Summary
Dit protocol beschrijft de vervaardiging van een grootschalige multiplex tweedimensionale DNA of antilichaam-array, met potentiële toepassingen in cell signaling studies en biomarker detectie.
Introduction
Antilichaam microarrays zijn op grote schaal gebruikt in proteomics studies decennia de aanwezigheid van gerichte eiwitten, waaronder eiwitten biomarkers 1-3 onderzocht. Hoewel dit gebied die momenteel wordt geconfronteerd met grote uitdagingen van andere high-throughput technologieën zoals massaspectrometrie (MS), is er nog voldoende ruimte voor het nut van antilichaam microarrays, vooral omdat deze apparaten veroorloven eenvoudige interpretatie van de gegevens en gemakkelijke interface met andere testen. De afgelopen jaren is de integratie van microarrays in microchip scaffolds mits het antilichaam microarray een nieuwe kans te gedijen 4-7. Zo heeft de barcode microarray geïntegreerd in een single-cell chip is gebruikt in mobiele communicatie studies 8,9. Deze technologie heeft onderscheidende voordelen boven andere beschikbare microarray technologie. Het beschikt arrayelementen op 10-100 um, veel kleiner dan de typische 150 urn size in gebruikelijke microarray elements. De constructie van kleinere arrayelementen wordt bereikt door systematisch flow patronen benaderingen, en dit geeft aanleiding tot compact microarrays die eencellige uitgescheiden eiwitten en intracellulaire eiwitten kan detecteren. Een ander voordeel is het gebruik van een eenvoudige, instrument set-up. Dit is vooral belangrijk, omdat de meeste laboratoria en kleine bedrijven kunnen niet in staat zijn om toegang te krijgen tot microarray kernfaciliteiten. Dergelijke barcode antilichaam microarrays uitgevoerd met verbeterde doorvoer assay en kunnen worden gebruikt om zeer multiplex assays op enkele cellen terwijl het bereiken van een hoge gevoeligheid en specificiteit vergelijkbaar met die van conventionele sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA 8). Deze technologie heeft talrijke toepassingen gevonden in het opsporen van eiwitten uit glioblastoma 9-11, T-cellen 12 en circulerende tumorcellen 13. Als alternatief, barcode DNA microarrays alleen zijn gebruikt in de nauwkeurige positionering van neuronen en astrocyten voor nabootsening de in vivo assemblage van hersenweefsel 14.
Dit protocol alleen gericht op de experimentele stappen en opbouw blokken van de tweedimensionale (2D) streepjescode antilichaam microarray die potentiële toepassingen bij de detectie van biomarkers in vloeibare monsters heeft en in enkele cellen. De technologie is gebaseerd op adresseerbare enkelstrengig, eendimensionale (1-D) DNA microarray geconstrueerd met oligonucleotiden die orthogonaal ruimtelijk patroon op glassubstraten. De 1-D wordt gevormd als evenwijdige stromingskanalen worden toegepast in de stroom-patroonvormingsstap en dergelijk patroon weergegeven als discrete banden visueel vergelijkbaar 1-D Universal Product Code (UPC) barcodes. De constructie van een 2-D (n x m) antilichaam matrix - doet denken aan een 2-D Quick Response (QR) matrixcode - dient complexer patroon strategieën, maar maakt de immobilisatie van antilichamen met een hogere dichtheid 8,15. De fabricagevereist twee DNA patroonvormende stappen, de eerste patroon loodrecht op de tweede. De snijpunten van deze twee patronen vormen de n x m elementen van de array. Door strategische keuze van de reeksen van enkelstrengs DNA (ssDNA) gebruikt in flow-patroonvorming, is elk element in een bepaalde rij een specifiek adres toegewezen. Deze ruimtelijke referentie is noodzakelijk onderscheid tussen fluorescentiesignalen op de microarray dia. De ssDNA matrix wordt omgezet in een antilichaam matrix door de integratie van complementaire DNA-antilichaam conjugaten, waarbij een platform genaamd DNA gecodeerde bibliotheek antilichaam (DEAL 16).
Deze video protocol beschrijft de belangrijkste stappen in het creëren van nxm antilichaam-arrays, die onder meer het opstellen van polydimethylsiloxaan (PDMS) barcode mallen, stroom-patroonvorming ssDNA in twee oriëntaties, het voorbereiden van antilichaam-oligonucleotide DEAL conjugaten, en het omzetten van de 3 x 3 DNA-array in een 3x 3 antilichaam array.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Verschillende chemicaliën die worden gebruikt in dit protocol zijn irriterend en zijn gevaarlijk in geval van contact met de huid. Raadplegen veiligheidsinformatiebladen (VIB) en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen voordat dit protocol. Piranha oplossing die in stap (1.1.1) is zeer corrosief en worden bereid door het peroxide langzaam het zuur onder roeren. Handvat deze oplossing met uiterste voorzichtigheid in een zuurkast. Gebruik de juiste oogbescherming en zuurbestendige handschoenen. Trimethylchloorsilaan (TMCS) is een bijtende, ontvlambare chemische gebruikt in een optionele stap na (1.1.6). Verwerken deze chemische stof in een zuurkast.
Opmerking: Voer de barcode slide fabricage en kritische stroomwerkwijzen-patroon in een schone ruimte van verontreiniging door zwevende deeltjes te minimaliseren. Stofdeeltjes kunnen de havens en microkanalen van PDMS mallen blokkeren en interfereren met de stroom-patronen.
1. De bouw van de One-dimensiol DNA Barcode Slide
- Voorbereiding van de SU-8 meester voor de barcode stromingspatronen
NB: De tekeningen voor de loodrechte stromingspatronen (Figuur 1A-B) worden gemaakt met behulp van een computer-aided design (CAD) software. Deze patronen worden weergegeven op een chromen fotomasker. Transparante gebieden van het masker overeenkomen met de kenmerken van de SU-8 meester.- Schoon een siliciumwafel (100 mm diameter) in een grondig mengsel van 3 H 2 SO 4: 1 30% H 2 O 2 (piranha-oplossing) verhit tot 96 ° C. Was de wafer met gedeïoniseerd water en isopropylalcohol, gevolgd door drogen met stikstof blaaspistool.
- Giet ongeveer 4 ml SU-8 2025 fotolak van de wafel. Gebruik een programmeerbare spin coater om uniform over de fotoresist op de wafel voor 10 sec bij 500 tpm, vervolgens 30 seconden bij 3000 tpm. Hierdoor ontstaat een fotolaklaag met een dikte van ~ 25 urn. Geleidelijk toestaan spinnen te vertragen voor het stoppen - dit is bij Maintain een gelijkmatige bekleding op het oppervlak van de wafer.
- Bak de beklede wafer op een kookplaat gedurende 1 min bij 65 ° C, vervolgens gedurende 5 min bij 95 ° C. Deze stap maakt de coating te stollen. Koel af tot kamertemperatuur 5 min.
- Plaats het chroom masker (figuur 1C) van de fotoresist bekleding. Expose het masker mogelijkheden tot bijna-UV-licht (350-400 nm, belichtingsenergie 150-160 mJ / cm2) gedurende 20 sec.
Opmerking: Het ontwerp op de chromen masker bevat 20 kanalen, die elk zijn 20 micrometer breed met 50 um toonhoogte. De kanalen worden wikkeling van het ene uiteinde van de patroon naar de andere kant. Alles bij elkaar de 20 kanalen omvatten een rechthoek met een lengte van ~ 40 mm en een breedte van ~ 20 mm. Elk kanaal wordt geflankeerd door twee cirkelvormige elementen die overeenkomen met een inlaat en een uitlaat. In- en uitgangen zijn onderling uitwisselbaar. - Bak de belichte wafer op een verwarmingsplaat gedurende 5 minuten bij 95 ° C. Koel geleidelijk KT.
- Dompel de wafer in SU-8 developer met agitatiegedurende 5 min. Was de wafer met een kleine portie verse SU-8 ontwikkelaar, gevolgd door isopropylalcohol. Drogen van de wafel met een stikstof blaaspistool. Hard-bak de wafer op 200 ° C gedurende 30 min verwarmingsplaat en laat de wafer geleidelijk afkoelen tot kamertemperatuur.
Opmerking: Ontwikkeling kan worden verricht voor een langere tijd worden uitgevoerd als een witte film wordt waargenomen na het wassen in deze stap.
Optioneel: silaniseren de SU-8 meester door blootstelling aan damp trimethylchloorsilaan in een afgesloten petrischaal gedurende 10 min.
- Voorbereiding van de PDMS barcode mal
- Combineer 40,0 g siliconenelastomeer basis met 4,0 g verharder. Roer het prepolymeer mengsel krachtig gedurende 10 min. Ontgas gedurende 20 min onder vacuum.
Let op: Als algemene regel, gebruik maken van een 10: 1 (basis: verharder) massaverhouding. - Giet het prepolymeer in een petrischaal met een silicium wafer met de SU-8 meester van de barcode patroon. De hoogte van het PDMS mengsel moet ongeveer 7,5 mm of meer zijn. Ontgas het mengsel in de Petri schotel voor een tweede keer om eventuele resterende luchtbellen te verwijderen, daarna bakken het mengsel gedurende 1 uur bij 75 ° C om PDMS uitharden.
Opmerking: Het is belangrijk om voldoende dikte van de plaat PDMS handhaven op ~ 7,5 mm of hoger voorkomen toevoegen van te veel spanning op de PDMS-glas binding bij het inbrengen van pennen / buizen door gaten in de PDMS mal in stap (1.3.3.1) - Met behulp van een scalpel, zorgvuldig snijd rond het gebied van de PDMS plaat dat de barcode mal functies bevat en schil de plaat van de wafel.
- Maak de randen van de plaat met de gewenste vorm van de barcode PDMS mal bereiken. Punch 20 holes (1.0-mm diameter) door de mal met behulp van een biopsie punch met plunjer. Zorg ervoor dat de gaten zijn uitgelijnd met de cirkelvormige kenmerken van de barcode patroon. Deze gaten dienen als de in- en uitlaten.
- Combineer 40,0 g siliconenelastomeer basis met 4,0 g verharder. Roer het prepolymeer mengsel krachtig gedurende 10 min. Ontgas gedurende 20 min onder vacuum.
- Eén-dimensionale patronen van poly-L-lysine (PLL)
- Verwijder alle stof op het oppervlak van een poly-L-lysine beklede glazen dia via een stikstof- blaaspistool. Attach de PDMS mal om de schone glasplaatje. Ervoor zorgen dat de randen van de matrijs en de schuif zijn uitgelijnd.
- Bak gedurende 1,5 uur bij 75 ° C om de binding tussen de PDMS mal en de PLL-beklede slide versterken. Bereid ondertussen 20 stukken flexibele polyethyleen buis (3- tot 4-inch stukken met een binnendiameter van 0,5 mm en een buitendiameter van 1,5 mm).
Opmerking: Het aantal buisstukken overeen met het aantal inlaten in het PDMS barcode mal. De buis dient voor het koppelen van de kanalen op de barcode PDMS mal om een stikstofgas tank voorzien van een drukregelaar. - Aan één uiteinde van elk stuk buis, voeg een roestvrijstalen holle pen (1 mm diameter). Zuig steriel gefiltreerd poly-L-lysine oplossing door de pen, tot ten minste 1 cm van de slang wordt gevuld met de oplossing.
- Bevestig de pinnen (aangesloten op-oplossing gevulde buizen) aan de inlaten van de PDMS barcode mal (figuur 1E). Het andere uiteinde van de buizeneen druk geregelde stikstof tank set-up. Laat de oplossing door de mal met behulp van een drukgebied van 0,5-1 psi gedurende tenminste 6 uur.
Opmerking: Zie stap (1.3.3) voor alle stroom-patronen procedures.
- Bevestig de pinnen (aangesloten op-oplossing gevulde buizen) aan de inlaten van de PDMS barcode mal (figuur 1E). Het andere uiteinde van de buizeneen druk geregelde stikstof tank set-up. Laat de oplossing door de mal met behulp van een drukgebied van 0,5-1 psi gedurende tenminste 6 uur.
- Eén-dimensionale patronen van ssDNA 14
Opmerking: De fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die in latere stappen wordt bereid uit 137 mM NaCl, 10 mM Na 2 HPO 4 en 2 mM KH 2PO 4. De pH van de buffer is 7,4.- Bereid 2 mM bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3) oplossing in PBS. Bereid 300 uM oplossingen A, B en C ssDNA (5'-amine gemodificeerde, 80 nucleotiden) in PBS of ultrazuiver water.
Opmerking: Gebruik de BS3 oplossing binnen ongeveer 30 minuten na de bereiding omdat de N-hydroxysuccinimide ester gemakkelijk ondergaat hydrolyse. - Combineer 2,5 pl 300 pM A, B of C ssDNA met 2,5 pi 2 mM bis (sulfosuccinimidyl) suberaat in PBS voor elk kanaal. A, B en C DNA wordt aangeduid kanalen 1, 2 en 3, respectievelijk. Deze volgorde wordt ook toegepast op de resterende sets van 3 kanalen (Figuur 2A).
- Voer stap (1.3.3). Deze keer, zuig het 5-ul BS3 / DNA-oplossingen door middel van roestvrij stalen pennen en in de polyethyleen buis, dan stel de PDMS mal om de stikstof bron. Laat de BS3 / DNA oplossing door de barcode matrijs gedurende ongeveer 40 minuten of totdat de kanalen worden gevuld.
- De stroom stoppen zodra alle kanalen zijn gevuld, dan incubeer de BS3 / DNA-oplossing in de barcode bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Sta niet toe dat de oplossing te drogen. Bak de PDMS mal met bijgevoegde barcode glijbaan voor 1 uur bij 75 ° C.
Opmerking: Om de afstelling in de daaropvolgende doorstroming patroonvormende stappen te vergemakkelijken, kunnen de randen van het kanaal patroon op de barcode dia worden geschetst. Dit gebeurt door voorzichtig krassen glazen oppervlak met diamant Scribe uitlijning markers genereren aan de onderzijde van het glaasje. Alignment in latere fasen van het protocol kan worden gecontroleerd onder een microscoop. - Verwijder de PDMS mal van de barcode dia. Was de dia voorzichtig met 0,01% SDS keer en drie keer met ultrapuur water.
- Droog de barcode dia met behulp van een microscoop dia spinner. Bewaar de barcode dia in een schone 50 ml centrifugebuis voor later gebruik.
- Bereid 2 mM bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3) oplossing in PBS. Bereid 300 uM oplossingen A, B en C ssDNA (5'-amine gemodificeerde, 80 nucleotiden) in PBS of ultrazuiver water.
2. Validatie van de One-dimensionale patroon op de Barcode Slide
Opmerking: Deze valideringsprotocol kan ook worden aangepast voor toepassing bij het beoordelen van de kwaliteit van de daaropvolgende stroming patroonvorming stappen.
- Het blokkeren van de schuif
- Bereid 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS. Filter deze oplossing door een 0,45 pm spuitfilter voor gebruik. Met behulp van een gel-lading-punt toepassing 50 ui 1% BSA oplossing ene rand van de barcode dia.
- Incubeer de 1% BSA solution gedurende 1 uur bij KT.
- Incubatie met Cyanine 3 (Cy3) geconjugeerd complementair DNA
- Bereid een cocktail van A ', B' en C 'oligonucleotiden Cy3 geconjugeerd aan één uiteinde. De sequenties van A ', B' en C 'zijn complementair aan die van de A, B en C, respectievelijk. De werkconcentratie van de Cy3-DNA 0,05 uM in 0,1% BSA.
- Verwijder de BSA oplossing van de glijbaan door pipetteren, breng 30 pl van de cocktail DNA-oplossing op dezelfde rand van de schuif. Incubeer de Cy3-DNA cocktail op de glijbaan bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Voer deze incubatie stap in het donker naar de Cy3 groep te beschermen tegen fotobleken.
- Analyse van fluorescentie-intensiteit
- Pipet de Cy3-DNA-cocktail en was de glijbaan in 1% BSA, PBS, en tenslotte in verdunde PBS (1 part PBS met 50 delen ultrapuur water). Droog de dia met een spinner.
- Let op de fluorescentie (Figuur 2B) met een fluorescentiemicroscoop of een microarray scanner. Bij gebruik van een microarray scanner, de laser emissie golflengte 532 nm, de pixelgrootte van 5 micron, fotomultiplicatorbuis (PMT) versterking bij 450 en vermogen bij 15%.
3. Fabricage van de 2-dimensionale (3x3) DNA Array 14
- Voorbereiding van de PDMS barcode mal
- Voer procedure (1,1) naar een andere SU-8 meester te construeren, maar deze keer gebruik een chroommasker met een stromingspatroon loodrecht op die van het eerste ontwerp. Voeren procedure (1.2) om een nieuwe PDMS mal te bouwen met de loodrechte patroon.
- Tweedimensionale stroom patroonvorming van ssDNA
- Voor een 3 x 3 matrix, bereiden 150 uM voorraad oplossingen van A'-i, B'-ii, C'-iii, A'-iv, B'-v, C'-vi, A'-vii, B'-viii en C'-ix DNA in 3% BSA / PBS. Deze oligonucleotiden dienen als "overbruggende reeksen" (Figuur 2A). Combineer de oligonucleotide oplossingen (oplossingen 1-3) zodanig dat de werkende concentratie 50 pM per oligonucleotide. Gebruik de geleider verschaft in Tabel 1.
- Flow 3% BSA / PBS blockingbuffer in alle 20 kanalen voor 1 uur bij 0,5-1 psi.
- Flow Oplossingen 1, 2 en 3 in kanalen 1, 2 en 3, respectievelijk. Volg deze volgorde voor de volgende sets van 3 kanalen. Stroom wordt normaal gesproken in ongeveer 40 minuten. Incubeer de DNA oplossingen op kamertemperatuur gedurende 2 uur om het DNA te hybridiseren.
- Flow 3% BSA / PBS blockingbuffer in alle 20 kanalen voor 1 uur bij 0,5-1 psi tot gehybridiseerde DNA te verwijderen. Verwijder de PDMS plaat, en was de verkregen DNA microarray dia door dompelen het glaasje in 3% BSA / PBS eens en PBS twee keer, gevolgd door PBS verdund (1 deel PBS en 50 delen ultrapuur water). Dry de dia met behulp van een microscoop dia spinner.
- Voer een tweede validatie stap (figuur 2C), vergelijkbaar met die in hoofdstuk 2. Gebruik oligonucleotiden i 'te ix' die Cy3-geconjugeerd. Bewaar de 3 x 3 matrix dia in een 50 ml centrifugebuis voor later gebruik.
Opmerking: Het DNA microarray kan bij kamertemperatuur worden bewaard in een exsiccator maanden.
4. Omzetting van de 3 x 3 DNA Array in een antilichaam Array
- Bereiding van antilichaam-oligonucleotide (DEAL) conjugaten
- Bereid oplossingen van 200 mM succinimidyl-4-formylbenzoaat (S-4FB) en 40 mM succinimidyl-6-hydrazinonicotinamide (HYNIC-S) in watervrij N, N-dimethylformamide (DMF).
- Bereid tot 7 afzonderlijke oplossingen van invangantilichamen (1 mg / ml) in PBS.
Opmerking: Als het antilichaam voorraad oplossingen bevatten natriumazide bacteriostat, voeren buffer uitwisseling met PBS gebruik makend van spin ontzouten columns met 7 kDa moleculair gewicht cut-off (MWCO). - Maak afzonderlijke 400 pM oplossingen van i, ii, iii, iv, v, vi, vii en DNA. Wijs elke vangantilichaam één oligonucleotidensequentie. Combineer 40 pi van 400 pM DNA met 12,25 pi DMF in microcentrifugebuisjes en spin down om grondig te mengen.
- Aan elk DNA / DMF oplossing, voeg 2,3 pl 200 mM S-4FB in DMF. Voor elke 100 ug invangantilichaam, voeg 2,25 gl 40 mM S-HYNIC in DMF.
- Incubeer de antilichaam / S-HYNIC en DNA / S-4FB oplossingen voor 4 uur bij KT.
- Ter voorbereiding van het antilichaam-DNA koppelingsreactie Bereid nieuwe spin ontzouten kolommen (een voor elke DNA-oplossing en een voor elk antilichaam) door wassen met citraatbuffer bij pH 6.
- Na 4 uur incubatie uitvoeren buffer ruil voor elk antilichaam / S-HYNIC en DNA / S-4FB oplossing. Combineer de S-4FB geconjugeerd
- Incubeer het reactiemengsel O / N bij 4 ° C.
- Zuivering van antilichaam-oligonucleotide (DEAL) conjugaten
Opmerking: Om het antilichaam-oligonucleotide conjugaten zuiveren, voeren snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) op een standaard FPLC systeem uitgerust met een GL kolom Superose 6 10/300.- Stel de golflengte van de UV-detector van het FPLC systeem 280 nm. Gebruik isocratische stroming van PBS (pH 7,4) bij 0,3 ml / min aan het antilichaam-oligonucleotide conjugaten te scheiden van de overmaat S-4FB-DNA.
- Verzamel de fracties die het conjugaat en concentreer de fracties met een volume van 150 ui middels rotatie filters met een 10 kDa MWCO.
- Tweedimensionale patroonvorming van antilichamen
- Bereid een andere PDMS mal met microkamers of micro-putten onsing fabricage procedures in stap (1,2). De PDMS mal kan microliter bevatten nanoliter putten voor immunoassays.
Opmerking: Voor algemene biomarker detectie in vloeibare monsters, wordt een PDMS mal met meerdere putten gekruist met de array glijbaan. De kenmerken van de PDMS mal afhankelijk van het onderzochte systeem. Zo kan de detectie van eiwitten van eencellige experimenten worden uitgevoerd met een PDMS mal bevattende microkamers met 0,15-nl volumes. - (Optioneel) Onderwerp de PDMS mal om plasma reiniging (18 W) 1,5 min om zijn patroon oppervlak hydrofiel te maken. Vóór plasmareiniging, met plakband alle andere oppervlakken die direct worden gebonden aan de 3 x 3 matrix glijblok.
Opmerking: Stap (4.3.2) is optioneel, maar wordt gewoonlijk uitgevoerd wanneer de PDMS mal bestemd voor gebruik bij één cel experimenten. - Mate de PDMS mal met de 3 x 3 serie dia, blokkeren dan de dia met 1% BSA in PBS. Incubeer gedurende 1 uur bij KT. Meanwhile, bereiden een cocktail (200 ul eindvolume) antilichaam-oligonucleotide conjugaten. De werkconcentratie van elk conjugaat 10 ug / ml in 1% BSA / PBS.
- Voeg de antilichaam-oligonucleotide cocktail, vervolgens incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C om de rest van de oligonucleotide conjugaten te hybridiseren met specifieke vlekken op de 3 x 3 arrays, waardoor het DNA-matrix omzetten van een antilichaam array.
- Herhaal stap (3.2.4) te reinigen en droog de glijbaan. De hoogste gevoeligheid kan worden bereikt als het antilichaam matrix direct wordt gebruikt. Langdurige opslag kan leiden tot verlies van gevoeligheid.
- Bereid een andere PDMS mal met microkamers of micro-putten onsing fabricage procedures in stap (1,2). De PDMS mal kan microliter bevatten nanoliter putten voor immunoassays.
- Detectie van eiwitten
- Reconstrueren recombinante eiwitten of bereiden een gefilterde cel monster.
- Mate de microarray met een op maat ontworpen chip en blokkeren het oppervlak met 3% BSA in PBS gedurende 1 uur. Verwijder vervolgens de BSA oplossing en monsters passen en incubeer 2 uur.
- Afwassen van de monsters met behulp 3% BSA in PBS driemaal, eend voeg vervolgens de detectie van antilichamen in een concentratie die door de product-datasheet. Incubeer 2 uur.
- Afwassen detectie antilichamen met 3% BSA in PBS driemaal, en voeg vervolgens Cyanine 5 (Cy5) -streptavidin bij 1 ug / ml, gevolgd door incubatie gedurende 1 uur.
- Herhaal stap (3.2.4) te reinigen en droog de glijbaan voor het scannen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ontwerpen voor de PDMS mallen (figuur 1A-1B) werden getekend met behulp van een CAD-programma (AutoCAD). Twee ontwerpen getoond functie kanalen voor doorstroming patronen, een horizontale en een verticale. De links en rechts delen van elk ontwerp zijn symmetrisch; een van hen zou kunnen zijn inlaten of uitlaten. Elk van 20 kanalen wikkelen van één uiteinde tot aan het andere uiteinde. Elk ontwerp wordt gedrukt op een chromen fotomasker (figuur 1C). De gefabriceerde SU-8 meester op een wafel wordt getoond in figuur 1D. Om de stroom-patroonvorming van PLL of DNA te vergemakkelijken, werd de PDMS mal gekoppeld aan een stikstofgasstroom opstelling (figuur 1E).
Er zijn drie stroom-patroonvorming stappen die in dit protocol. De eerste stap immobiliseert PLL op het glassubstraat, terwijl de opeenvolgende stappen beide oligonucleotide oplossingen introduceren. In Tabel 1, de oligonucleotide composities van Solutions 1-3 gegeven. De werkconcentratie van elke oligonucleotide 50 pM en het totale volume van elke oplossing 39 pi. Deze oplossingen worden bereid door 13 pi van elke oligonucleotide voorraadoplossing (150 uM).
Het patroon van DNA microarray-eenheden zijn repetitieve en grenzend aan de overkant van de hele glasplaatje. Voor 3 x 3 microarrays, de maximale dichtheid is ongeveer 400.000 spots op een glasplaatje. Side-by-side vergelijking met commerciële DNA microarray blijkt dat onze technologie ongeveer 5 maal gevoeliger wanneer binding met Cy3 gelabeld complementair DNA. Het patroon DNA's zijn relatief uniform met ~ 5% variatie over meerdere herhalingen. Die functies beloven de hoge kwantificering vermogen van onze technologie bij het meten van eiwitgehalten van biologische monsters. Bovendien, de orthogonaliteit van DNA in combinatie met het stroomkanaal ontwerp bieden flexibility van patroonvorming in verschillende geometrieën (figuur 2D).
Na het omzetten van de DNA array naar een antilichaam matrix door middel van hybridisatie met DNA-antilichaamconjugaten (figuur 3B), wordt het antilichaam panel resulterende gebruikt gemultiplexte detectie, voornamelijk door sandwich ELISA platform zoals getoond in figuur 3C. In sandwich ELISA, gebiotinyleerd detectie (secundaire) antilichamen aan de gevangen eiwitten en daaropvolgende labeling met fluorofoor geconjugeerd streptavidine maakt fluorescentie gebaseerde detectie (Figuur 3C-E). Detectie van eiwitten shows <10% variatie van het ene uiteinde naar het andere uiteinde van het glaasje (Figuur 3D). Met de 3 x 3 matrix, kunnen we detecteren tot 7 proteïnen, terwijl het toewijzen van een arrayelement als referentie (Cy3 gemerkt) en een ander element als negatieve controle. Bijvoorbeeld, in een eencellige experiment uitgevoerdtumor studies, de eiwitten interleukine-6 (IL-6), matrix metallopeptidase 9 (MMP9), hepatocyt groeifactor (HGF), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), interleukine-8 (IL-8) en macrofaag migratie-remmende factor (MIF) vanaf een enkele cel kunnen tegelijkertijd worden gedetecteerd (Figuur 3E).
We gekalibreerd het systeem ook gebruikt recombinante proteïnen in verschillende concentraties. In Figuur 3F, kalibratiecurven voor recombinante eiwitten interferon-γ (IFN-γ), tumor necrosis factor α (TNF α), interleukine-13 (IL-13), tumornecrosefactor β (TNF β), granzyme B, interleukine -4 (IL-4) en interleukine-8 (IL-8) getoond. De detectiegevoeligheid is zeer vergelijkbaar met die van conventionele sandwich ELISA op putjesplaten ook bij hogere belasting van DNA en mogelijk antilichamen op het substraat.
De barcode Antibody microarray kan worden gebruikt om biomarkers te detecteren in vloeibare monsters en in enkele cellen. Aangezien single-cell analyse niet de focus van dit protocol, we gewoon voorbeeld van de toepassing van de 3 x 3 antilichaam microarray bij de detectie van cytokinen. Door middel van antilichaam-oppervlaktemerker interacties cluster van differentiatie 8 (CD8) -positieve cellen werden gevangen op een van de microarray elementen (figuur 3G, een PDMS chip aan de bovenkant) en de overige elementen werden gebruikt om uitgescheiden cytokines detecteren ( Figuur 3H). Met deze mobiele capture methode "cel arrays" worden gevormd. Deze array capture techniek maakt het ook mogelijk om de controle over het aantal cellen blootgesteld aan elke ELISA experiment. De cellen werden fysiek geïsoleerd in de microkamers zodat de gedetecteerde eiwitten betrekking op specifieke enkele cellen. In figuur 3H, wordt getoond dat elk microkamer voorzien van 16 microarray elementen om inkapseling van waarborgeneen volledige 3 x 3 microarray set.
Figuur 1. Ontwerp en vervaardiging van PDMS barcode matrijzen voor stroomgebaseerde DNA patroon. Paneel (A) toont de AutoCAD tekeningen horizontale en verticale ééndimensionale barcode patronen. Paneel (B) toont de gesuperponeerde horizontale en verticale barcode patronen (A). Groene vakjes omsluiten gebieden patroon met discrete 3 x 3 arrays. (C) Chrome masker voor het vervaardigen van de SU-8 meester. (D) SU-8 meester gefabriceerd op een silicium wafer. (E) Set-up voor stroming patronen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Bouw en validatie van een 3 x 3 DNA-array. Dit cijfer is gewijzigd van "het kwantificeren van cel-cel interactie functies met toepassingen in glioblastoma multiforme kankercellen," door Wang, J. et al., 2012, Nano Lett 12 . Copyright 2012 door de American Chemical Society. Aangepast met toestemming. (A) Regeling voor het DNA stappen stroom-patronen. (B) Fluorescentie intensiteitprofiel van 20 kanalen in een geselecteerd gebied (gevolgd door een verticale lijn) van de 1D barcode. Cy3-geconjugeerde oligonucleotiden werden gehybridiseerd met de DNA-arrays voor validatie. (C) Fluorescentie intensiteit profiel van arrays gevalideerd met Cy3-geconjugeerd DNA na het voltooien van de tweede DNA-patroon stap. (D) Alternatieve fluorescerende patronen uit verschillende flow-patronen strategieën. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Toepassingen van de 3 x 3 microarray. (A) Schema voor de synthese van antilichaam-DEAL oligonucleotide conjugaten. (B) Regeling voor de omzetting van het DNA-array naar een antilichaam-array door middel van hybridisatie met antilichaam-oligonucleotide conjugaten. (C) Regeling voor het gebruik van de 3 x 3 microarray in een sandwich ELISA platform. Dit cijfer is gewijzigd van "het kwantificeren van cel-cel interactie functies met toepassingen in glioblastoma multiforme kankercellen," door Wang, J. et al., 2012, Nano Lett 12. Auteursrecht 2012 door de American Chemical Society. Aangepast met toestemming. Panel (D) toont een fluorescentie uitlezing die onder een Cy5 kanaal. Dit komt overeen met een sandwich ELISA experiment 6 eiwitten gedetecteerd. Panel (E) is een ingezoomde profiel van een 3 x 3 matrix uitlezing onder Cy3 en Cy5-kanalen. Panel (F) toont de sandwich ELISA kalibratiecurven voor recombinante eiwitten. Panel (G) toont een "cel matrix" gevormd door het vastleggen cellen door binding met antilichamen op de array. Paneel (H) toont de detectie resultaat bovenop met microkamers in een microchip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing | Oligonucleotide Samenstelling | A'-i, B'-ii, C'-iii |
| 2 | A'-iv, B'-v, C'-vi |
| 3 | A'-vii, B'-viii, C'-ix |
Tabel 1. Samenstelling van de oplossingen 1-3 voor DNA Flow Patterning.
| Verankering sequenties | |
| EEN | ATCCTGGAGCTAAGTCCGTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATCCTGGAGCTAAGTCCGTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA |
| B | GCCTCATTGAATCATGCCTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GCCTCATTGAATCATGCCTA- |
| AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA | |
| C | GCACTCGTCTACTATCGCTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GCACTCGTCTACTATCGCTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA |
| Overbruggen sequenties | |
| A'-i | TACGGACTTAGCTCCAGGAT-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATGGTCGAGATGTCAGAGTA |
| B'-ii | TAGGCATGATTCAATGAGGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATGTGAAGTGGCAGTATCTA |
| C'-iii | TAGCGATAGTAGACGAGTGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATCAGGTAAGGTTCACGGTA |
| A'-iv | TACGGACTTAGCTCCAGGAT-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GAGTAGCCTTCCCGAGCATT |
| B'-v | TAGGCATGATTCAATGAGGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATTGACCAAACTGCGGTGCG |
| C'-vi | TAGCGATAGTAGACGAGTGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-TGCCCTATTGTTGCGTCGGA |
| A'-vii | TACGGACTTAGCTCCAGGAT-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-TCTTCTAGTTGTCGAGCAGG |
| B'-viii | TAGGCATGATTCAATGAGGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-TAATCTAATTCTGGTCGCGG |
| C'-ix | TAGCGATAGTAGACGAGTGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GTGATT AAGTCTGCTTCGGC |
| Cy3-geconjugeerde oligonucleotiden voor de validatie | |
| EEN' | TACGGACTTAGCTCCAGGAT |
| B ' | TAGGCATGATTCAATGAGGC |
| C ' | TAGCGATAGTAGACGAGTGC |
| ik' | TACTCTGACATCTCGACCAT |
| ii ' | TAGATACTGCCACTTCACAT |
| iii ' | TACCGTGAACCTTACCTGAT |
| iv ' | AATGCTGGGGAAGGCTACTC |
| v ' | CGCACCGCAGTTTGGTCAAT |
| vi ' | TCCGACGCAACAATAGGGCA |
| vii ' | CCTGCTCGACAACTAGAAGA |
| viii ' | CCGCGACCAGAATTAGATTA |
| ix ' | GCCGAAGCAGACTTAATCAC |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stromingspatroon ontwerp is de eerste cruciale stap in het vervaardigen van de 2-D microarray. Twee overlappende DNA patronen op een glassubstraat te genereren, moet het kanaal kenmerken van het eerste ontwerp loodrecht op die van de tweede (Figuur 1A-B) zijn. De ontwerpen ook rekening met de downstream-toepassingen van de microarray. Bij enkele cel analyse wordt de microarray gebruikt om eiwitten van enkelvoudige cellen ingesloten in microkamers detecteren daarom kanaal afmetingen verenigbaar zijn met de microkamers die aansluiten bij de 2-D arrays gemaakt. Elk ontwerp wordt weergegeven op een fotomasker en standaard fotolithografische technieken worden gebruikt om het kanaal functies van SU-8 fabriceren op een silicium wafer (figuur 1C-D). Dit dient als de meester voor het vormen PDMS. Nadat de mal is vervaardigd, wordt gebonden aan een PLL-beklede glijbaan en vervolgens gekoppeld met een stikstofgasstroom opstelling (figuur 1E). De set-up die wegebruik is eenvoudig en heeft het voordeel dat het gemakkelijk opgenomen in elk laboratorium met een geregelde druk stikstofgas bron. We maken gebruik van een samenstel van meerdere goedkope 3-weg kleppen verbonden met een stikstofgas tank. De luchtstroom patroon moet worden gehandhaafd bij lage drukken (0,5-1 psi) aan de delaminatie van het glaasje uit de matrijs te vermijden. Lekken in de PDMS mal kan de integriteit van de patronen compromitteren.
De DNA stroom patronen stappen in dit protocol te gebruiken ssDNA met zorgvuldig geselecteerde orthogonale sequenties (Figuur 2A). Vóór stroom-patroon, dient de unieke sequenties van deze oligonucleotiden worden getest op de afwezigheid van overspraak. Een eenvoudige test voor cross-talk wordt gedaan door de validatieprocedure introduceren we in ons protocol (stap 2) modificeren. In plaats van een cocktail van Cy3-gelabeld complementair DNA, wordt slechts één type complementaire sequentie tegelijk gebruiken voor een geselecteerd gebied van de slede waarop meerdereDNA-sequenties worden geïmmobiliseerd. Aangezien DNA overspraak, slechts een streep (voor 1-D DNA array) of een vlek (voor 2-D DNA-array) een fluorescerende onder een Cy3 filter. Voorbeelden van goed gevalideerde orthogonale sequenties kunnen worden gevonden in de tabel van materialen en apparatuur. De eerste DNA-patroon stap introduceert drie soorten "anchor" oligonucleotiden. Deze 80-nt sequenties bestaan uit twee 20-mer poly-A regio die afwisselend twee unieke 20-mer sequenties. De 5'-amine modificatie volgende anker sequenties noodzakelijk amine tot amine verknoping 17 met PLL gemedieerd door BS3. De tweede DNA patroonvormingsstap geen verknopingsmiddel vereist. Deze stap introduceert "bridging" oligonucleotiden die deels hybridiseren met het anker sequenties. Elke 60-nt overbruggende reeks bestaat uit een 20-meer regio complementair aan een anker sequentie, een 20-mer poly-A afstandhouder, en een unieke 20-meer sequentie. Validatie van de DNA-arrays (Figure 2B-C) wordt uitgevoerd na elke DNA stroomsnelheid patroonvormingsstap de kwaliteit van het patroonvormende stappen beoordelen en zonder kruisbesmetting 14 waarborgen. Dit wordt uitgevoerd door het introduceren van Cy3-geconjugeerd oligonucleotide probes die hybridiseren met de DNA-patronen. Met de parameters gespecificeerd in stap (2.3.2) voor het analyseren van fluorescentie-intensiteit zou de DNA-patronen vertonen fluorescentie intensiteiten van ten minste 40.000 au om de gevoeligheid van de stroomafwaartse immuuntesten te maximaliseren met behulp van de microarray. Strategisch gebruik van verschillende Cy3-DNA sets tijdens de validatie ontstaat alternatieve patronen (figuur 2D), waardoor de flexibiliteit van het DNA patroonvorming demonstreren stap 8. Niet-uniforme patronen kunnen ontstaan door lekkage of mechanische obstructies (zoals stof) te bereiken aangetroffen in de stroom-patroon stappen.
De bereiding van antilichaam-oligonucleotide DEAL conjugaten is een cruciale stap in this protocol. De keuze van antilichamen wordt bepaald door het biologische systeem onder studie. De oligonucleotiden die geconjugeerd moet sequenties die complementair zijn aan die verankerd op de DNA array. Voorraadoplossingen van de S-4FB en S-HYNIC linkers moet vers worden bereid en bewaard vanaf vochtigheid hydrolyse te voorkomen. De incubatietijden in onze conjugatie protocol zijn lang genoeg om de gewenste functionaliteiten op de antilichamen en DNA introduceren. De laatste koppelingsreactie wordt alleen gestopt door het verwijderen van de ongereageerde S-4FB-geconjugeerde oligonucleotiden via FPLC. Zo FPLC zuivering moet worden direct na het voltooien van de vervoeging uitgevoerd. Bij het uitvoeren FPLC de in ons protocol beschreven stelsel lagere stroomsnelheden (0,2-0,25 ml / min) kan ook worden gebruikt om de resolutie te verbeteren. De conjugaten worden geëlueerd als een brede piek (elutievolume van ongeveer 9-15 ml) die voor een smallere en hogere DNA-piek (17-20 ml elutievolume) verschijnt. We raden niet aan het opslaan van oplossingenconjugaten met overmaat S-4FB-DNA, omdat deze kan leiden tot verlies van antigeenbindingsplaatsen in het antilichaam bij conjugatie met een overmaat DNA gefunctionaliseerd. De gevoeligheid, specificiteit en reproduceerbaarheid van sandwich ELISA gebruikt DEAL conjugaten zijn aangetoond in eerdere studies. 8,9,11,12,16 Om de kwaliteit van antilichaam-DNA conjugaten te evalueren, kunnen de conjugaten worden geïncubeerd op DNA arrays het genereren antilichaam array, die vervolgens wordt gebruikt in sandwich ELISA experimenten om kalibratiecurven voor eiwitdetectie (figuur 3F) genereren. Om deze calibratie curves genereren, kunnen recombinante eiwitten voorzien in een conventionele sandwich ELISA kit gebruikt. Het gebruik van hoogwaardige conjugaten moeten leiden tot lineaire reeksen en lagere detectiegrenzen vergelijkbaar met die van de kit. Als voorbeeld, de ondergrenzen van INFy en TNFa voor sandwich ELISA op onze antilichaam array (figuur 3F) zijn ~ 50-100 pg / ml, en zijn consistent met de lineaire detectiebereik van ~ 15-1,000 pg / ml aangegeven in de product datasheet van de conventionele sandwich ELISA-kit. Slecht signaal uitlezing verkregen downstream sandwich ELISA experimenten kan worden toegeschreven aan de lage kwaliteit van DNA array, de inmenging van een overmaat DNA in het conjugaat oplossingen, of als alternatief, incomplete conjugatie van ssDNAs met antilichamen.
Grote zorgen voor het uitvoeren van sandwich-ELISA op het antilichaam-array onder overspraak tussen reagentia en of het signaal geeft de echte biologische gebeurtenissen. De orthogonale DNA's die we gebruiken in dit protocol zijn grondig gevalideerd tot minder dan 0,1% overspraak te hebben. Derhalve geen overspraak waargenomen bij het immunoassay stadium vooral van de antilichamen en ELISA reagentia. Testen voor cross-talk tussen antilichamen in de array moet voorafgaand aan het uitvoeren van tests op echte monsters worden uitgevoerd. Zodra een antilichaam panel geconstrueerd dienen sommige sandwich ELISA controle-experimenten zijn performed de volgende voorwaarden: 1. Zonder antigenen, 2. Zonder detectie antilichamen en 3. Opsporing antilichamen en alleen etikettering reagentia. Als overspraak waargenomen in de immunoassay fase moet het antilichaamparen en / of ELISA reagentia worden vervangen. Opgemerkt wordt dat het gebruik van commercieel verkrijgbare antilichamen conventionele ELISA kits geen toepasbaarheid garanderen dat de array-gebaseerde sandwich ELISA-techniek.
De voordelen van deze technologie zijn onder goedkope productie, miniatuur grootte en de flexibiliteit van het ontwerp. Onze fabricage protocol geen microarray spotter die niet beschikbaar zijn voor veel gebruikers van antilichaam-arrays kunnen zijn nodig. De stroom patroonvorming opstelling kan eenvoudig worden geassembleerd in eenvoudige laboratorium. Voor laboratoria die niet zijn uitgerust met instrumenten voor fotolithografie, kan de CAD-ontwerpen die we bieden in ons protocol worden toegezonden aan bedrijven die microfabricage diensten aan te bieden. Downsizing de conventionele microarray inde compacte matrix gefabriceerd met ons protocol maakt compatibiliteit met microchips gebruikt eencellige experimenten. Ons protocol kenmerkt de productie van de matrix als ssDNA matrix voordat omzetting naar een antilichaam array. Voorlopige patronen met ssDNAs heeft een aantal voordelen. Ten eerste ssDNAs zijn chemisch stabieler in vergelijking met antilichamen, waardoor de ssDNA-patroon slides in een exsiccator bewaard gedurende ten minste 6 maanden zonder significante afbraak 8,16. Ten tweede, onze aanpak biedt een eindgebruiker de flexibiliteit om de testen nodig de optie door eenvoudig mengen van de selectieve conjugaten in een oplossing zonder wijziging van de microarray; Integendeel, conventionele eiwit / antilichaam arrays zijn vooraf ontworpen en op een substraat bevestigd, zodat de verandering van assays zou het patroneren / drukken van eiwitten / antistoffen vanaf het begin vereist. Representatieve studies illustreren het gebruik van de barcode antilichaam microarray in de high-throughput detection meerdere signaaleiwitten van enkelvoudige cellen. Door het variëren van het stromingspatroon ontwerpen en / of oligonucleotide patroonvorming oplossingen gebruikt, kan een veelheid van matrix indelingen worden onderzocht. Als voorbeeld van deze toepassing, kan functionele eiwitten uit enkele cellen bestudeerd. De chip voor single-cell analyse omvat maar liefst ~ 8700 microkamers, elk afgestemd op een volledige 3 x 3 antilichaam array (Figuur 3H). Zoals een set-up zorgt voor een high-throughput detectie. Proteïnen gesecreteerd door cellen gekweekt in microkamers kan worden gedetecteerd door deze array. De veelzijdige microarray ontwerp staat ook voor multiplex detectie van eiwitten uit het serum, cellysaten, en enkele cellen na het combineren van de microarray met andere generieke componenten 8,15. Naast eiwitdetectie de 3 x 3 matrix antilichaam is ook nuttig bij het vastleggen cellen (Figuur 3G).
Het belangrijkste nadeel van deze benadering is de toegevoegde complexity vergelijking met de vervaardiging van conventionele microarrays. Strategieën voor patronen en voor reeks ontwerp moet zorgvuldig worden opgevat, terwijl rekening houdend met de specifieke toepassingen van de gefabriceerde array. Deze aanpak vereist ook een aantal kritische stappen met inbegrip van procedures en tests validatie voor cross-talk. De 3 x 3 matrix geconstrueerd met ons protocol is beperkt tot het detecteren van 7 eiwitten tegelijk. Toch kan deze grens worden overtroffen door het creëren van grote arrays. De hier aanbevolen protocol is niet beperkt tot de vervaardiging van 3 x 3 microarrays. We zijn erin geslaagd om met succes te fabriceren 5 x 5 microarrays en andere dimensies van de array-elementen zijn. In principe kunnen andere n x m arrays worden vervaardigd met behulp van vergelijkbare technieken zolang het oligonucleotide sets gebruikt bij het creëren van de voorlopige DNA-gevormde array orthogonale overspraak tussen arrayelementen vermijden. De oprichting van geëxpandeerd arrays wordt bereikt door stroom patterning n soorten ssDNA ankers voor de eerste DNA patroonvormingsstap, gevolgd door n x m overbruggen ssDNA sequenties voor de tweede patroonvormingsstap. Bijvoorbeeld, een 5 x 5 array te maken, kan anker sequenties A tot E worden, terwijl sequenties overbruggen A'-i-E'XXV worden gebruikt. Om de stroom patroonvorming proces te automatiseren, heeft een robotica platform ontwikkeld 18, hoewel dit slechts heeft gebruikt één DNA stroom patroonvorming stap. In principe kan hetzelfde platform worden uitgebreid tot de tweede stap loodrechte stroming patroonvorming, terwijl het schakelen tussen twee stappen handmatig nodig afpellen van het eerste PDMS matrijs na de eerste patroonvormingsstap, gevolgd door wassen en drogen van de schuif (deze stap zou duurt ongeveer 10 minuten), vóór de paring de dia met een andere PDMS mal om de loodrecht tweede patroonvormingsstap vergemakkelijken.
We hebben gedetailleerde procedures besproken voor het vervaardigen van een NxM scala patroonmet antilichamen met een hoge dichtheid, die een grote belofte voor toekomstige toepassingen in proteomics studies en cell signaling houdt. De hier gepresenteerde protocol kan ook dienen als leidraad voor de constructie van uitgebreidere DNA / antilichaam-arrays voor andere doeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see Table 2. | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (1.0 mm diameter) | Ted Pella, Inc. | 15110-10 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
References
- Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
- Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
- Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
- Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
- Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
- Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
- Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
- Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
- Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
- Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
- Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499 (2014).
- Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
- Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
- Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
- Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
- Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301 (2011).
