造、多重化された二次元のDNAまたは抗体配列を、概要を説明します。
Introduction
抗体マイクロアレイは、広くタンパク質バイオマーカー1-3を含む標的タンパク質の存在を調べるために何十年もプロテオミクス研究に使用されています。このフィールドは現在、質量分析（MS）のような他のハイスループット技術から大きな課題に直面しているが、これらのデバイスは、他のアッセイと、単純なデータ解釈と簡単なインターフェイスを提供する主な理由は、まだ抗体マイクロアレイの有用性の余地があります。近年では、マイクロチップの足場へのマイクロアレイの統合は、抗体マイクロアレイを4-7を繁栄するための新しい機会を提供してきました。例えば、単一の細胞マイクロチップに組み込まれたバーコードのマイクロアレイは、細胞コミュニケーション研究8,9で使用されています。この技術は、他の利用可能なマイクロアレイ技術上の独特の利点を有します。従来のマイクロアレイelemenで使用される典型的な150μmのサイズよりもはるかに小さい10-100ミクロンで配列要素を備えていTS。より小さな配列要素の構造は、系統的なフローパターン化手法を用いて達成され、これは、単一細胞の分泌タンパク質及び細胞内タンパク質を検出することができるコンパクトなマイクロアレイを生じます。もう一つの利点は、単純な楽器フリーのセットアップを使用することです。ほとんどの研究所や中小企業は、マイクロアレイコア施設にアクセスすることができないかもしれないので、これは特に重要です。このようなバーコードの抗体マイクロアレイは、強化されたアッセイのスループットを備え、従来のサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA 8）のそれに匹敵する高い感度と特異性を達成しながら、単一の細胞上に高度に多重化されたアッセイを実行するために使用することができます。この技術は、腫瘍細胞の13膠芽細胞腫9-11からのタンパク質、T細胞12を検出し 、そして循環中の多数のアプリケーションを発見しました。あるいは、単独でバーコードDNAマイクロアレイは、模倣のために、ニューロンおよび星状細胞の正確な位置決めに利用されています脳組織14 の in vivoでのアセンブリをる。
このプロトコルは、実験工程と、流体試料中の単一細胞中のバイオマーカーの検出において潜在的な用途を有する二次元（2-D）バーコード、抗体マイクロアレイの構築ブロックに焦点を当てます。技術は、アドレス可能な一本鎖、一次元（1-D）DNAマイクロアレイに基づいてガラス基板上に、空間的にパターニングされた直交するオリゴヌクレオチドを用いて構築しました。並列流路を流れパターニング工程において使用される場合、1次元パターンが形成され、このようなパターンは、1-D統一商品コード（UPC）バーコードと視覚的に類似した離散的なバンドとして現れます。 2-Dの建設（N×M個）抗体アレイ- 2-Dクイックレスポンス（QR）マトリックスコードを連想させるには-より複雑なパターン化戦略を必要とするが、より高い密度8,15での抗体の固定化を可能にします。製作第二に垂直な第一のパターンで、二つのDNAパターニング工程を必要とします。これらの二つのパターンの交点は、アレイのn個のx m個の要素を構成しています。戦略フローパターニングに利用一本鎖DNA（ssDNA）の配列を選択することにより、所与の配列内の各要素は、特定のアドレスが割り当てられます。この空間参照は、マイクロアレイスライド上の蛍光シグナルを区別する必要です。一本鎖DNA配列をDNAにコードされた抗体ライブラリー（DEAL 16）と呼ばれるプラットフォームを形成し、相補的DNA抗体コンジュゲートの取り込みを介して抗体の配列に変換されます。
このビデオプロトコルは、2つの方向で準備を含むn×m個抗体アレイポリジメチルシロキサン（PDMS）、バーコードの型、フロー・パターニングのssDNAを作成し、抗体-オリゴヌクレオチドディール複合体を調製し、3に3×3のDNA配列を変換する際に重要なステップを説明×3抗体アレイ。
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Protocol
注意：このプロトコルで使用されるいくつかの化学物質は刺激物であり、皮膚との接触の場合には危険です。材料安全データシート（MSDS）を参照してくださいし、このプロトコルを実行する前に、適切な保護具を着用します。ステップ（1.1.1）において使用されるピラニア溶液は、非常に腐食性であり、そして攪拌しながら酸をゆっくりと過酸化物を添加することにより調製されるべきです。ヒュームフードで細心の注意を払ってこのソリューションを処理します。適切な眼の保護および耐酸性手袋を使用してください。トリメチルクロロシラン（TMCS）は（1.1.6）の後に任意の工程で使用される腐食性、可燃性の化学物質です。ドラフト内でこの化学物質を処理します。
注意：粒子状物質による汚染を最小限にするためにクリーンルーム内でのバーコードスライド製造および臨界流パターニングの手順を実行します。ダスト粒子は、PDMSモールドのポートとマイクロチャネルを遮断し流れパターン形成を妨害し得ます。
ワンdimensiona 1.建設リットルのDNAバーコードのスライド
- バーコードフローパターンに対するSU-8マスターの調製
注：垂直フローパターンための図（ 図1A-B）は、コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して作成されます。これらのパターンは、クロムフォトマスク上に描画されます。マスクの透明領域は、SU-8マスターの特徴に対応します。- 96°Cに加熱し、1〜30％のH 2 O 2（ピラニア溶液）：完全に3 H 2 SO 4の混合物でシリコンウエハ（直径100mm）をきれい。脱イオン水およびイソプロピルアルコールでウエハを洗浄し、窒素ブローガンで乾燥しました。
- ウエハ上のSU-8 2025フォトレジストの約4ミリリットルを注ぎます。均一3,000rpmで、30秒、500 rpmで10秒間、ウエハ上のフォトレジストを広げるために、プログラム可能なスピンコーターを使用してください。これは〜25μmの厚さのフォトレジスト層を作成します。徐々に停止する前に減速し、紡糸できるように - これは舞にありますあっても、ウェハの表面上のコーティングntain。
- その後、95℃で5分間、65℃で1分間ホットプレート上にコーティングされたウェハ、焼きます。このステップでは、コーティングが固化することができます。 5分間室温に冷却。
- フォトレジストコート上クロムマスク（ 図1C）を配置します。 20秒間の近紫外光（350〜400ナノメートル、露光エネルギー150-160ミリジュール/ cm 2）でのマスク機能を公開します。
注意：クロムマスクのデザインを50μmピッチで20ミクロン幅で、それぞれが20チャンネルが含まれています。チャネルは、反対側の端部へのパターンの一方の端部から巻線されています。要するに、20チャンネルが〜40 mmで〜20mmの幅の長さの長方形の領域をカバーします。各チャネルは、入口と出口に対応する2つの円形の特徴が隣接しています。入口と出口には互換性があります。 - 95℃で5分間、ホットプレート上で露光されたウエハを焼きます。徐々に室温まで冷却します。
- 撹拌しながら、SU-8現像液にウェハを浸し5分間。イソプロピルアルコールに続く新たなSU-8の開発者の小さな部分を有するウェハを、洗浄します。窒素ブローガンを用いてウェハを乾燥させます。 30分間200℃のホットプレート上のウエハベークハード、ウエハを室温に徐々に冷却します。
注：白色フィルムはこの工程での洗浄の後に観察された場合の開発はより長い時間行うことができます。
オプション：10分間閉じたペトリ皿に蒸気をトリメチルクロロシランに曝すことにより、SU-8マスターSilanize。
- PDMSバーコード型の調製
- 4.0グラムの硬化剤と40.0グラムのシリコーンエラストマーベースを組み合わせます。 10分間激しくプレポリマー混合物を攪拌します。真空下で20分間ドガ。
注：1（ベース：硬化剤）の質量比が一般的なルールとして、10を使用します。 - バーコードパターンのSU-8マスターを有するシリコンウェハを含むペトリ皿にプレポリマーを注ぎます。 PDMS混合物の高さは約7.5ミリメートル以上である必要があります。ペトル中の混合物を脱気私は、PDMSを硬化させるために75℃で1時間、混合物を焼くその後、残りの気泡を除去するために二度目の一品。
注：これは、ステップでPDMSモールドの穴にピン/チューブの挿入時に、PDMS-ガラス結合にあまりテンションを加えることを避けるために〜7.5ミリメートル以上で、PDMSスラブの十分な厚さを維持することが重要である（1.3.3.1） - メスを使用して、慎重にバーコード型の機能が含まれており、ウエハからスラブをはがしPDMSスラブの領域の周囲にカット。
- PDMSのバーコード型の所望の形状を得るために、スラブのエッジをトリム。プランジャーで生検パンチを使用して金型を介して20穴（1.0 mmの直径）をパンチ。穴がバーコードパターンの円形の特徴の位置が合っていることを確認します。これらの穴は、入口と出口としての役割を果たす。
- 4.0グラムの硬化剤と40.0グラムのシリコーンエラストマーベースを組み合わせます。 10分間激しくプレポリマー混合物を攪拌します。真空下で20分間ドガ。
- ポリ-L-リジンの一次元パターニング（PLL）
- 窒素ブローガンを使用して、ポリ-L-リジンコートスライドガラスの表面についたほこりを取り除きます。 ATTACH清浄なスライドガラスにPDMSモールド。金型とスライドのエッジが整列していることを確認してください。
- PDMSモールドとPLLコートスライドとの間の結合を強化するために75℃で1.5時間焼きます。一方、（0.5mmの内径および1.5mmの外径を有する、4インチ片に3）柔軟なポリエチレン管の20個を準備します。
注意：チューブの個数は、PDMSバーコードの型に注入口の数に対応します。チューブは、カップルに圧力調整器を装備した窒素ガスのタンクへのPDMSのバーコード型のチャネルを提供しています。 - チューブの各部分の一端に、ステンレス鋼中空ピン（1 mmの直径）を添付してください。吸引滅菌濾過チューブを1cm以上が溶液で満たされるまで、ポリ-L-リジンピンを通して溶液。
- PDMSのバーコード型（ 図1E）のインレットに（溶液で満たされたチューブに接続された）ピンを固定します。にチューブのもう一方の端を取り付けます圧力調整窒素タンクのセットアップ。解決策は、少なくとも6時間、0.5〜1 PSIの圧力範囲を使用して金型を通って流れることを可能にします。
注：すべてのフローパターン化手順については（1.3.3）のステップを参照してください。
- PDMSのバーコード型（ 図1E）のインレットに（溶液で満たされたチューブに接続された）ピンを固定します。にチューブのもう一方の端を取り付けます圧力調整窒素タンクのセットアップ。解決策は、少なくとも6時間、0.5〜1 PSIの圧力範囲を使用して金型を通って流れることを可能にします。
- ssDNAを14の一次元のパターニング
注：後続のステップで使用されるリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を137mMの塩化ナトリウム、10mMののNa 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4緩衝液のpHは7.4から調製されます。- PBS中の2 mMのビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）溶液を調製します。 PBSまたは超純水にA、B、Cの一本鎖DNA（5'-アミンは、80個のヌクレオチドを修飾された）の300μMの溶液を調製します。
注意：N個のヒドロキシスクシンイミドエステルは、簡単に加水分解を受けるため、製造後約30分以内BS3ソリューションを使用してください。 - 2 mMのビス（sulfosuccinimの2.5μlの300μMのA、B、またはCのssDNAの2.5μLを組み合わせます各チャンネルのPBSでidyl）スベレート。A、B、及びC DNAをそれぞれ、チャネル1、2に指定され、3ています。この順序は、3チャンネル（ 図2A）の残りのセットにも適用されます。
- ステップ（1.3.3）を実行します。この時間は、窒素源に結合PDMSモールドを、次いで、ステンレス鋼のピンを介して、ポリエチレンチューブに、5μlのBS3 / DNA溶液を吸引します。 BS3 / DNA溶液を約40分間またはチャネルが満たされるまでにバーコードの金型を通って流れることができるようにします。
- 一度、すべてのチャネルが満たされているフローを停止し、その後、室温で2時間のバーコードでBS3 / DNA溶液をインキュベートします。解決策が枯渇しないようにしてください。 75℃で1時間付されたバーコードのスライドとPDMSモールド焼きます。
注：続くフローパターニング工程で位置合わせを容易にするために、バーコード・スライド上のチャネルパターンのエッジが概説されてもよいです。これは、慎重にダイヤモンドのScribを用いてガラス表面を引っ掻くことによって行われますガラススライドの底部上のアライメントマーカを生成するために、E。プロトコルの後の段階でのアライメントは、顕微鏡下でチェックすることができます。 - バーコードのスライドからPDMSモールドを削除します。超純水で1回と3回、0.01％SDSで軽くスライドを洗浄します。
- 顕微鏡スライドスピナーを使用して、バーコードのスライドを乾燥させます。その後の使用のためのクリーン50mlの遠心管のバーコードのスライドを保管してください。
- PBS中の2 mMのビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）溶液を調製します。 PBSまたは超純水にA、B、Cの一本鎖DNA（5'-アミンは、80個のヌクレオチドを修飾された）の300μMの溶液を調製します。
バーコードのスライド上の一次元パターンの2検証
注：この検証プロトコルは、その後のフローパターニング工程の品質を評価する際に使用するために適合させることができます。
- スライドのブロッキング
- PBS中の1％ウシ血清アルブミン（BSA）を準備します。使用前に0.45μmのシリンジフィルターを通して、このソリューションをフィルタリングします。ゲルローディングチップを用いて、バーコードスライドの一方の端部に1％のBSA溶液50μlを加えます。
- 1％のBSA solutをインキュベートRTで1時間イオン。
- シアニン3（Cy3の）とのインキュベーションは、相補的DNAを抱合しました
- A '、B'のカクテルを用意し、C 'オリゴヌクレオチドは、一方の端部でのCy3とコンジュゲート。 '、B'、およびC 'Aの配列は、それぞれ、A、B、およびCのものと相補的です。たCy3-DNAの使用濃度は、0.1％のBSAで0.05μMです。
- スライドの同じエッジ上のDNAカクテル溶液の30μLを適用した後、ピペットでスライドからBSA溶液を除去します。 1時間室温でスライド上のCy3-DNAカクテルをインキュベートします。光退色からのCy3部分を保護するために暗所でこのインキュベーションステップを実行します。
- 蛍光強度の分析
- Cy3-DNAカクテルをピペットで、1％のBSAでスライドを洗浄し、PBS、そして最終的に希釈したPBS（1 Pで50部品の超純水を当PBS）。スピナーを用いてスライドを乾燥させます。
- 蛍光顕微鏡またはマイクロアレイスキャナーを用いて蛍光（ 図2B）を観察します。マイクロアレイスキャナーを使用する場合は、532nmで、5ミクロンの画素サイズは、15％での光電子増倍管（PMT）450でゲインと電源にレーザ発振波長を設定します。
2次元（3×3）DNAアレイ14の3製作
- PDMSバーコード型の調製
- 別のSU-8マスターを構成するが、この時間は、最初の設計のものに垂直な流れパターンをクロムマスクを使用する手順（1.1）を実行します。垂直パターンで新しいPDMSモールドを構築するための手順（1.2）を実行します。
- 一本鎖DNAの二次元流れのパターニング
- 3×3アレイの場合、A'-I、B'-II、C'-III、A'-IV、B'-V、C'-VI、A'-VII、Bの150μMのストック溶液を準備'-viii、および3％BSA / PBSでC'-IXの DNA。これらのオリゴヌクレオチドは、「ブリッジング配列」（ 図2A）として機能します。オリゴヌクレオチド溶液（溶液1〜3）作業濃度は、各オリゴヌクレオチドのために、50μMであるように結合します。 表1に設けられたガイドを使用してください。
- 0.5 psiで1時間、全20チャンネルに3％BSA / PBSブロッキング溶液を流します。
- それぞれのフローソリューション1、2、およびチャネル1に3,2、および3、。 3チャンネルのセット以降については、この順序に従ってください。フローは、通常、約40分で完了します。 DNAがハイブリダイズすることができるように、2時間室温でDNA溶液をインキュベートします。
- ハイブリダイズしていないDNAを除去するために、0.5 psiで1時間、全20チャンネルに3％BSA / PBSブロッキング溶液を流します。 PDMSスラブをはがし、および希釈したPBS（1部PBSおよび50部の超純水）に続いて、3％BSA / PBSで一回、PBS中二回、中にスライドガラスを浸漬することにより得られたDNAマイクロアレイスライドを洗うこと。 D顕微鏡スライドスピナーを使用してスライドをRY。
- Cy3結合されているi 'は IXには'そのセクション内2.オリゴヌクレオチドと同様の第2の検証ステップ（ 図2C）を実行します。その後の使用のために50mlの遠心管中で3×3アレイスライドを保管してください。
注：DNAマイクロアレイは、数ヶ月のために、デシケーター中、室温で保存することができます。
抗体配列に3×3のDNA配列の4の変換
- 抗体、オリゴヌクレオチド（DEAL）コンジュゲートの調製
- 200mMのスクシンイミジル-4-ホルミル安息香酸（S-4FB）および無水Nで40 mMのスクシンイミジル-6- hydrazinonicotinamide（S-HYNIC）、N-ジメチルホルムアミド （DMF）の溶液を調製します。
- PBS中の捕捉抗体の7別々の溶液（1 mg / mlの）まで準備します。
注：抗体のストック溶液は、アジ化ナトリウムの静菌が含まれている場合、スピン脱塩cを使用して、PBSで緩衝液交換を行います7 kDaの分子量カットオフ（MWCO）とolumns。 - I '、II'、III '、IV'、V '、VI'、およびVII 'DNAの別々の400μMの溶液を調製します。 1オリゴヌクレオチド配列に、各捕捉抗体を割り当てます。マイクロ遠心チューブ中のDMFの12.25μlの400μMDNAを40μlのを結合し、完全に混合するためにスピンダウン。
- 各DNA / DMF溶液に、DMF中の200 mMのS-4FBの2.3μlを添加します。捕捉抗体の各100μgのために、DMF中の40 mMのS-HYNICの2.25μlを添加します。
- 抗体/ S-HYNIC、室温で4時間DNA / S-4FBソリューションをインキュベートします。
- 抗体DNAのカップリング反応のための調製において、pH6でクエン酸緩衝液でそれらを洗浄することにより、新しいスピン脱塩カラム（各抗体について、各DNA溶液について1つずつ）を調製。
- インキュベーションの4時間後、各抗体/ S-HYNICとDNA / S-4FB液のバッファー交換を行います。 S-4FB共役を組み合わせます
- 4℃で反応O / Nインキュベートします。
- 抗体 - オリゴヌクレオチド（DEAL）複合体の精製
注：たSuperose 6 10/300 GLカラムを備えた標準FPLCシステムに高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）を行い、抗体 - オリゴヌクレオチド複合体を精製します。- 280 nmのFPLCシステムのUV検出器の波長を設定します。過剰のS-4FB-DNAからの抗体 - オリゴヌクレオチド複合体を分離するために、0.3ミリリットル/分でPBS（pH7.4）でのアイソクラティックフローを使用してください。
- コンジュゲートを含有する画分をプールし、10kDaのMWCOをスピンフィルターを使用して150μlの容量に画分を濃縮します。
- 抗体の二次元パターニング
- マイクロチャンバーまたはマイクロウェル私たちと一緒に別のPDMSモールドを準備ステップる製造手順（1.2）。 PDMSモールドは、イムノアッセイのためのナノリットルウェルにマイクロリットルを含有することができます。
注：流体試料中の一般的なバイオマーカーの検出のために、複数のウェルを有するPDMSモールドは、アレイスライドと交配されます。 PDMSモールドの特徴が検討されているシステムに依存します。例えば、単一の細胞実験からのタンパク質の検出は、0.15-NL体積のマイクロチャンバを含むPDMSモールドを用いて行うことができます。 - （オプション）、そのパターン化された表面を親水性にするために1.5分間プラズマにPDMSモールドクリーニング（18 W）を件名。プラズマ洗浄の前に、直接3×3アレイスライドに結合される他のすべての面をブロックするように粘着テープを使用しています。
注：ステップ（4.3.2）は任意であるが、PDMSモールドは、単一細胞実験での使用を意図されている場合、通常行われています。 - PBS中の1％BSAでスライドをブロックし、その後、3×3アレイスライドとPDMSモールドメイト。室温で1時間インキュベートします。 Meanwhiル、抗体 - オリゴヌクレオチド結合体のカクテル（200μlの最終容量）を準備します。各コンジュゲートの使用濃度は、1％BSA / PBS中10μg/ mlです。
- その後、それによって抗体の配列へのDNA配列を変換し、複合体のオリゴヌクレオチド部分の3×3アレイ上の特定のスポットにハイブリダイズすることができるように、37℃で1時間インキュベートし、抗体-オリゴヌクレオチドカクテルを加えます。
- スライドをきれいにし、乾燥させる手順を繰り返し（3.2.4）。抗体アレイがすぐに使用された場合に最も高い感度を達成することができます。長期保管は、感度の低下をもたらすことができます。
- マイクロチャンバーまたはマイクロウェル私たちと一緒に別のPDMSモールドを準備ステップる製造手順（1.2）。 PDMSモールドは、イムノアッセイのためのナノリットルウェルにマイクロリットルを含有することができます。
- タンパク質の検出
- 組換えタンパク質を再構成するか、濾過した細胞サンプルを準備します。
- カスタムデザインのチップをマイクロアレイメイト、そして1時間、PBS中の3％BSAで表面をブロックします。その後、BSA溶液を除去し、サンプルを適用し、2時間インキュベートします。
- PBS中3％BSAを用いてサンプルを洗浄3回その後、製品データシートによって提供される濃度で検出抗体を加えるdは。 2時間インキュベートします。
- PBSで3回、3％BSAにより検出抗体を洗い流し、次いで、1時間インキュベートしたを1μg/ mlで - ストレプトアビジンシアニン5（Cy5の）を加えます。
- スキャン用のスライドをきれいにし、乾燥させる手順を繰り返し（3.2.4）。
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Representative Results
PDMSモールド（ 図1A-1B）のデザインは、CADプログラム（AutoCADの）を使用して描かれました。フローパターニングのための機能チャネルを示す2つのデザイン、水平および垂直方向の1 1。各デザインの左右の部分が対称的です。それらのいずれかは、入口または出口である可能性があります。 20チャネルの各々は、一端から他端にはすべての方法を巻いています。各デザインは、クロムフォトマスク（ 図1C）に印刷されています。ウェハ上に作製SU-8マスターは、 図1Dに示されています。 PLLまたはDNAのフローパターン形成を容易にするために、PDMSモールドは、窒素ガス流のセットアップ（ 図1E）に結合させました。
このプロトコルで使用される3流パターニング工程があります。後続のステップは、オリゴヌクレオチド溶液を導入しながら、両方の最初のステップは、ガラス基板上にPLLを固定します。 表1、oligonucleでソリューション1-3のotide組成物が与えられています。各オリゴヌクレオチドの使用濃度は、50μMであり、各溶液の総量は39μlです。これらのソリューションは、各オリゴヌクレオチドストック溶液（150μM）の13μLを混合することにより調製されます。
パターン化されたDNAマイクロアレイ装置は、全体をスライドガラスを横切って反復と隣接しています。 3×3のマイクロアレイについては、最大濃度は、一枚のガラススライド上に約400,000のスポットです。市販のDNAマイクロアレイとのサイドバイサイドの比較は、Cy3のへの結合は、相補DNAをタグ付けされたときに私たちの技術は、約5倍の感度であることが明らかになりました。パターン化されたDNAは、複数の反復全体の約5％の変動が比較的均一です。生物学的サンプルからタンパク質含量を測定する場合、これらの機能は、当社の技術の高い定量性をお約束します。また、流路のデザインと組み合わせたDNAの直交性はflexibiliを提供しています種々の形状でパターニングのTY（ 図2D）。
図3（c）に示すように 、DNA-抗体コンジュゲート（ 図3B）とのハイブリダイゼーションを介して抗体配列にDNA配列を変換した後、得られた抗体のパネルは、主にサンドイッチELISAプラットフォームを介して、多重化された検出に使用されます。サンドイッチELISAで、ビオチン化検出（二次）抗体が捕捉されたタンパク質に結合し、蛍光団結合ストレプトアビジンとのその後の標識は、蛍光ベースの検出（ 図3C-E）を可能にします。タンパク質ショー<スライドガラス（ 図3D）の一端から他端まで10％の変動を検出します。 1つの配列リファレンスとして要素（のCy3標識）および陰性対照として別の要素を割り当てる際、3×3アレイでは、我々は、7タンパク質まで検出することができます。例えば、実行のために単一細胞実験で腫瘍学、タンパク質、インターロイキン6（IL-6）、マトリックスメタロペプチダーゼ9（MMP9）、肝細胞増殖因子（HGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、インターロイキン8（IL-8）、およびマクロファージ遊走阻止因子単一細胞からの（MIF）は、（ 図3E）を同時に検出することができます。
また、様々な濃度で組換えタンパク質を使用してシステムをキャリブレーション。 図3Fにおいて、組換えタンパク質のインターフェロンγの較正曲線（IFN-γ）、腫瘍壊死因子α（TNFのα）、インターロイキン13（IL-13）、腫瘍壊死因子β（TNFのβ）、グランザイムB、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン8（IL-8）が示されています。検出感度があっても、基板上のDNAと、おそらく抗体のより高い負荷とウェルプレート上で、従来のサンドイッチELISAの場合と全く同様です。
バーコード不格好なやつYマイクロアレイは、流体試料中の、ならびに単一細胞中のバイオマーカーを検出するために用いることができます。単一細胞分析は、このプロトコルの焦点ではないので、単純に、サイトカインの検出に3×3の抗体マイクロアレイの適用を例示します。抗体表面マーカーの相互作用を介して、分化8のクラスター（CD8）陽性細胞は、マイクロアレイ要素（ 図3G;上のPDMSチップ）のいずれかで捕捉され、残りの要素は、分泌されたサイトカインを検出するために使用しました（ 図3H）。この細胞捕捉方法では、「セル・アレイは、「形成することができます。このアレイの捕獲技術は、各ELISA実験に供した細胞の数を制御することを可能にします。検出されたタンパク質は、特定の単一の細胞にに関するものであったように、細胞は、物理的にマイクロチャンバーに分離しました。 図3Hには、各マイクロチャンバーがのカプセル化を確実にするために16マイクロアレイ要素を備えていることが示されています完全な3×3のマイクロアレイセット。
図1 の設計とフローベースのDNAのパターニングのためのバーコードPDMS鋳型の製作。パネル（A）は、水平方向および垂直方向の一次元バーコードのパターンのためのAutoCADの図面を示しています。パネル（B）は （A）から重畳水平および垂直のバーコードパターンを示す図です。グリーンボックスは個別の3×3のアレイでパターン化領域を囲みます。 （C）SU-8マスターを製造するためのクロムマスク。 （D）シリコンウエハー上に製造さSU-8マスター。 （E）フローパターニングのためのセットアップ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. 構築と 3×3 のDNA配列 の検証は 。この図は、王、J。 ら 、2012、 ナノレット 12によって"、神経膠芽腫多癌細胞への応用と細胞間相互作用の機能を定量する」から変更されています。 米国化学会著作権2012。許可を得て適応。DNAフローパターニング工程のための（A）スキーム。 （B）1次元バーコードの（縦線によってトレース）選択した領域で20チャンネルの蛍光強度プロフィール。 Cy3結合オリゴヌクレオチドは、検証のためのDNA配列とハイブリダイズさせました。第二のDNAパターニング工程が完了した後にCy3結合DNAで検証アレイの（C）の蛍光強度プロフィール。 （D）は、異なるFLからの代替蛍光パターンOW-パターニング戦略。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
3×3 のマイクロアレイ の応用 図3（A）スキーム抗体-オリゴヌクレオチドDEALコンジュゲートの合成のため。抗体-オリゴヌクレオチド結合体とのハイブリッド形成による抗体アレイへのDNA配列の変換のための（B）スキーム。サンドイッチELISAプラットフォームに3×3のマイクロアレイを利用するための（C）スキーム。この図は、王、J。 ら 、2012、 ナノレット 12によって"、神経膠芽腫多癌細胞への応用と細胞間相互作用の機能を定量する」から変更されています。著作権20米国化学会で12。許可を得て適応。パネル（D）は、Cy5のチャネルの下で発生した蛍光の読み出しを示しています。これは、6タンパク質を検出したサンドイッチELISA実験に対応しています。パネル（E）は、Cy3およびCy5のチャンネルの下に3×3アレイの読み出しのズーム・インプロファイルです。パネル（F）は、組換えタンパク質のためのサンドイッチELISAの検量線を示しています。パネル（G）は 、アレイ上の抗体との結合を介して細胞を捕捉することによって形成された「セル配列」を示しています。パネル（H）は 、マイクロチップ内のマイクロチャンバーを重畳した検出結果を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 溶液 | オリゴヌクレオチド組成 | A'-I、B'-II、C'-III |
| 2 | A'-IV、B'-V、C'-VI |
| 3 | A'-VII、B'-VIII、C'-IX |
DNAフローパターニングのためのソリューション1-3の表1の組成物。
| アンカーシーケンス | |
| A | ATCCTGGAGCTAAGTCCGTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATCCTGGAGCTAAGTCCGTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA |
| B | GCCTCATTGAATCATGCCTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GCCTCATTGAATCATGCCTA- |
| AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA | |
| C言語 | GCACTCGTCTACTATCGCTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GCACTCGTCTACTATCGCTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA |
| ブリッジングシーケンス | |
| A'-I | TACGGACTTAGCTCCAGGAT-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATGGTCGAGATGTCAGAGTA |
| B'-II | TAGGCATGATTCAATGAGGC - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA、ATGTGAAGTGGCAGTATCTA |
| C'-III | TAGCGATAGTAGACGAGTGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATCAGGTAAGGTTCACGGTA |
| A'-IV | TACGGACTTAGCTCCAGGAT-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GAGTAGCCTTCCCGAGCATT |
| B'-V | TAGGCATGATTCAATGAGGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATTGACCAAACTGCGGTGCG |
| C'-VI | TAGCGATAGTAGACGAGTGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-TGCCCTATTGTTGCGTCGGA |
| A'-VII | TACGGACTTAGCTCCAGGAT-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-TCTTCTAGTTGTCGAGCAGG |
| B'-VIII | TAGGCATGATTCAATGAGGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-TAATCTAATTCTGGTCGCGG |
| C'-IX | TAGCGATAGTAGACGAGTGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GTGATT AAGTCTGCTTCGGC |
| 検証のためのCy3結合オリゴヌクレオチド | |
| A ' | TACGGACTTAGCTCCAGGAT |
| B ' | TAGGCATGATTCAATGAGGC |
| C ' | TAGCGATAGTAGACGAGTGC |
| 私' | TACTCTGACATCTCGACCAT |
| II ' | TAGATACTGCCACTTCACAT |
| III ' | TACCGTGAACCTTACCTGAT |
| IV ' | AATGCTGGGGAAGGCTACTC |
| V ' | CGCACCGCAGTTTGGTCAAT |
| VI ' | TCCGACGCAACAATAGGGCA |
| VII ' | CCTGCTCGACAACTAGAAGA |
| VIII ' | CCGCGACCAGAATTAGATTA |
| IX」 | GCCGAAGCAGACTTAATCAC |
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Discussion
フローパターン設計は、2-Dのマイクロアレイの製造における最初の重要なステップです。ガラス基板上に2つの重複DNAパターンを生成するために、最初の設計のチャネルの特徴は、第二の（ 図1A-B）のものに対して垂直であるべきです。デザインはまた、マイクロアレイの下流の適用を検討してください。単一細胞分析の場合には、マイクロアレイは、したがって、チャネルの寸法が2次元配列と整列マイクロチャンバとの互換性が作られている、マイクロチャンバー内に封入単一細胞からタンパク質を検出するために使用されます。各設計は、フォトマスク上にレンダリングされ、標準的なフォトリソグラフィ技術は、シリコンウェハ（ 図1C-D）でSU-8のチャネルの機能を製造するために使用されます。これは、成形PDMSのマスターとして機能します。金型が製造されたら、それはPLLでコーティングしたスライドに接着した後、窒素ガス流のセットアップ（ 図1E）と結合されます。セットアップたち使用が簡単であり、容易に圧力調整窒素ガス源と、任意の実験室に組み込まれるという利点を有します。我々は、窒素ガスのタンクに接続された安価な複数の3方向弁のアセンブリを使用します。パターニングのための空気の流れは、金型からスライドガラスの層間剥離を回避するために低い圧力（0.5 PSI）に維持されなければなりません。 PDMSモールド内の漏れは、パターンの完全性を損なうことができます。
このプロトコルにおけるDNAフローパターニング工程は、厳選された直交シーケンス（ 図2A）と一本鎖DNAを利用しています。パターニングを流す前に、これらのオリゴヌクレオチドの固有の配列は、クロストークがないことをテストする必要があります。クロストークのための簡単なテストは、我々のプロトコルで紹介する検証手順（ステップ2）を変更することによって行われます。代わりにCy3でタグ付けされた相補的なDNAのカクテルを使用するのではなく、相補的な配列のいずれか一方のみのタイプはどの複数のスライドを選択した領域の時に使用されますDNA配列は、固定化されます。 DNA（1次元DNAアレイのための）クロストーク、一つだけのストライプが存在しない場合には、（2次元DNAアレイのための）一つの場所は、Cy3のフィルタの下に蛍光性でなければなりません。徹底的に検証され、直交配列の例は、材料および装置の表に記載されています。第一のDNAパターニング工程は、「アンカー」オリゴヌクレオチドの3種類を紹介します。これらの80-ntの配列は、2つのユニークな20量体配列と交互に2つの20量体ポリA領域から構成されています。これらのアンカー配列上の5'-アミン修飾は、アミン対アミンBS3によって媒介されるPLLと17を架橋するために必要です。第二のDNAのパターニング工程は、架橋剤を必要としません。このステップでは、部分的にアンカー配列とハイブリダイズする「ブリッジ」オリゴヌクレオチドを導入しています。それぞれの60-ntのブリッジング配列は、一つのアンカー配列、20マーポリスペーサー、およびユニークな20量体配列に相補的な20マーの領域からなります。 DNAアレイの検証（FIGUR電子2B-C）はパターニング工程の品質を評価し、交差汚染14を確実にないようにすべてのDNAのフローパターン形成工程の後に行われます。これは、DNAのパターンとハイブリダイズするCy3結合オリゴヌクレオチドプローブを導入することによって行われます。蛍光強度を分析するステップ（2.3.2）において指定されたパラメータを用いて、DNAのパターンは、マイクロアレイを用いて行わ下流イムノアッセイの感度を最大化するために、少なくとも40,000 AUの蛍光強度を示すべきです。検証中に異なるのCy3-DNAセットの戦略的な使用は、8ステップのDNAパターニングの柔軟性を実証し、代替パターン（ 図2D）を生じさせます。均一なパターンを達成するために失敗すると、フロー・パターニング工程で遭遇漏れや（例えばダスト粒子のような）機械的障害物から生じる可能性があります。
抗体 - オリゴヌクレオチドDEALコンジュゲートの調製は、番目の内の別の重要なステップでありますプロトコルです。抗体の選択は、研究中の生物学的システムによって決定されます。共役して使用されるオリゴヌクレオチドは、DNAアレイ上に固定されたものと相補的な配列を持っている必要があります。 S-4FBとS-HYNICリンカーのストック溶液を新たに調製し、加水分解を回避するために、湿気から保たれるべきです。私たちの共役プロトコルで使用されるインキュベーション時間は、抗体と、DNA上の所望の機能を導入するのに十分な長さです。最後のカップリング反応は、唯一のFPLCを介して未反応S-4FBコンジュゲートオリゴヌクレオチドを除去することによってクエンチします。このように、FPLC精製は、コンジュゲーションを完了した直後に実行する必要があります。我々のプロトコルに記載されたシステム、より低い流速（0.2から0.25までml /分）を用いてFPLCを行う際にも、解像度を改善するために使用することができます。コンジュゲートは狭く、高いDNAピーク（17〜20ミリリットルの溶出量）の前に表示されるブロードなピーク（周りの9〜15ミリリットルの溶出量）として溶出されます。私たちは、ソリューションを保存するお勧めしません過剰のS-4FB-DNAとの複合体の、これが過剰に官能DNAとの結合時に抗体における抗原結合部位の損失につながる可能性があるため。 DEALコンジュゲートを用いたサンドイッチELISAの感度、特異性、および再現性は、以前の研究で実証されている。8,9,11,12,16の抗体-DNA複合体の品質を評価するために、複合体は生成するためにDNAアレイ上でインキュベートすることができます続いてタンパク質の検出（ 図3F）の較正曲線を生成するために、サンドイッチELISA実験において使用される抗体配列。これらの較正曲線を生成するために、従来のサンドイッチELISAキットで提供される組換えタンパク質を使用してもよいです。高品質の複合体の使用は、キットのものと同等の線形範囲と検出の下限を生じさせる必要があります。例として、私たちの抗体アレイ（ 図3F）のサンドイッチELISAのためのINFγおよびTNFαのための下限は〜50〜100 pg / mlであり、consistenです従来のサンドイッチELISAキットの製品データシートに示されている〜15-1,000 pg / mlでの線形検出範囲とトン。下流のサンドイッチELISA実験で得られた悪い信号読み出しは、DNAアレイ、あるいは共役溶液中の過剰のDNAの干渉、または、抗体とのssDNAの不完全な結合体の低品質に起因する可能性があります。
抗体アレイ上のサンドイッチELISAを実行するための主要な関心事は、試薬間の信号は、実際の生物学的事象を反映しているかどうかのクロストークが含まれています。私たちは、このプロトコルで使用する直交するDNAは徹底的に0.1％未満のクロストークを持つことが確認されています。したがってイムノアッセイ段階で観察任意のクロストークは、抗体とのELISA試薬から主にあります。配列内の抗体間のクロストークのためのテストは、実際のサンプルのアッセイを実施する前に実行する必要があります。抗体パネルが構築されると、いくつかのサンドイッチELISAの対照実験は、PERFであるべきです検出抗体がなければ抗原がなければ1、2、および3の検出抗体と標識試薬のみ、次の条件でormed。クロストークは、イムノアッセイ段階で観察された場合、抗体対および/またはELISA試薬を交換する必要があります。従来のELISAキットから商業的に入手可能な抗体の使用は、アレイベースのサンドイッチELISA法に適用可能性を保証するものではないことに留意すべきです。
この技術の利点は、安価な製造、ミニチュアサイズ、デザインの柔軟性があります。当社の製造プロトコルは、抗体アレイの多くのユーザーにご利用いただけない場合がありマイクロアレイスポッターを必要としません。流れパターニングセットアップが簡単な実験室で組み立てることができます。フォトリソグラフィ用の機器を装備していない研究室では、我々のプロトコルで当社が提供するCADの設計は、微細加工サービスを提供する企業に転送することができます。従来のマイクロアレイへのダウンサイジング私たちのプロトコルを用いて製造さコンパクトな配列は、単一細胞実験で使用したマイクロチップとの互換性を可能にします。私たちのプロトコルは、第一の抗体の配列への変換の前に一本鎖DNAの配列として配列の生産を提供しています。たssDNAとの予備的パターニングには、多くの利点があります。まず、のssDNAは、このように一本鎖DNA-パターン化スライドは大幅に低下することなく、8,16、少なくとも6ヶ月間デシケーター中に保存することができ、抗体に比べて化学的に安定です。第二に、我々のアプローチは、エンドユーザーが簡単にマイクロアレイを変更することなく溶液中で一緒に選択的結合体を混合することにより、必要なアッセイを選択する柔軟性を提供しています。逆に、従来のタンパク質/抗体アレイは、事前に設計されており、基板上に固定されているので、アッセイの変化は非常に最初からタンパク質/抗体のパターニング/印刷を必要とするであろう。代表的研究では、高スループットのバーコードの抗体マイクロアレイの使用を示しdetectio単一細胞から複数のシグナル伝達タンパク質のN。流れのパターン設計および/または使用されるオリゴヌクレオチドのパターニング溶液を変えることにより、アレイのレイアウトの多くを探索することができます。このアプリケーションの例として、単一細胞からの機能性タンパク質を研究することができます。単一細胞分析用チップは、〜8700マイクロチャンバー、完全な3×3抗体アレイ（ 図3H）に合わせ、各限り多く含まれます。このようなセットアップは、ハイスループット検出を可能にします。マイクロチャンバー中で培養した細胞によって分泌されたタンパク質は、この配列によって検出することができます。多目的なマイクロアレイの設計は、他の一般的なコンポーネント8,15とマイクロアレイを組み合わせた後、血清、細胞溶解物、および単一の細胞からのタンパク質の多重化された検出を可能にします。タンパク質の検出に加えて、3×3の抗体配列はまた、細胞（ 図3G）を捕捉するのに有用です。
このアプローチの主な欠点は、その追加されたCOMPLです従来のマイクロアレイの製造と比較しexity。製造された配列の特定のアプリケーションを考慮しながら、パターニングのためとアレイ設計のための戦略を慎重に概念化されなければなりません。このアプローチはまた、クロストークの検証手順およびテストを含む、重要なステップ数を必要とします。我々のプロトコルを用いて構築し、3×3のアレイは、一度に7タンパク質を検出することに限定されています。しかし、この制限は、より大きなアレイを作成することによって突破することができます。ここで取り上げプロトコルは3×3のマイクロアレイの製造に限定されるものではありません。我々が正常に5×5マイクロアレイ及びアレイ要素の他の寸法を作製することができました。原理的には、他のN×M個の列であれば予備的DNAパターン化配列を作成する際に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、アレイ素子間のクロストークを回避するために直交しているのと同様の技術を用いて製造することができます。拡張配列の作成は、流れによって達成されるpatterniNG NのssDNAの種類は、第二のパターニング工程のための一本鎖DNA配列を架橋するのn X mによって続く最初のDNAのパターニング工程のために固定します。例えば、5×5アレイを作成するために、アンカーは、E'-XXVにA'-Iブリッジシーケンスを利用している間にEを使用することができる配列します。これが唯一のDNA流パターニング工程を利用しているが、フローパターニングプロセスを自動化するために、ロボットプラットフォーム18を開発してきました。 2段階の切り替えが手動で洗浄した最初のパターニング工程、後の最初のPDMSモールドを剥離し、（このステップは希望スライドを乾燥させる必要がありながら、基本的には、同じプラットフォームは、垂直フローパターニングの第二段階に拡張することができます垂直に配向第二のパターニング工程を容易にするために、別のPDMSモールドでスライドを交配する前に、約10分）を取ります。
私たちは、パターン化されたn×mのアレイを製造するための詳細な手順について説明してきましたプロテオミクス研究および細胞シグナリングにおける将来のアプリケーションのための非常に有望で高密度、で抗体を用いました。ここに提示されたプロトコルは、他の目的のために、より精巧なDNA /抗体アレイを構築するためのガイドとして機能することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see Table 2. | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (1.0 mm diameter) | Ted Pella, Inc. | 15110-10 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
References
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